Name: Het bepalen van de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer hoe je de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën bepaalt op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen. Deze methode minimaliseert dierproeven bij de veiligheidsbeoordeling van oogheelkundige producten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs ontvingen geen financiering voor dit werk.

1. Kweek van pHCECs en iHCECs
<ol><li>Kweek de pHCECs en iHCECs in humaan oculair epitheelmedium (HOEM) met de volgende supplementen: 6 mM L-glutamine, 0,002% celmediasupplement O (materiaaltabel), 1,0 μM epinefrine, 0,4% celmediasupplement P (materiaaltabel), 5 μg/ml rh insuline, 5 μg/ml apo-transferrine en 100 ng/ml hydrocortisonhemisuccinaat in collageen-1 gecoate cultuurkolven (18 ml in een 75 cm2 kweekkolf).</li>
	<li>Verander het medium in de kolven om de 2-3 dagen door het medium te verwijderen nadat de cellen zijn gegroeid tot ~ 80% samenvloeiing. Voeg dissociatieoplossing zonder fenolrood toe en incubeer de kolf bij 37 °C totdat de cellen volledig zijn losgemaakt. Neutraliseer de dissociatieoplossing met DMEM/F12 met serum en centrifugeer de cellen vervolgens op 500 × g. Verwijder het bovennatuurlijke medium en resuspensie van de cellen in het HOEM-medium.</li>
</ol>2. Bepaling van de celgrootte met behulp van confocale microscopie
<ol><li>Zaai zowel pHCEC's als iHCECs op met collageen bedekte petrischalen met glazen bodembedekkingen in een concentratie van 1 × 105 met 1 ml HOEM. Kweek pHCECs en iHCECs, één set culturen gedurende 24 uur en een andere set culturen gedurende 48 uur, in een incubator van 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Na de incubatietijd kleurt u de cellen met 500 μL annexinekleuringsbufferoplossing die calceïne (4 μM), ethidiumhomodimeer-1 (8 μM) en annexine V (5 μL in 500 μL buffer-Alexa Fluor 647-conjugaat) bevat gedurende 20 minuten bij 37 °C. Na het kleuren van de cellen, stel de microscoop in voor het vastleggen van de excitatie/ emissiegolflengten van 488/515 nm voor calceïne-AM, 543/600 nm voor ethidium homodimeer-1 en 633/665 nm voor annexine V met behulp van een confocale laserscanmicroscoop.</li>
	<li>Verkrijg de afbeeldingen en neem Z-stacks om de celgrootte in drie dimensies te beoordelen.<ol><li>Om de tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) beelden te verkrijgen, zoekt u het gebied om af te beelden met een apochromaat 40x/1.2 waterobjectief. Met de Argon (488) (eerste scan), HeNe1 (543) (tweede scan) en HeNe2 (633) (derde scan) lasers, scant u in drie afzonderlijke kanalen met behulp van de bundelsplitters, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis en NFT 545 LP560, LP505.</li>
		<li>Gebruik sequentiële scans met meerdere sporen om overspraak te verminderen. OPMERKING: LP505 wordt gebruikt voor kanaal 2 met de 488-laser om de emissie van de calceïnekleurstof vast te leggen. LP560 wordt gebruikt in kanaal 3 met de 543 laser om de emissie van het ethidicum homodimeer 1 vast te leggen. NFT 635 wordt gebruikt met de 633-laser om de emissie van de annexine V vast te leggen. Het doel van de HFT is om de excitatie en het emissielicht te scheiden. NFT splitst licht door licht < opgegeven golflengte naar een apart kanaal te reflecteren, terwijl licht een bepaalde golflengte > naar een tweede kanaal. LP-filters blokkeren kortere golflengten dan de opgegeven golflengte en laten de langere golflengten door.</li>
		<li>Als u een afbeelding in 3D wilt maken, stelt u de confocale in op Z-stack en scant u ten minste 20 frames.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Blootstelling van cellen aan UV-straling
<ol><li>Zaai de cellen op 5 × 104/ml HOEM in elk putje van een 24-well collageen-1 gecoate kweekplaat en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 uur. Verminder na de incubatietijd het volume van het medium in de putten tot 300 μL. Stel vervolgens de cellen bloot aan UV-straling (zowel UVA bij 6,48 W/m 2 als UVB bij 1,82 W/m2 omdat zowel UVA- als UVB-buizen tegelijkertijd in de couveuse worden ingeschakeld) in een 37 °C-incubator gedurende 5 en 20 minuten in afzonderlijke experimenten.</li>
	<li>Voeg na de UV-straling 200 μL verse HOEM toe aan elke put en incubeer gedurende 20 uur bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Verzamel na incubatie het celsupernatant in elke put en breng het over in steriele polypropyleenbuizen van 2 ml. Invriezen bij -80 °C. Om de cytokineniveaus te bepalen die vrijkomen door de pHCECs en iHCECs na UV-blootstelling, gebruikt u een multiplex cytokine-assay en volgt u de instructies van de kit om de volgende vier cytokines te kwantificeren: IL-6, IL-8, IL-1β en TNF-α.</li>
	<li>Voeg metabolisch testreagens toe aan de cellen in de putten.</li>
	<li>Bereid 10% metabolisch assay-reagens in DMEM/F12. Vervang het kweekmedium in elk putje door 1 ml van de 10% metabole testoplossing en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 4 uur.</li>
	<li>Meet de fluorescentie van elke oplossing met behulp van een fluorescentieplaatlezer op 530/590 nm excitatie/emissiegolflengten.</li>
</ol>4. Blootstelling van cellen aan chemische toxines
<ol><li>Zaadcellen bij 5 × 104/ml HOEM in elk putje van een 24-well collageen-1 gecoate kweekplaat en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 uur. Verwijder na de incubatietijd het medium en stel de cellen gedurende 5 en 15 minuten bloot aan 1 ml chemische toxines (BAK 0,001%, H 2 O2 0,01% en SDS 0,0025% in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)).</li>
	<li>Verwijder na blootstelling aan de chemische toxines de gifstoffen uit de putten, spoel af met 1 ml PBS en voeg 1 ml HOEM toe aan elke put. Voer na 20 uur incubatie een metabole test uit door het medium te vervangen door 1 ml van een 10% metabole testoplossing en gedurende 4 uur te incuberen bij 37 °C met 5% CO2 . Meet de fluorescentie met behulp van een fluorescentie multi-well plaatlezer op 530/590 nm excitatie/emissiegolflengten.</li>
	<li>Breng de celsupernatanten uit de putten na de incubatie van 20 uur over in afzonderlijke steriele polypropyleenbuizen van 2 ml en vries in bij -80 °C. Kwantificeer cytokines die vrijkomen door de pHCECs en iHCECs na blootstelling aan de chemicaliën. Gebruik hetzelfde multiplexplatform dat wordt gebruikt om de cytokines van de UV-behandelde cellen te beoordelen. Gebruik een multiplex cytokinetest volgens de instructies van de kit om de volgende vier cytokines te kwantificeren: IL-6, IL-8, IL-1β en TNF-α.</li>
</ol>5. Onderzoek van cellen die zijn blootgesteld aan verschillende concentraties BAK
<ol><li>Zaadcellen bij 1 × 10 5/ml HOEM in elk putje van een 24-well collageen-1 gecoate kweekplaat en incubeer bij 37 °C met5% CO2 gedurende 24 uur. Verwijder na de incubatietijd het medium en stel de cellen gedurende 5 minuten bloot aan 1 ml chemische toxines (BAK 0,001%, BAK 0,005% en BAK 0,01% in PBS).</li>
	<li>Verwijder na blootstelling de chemische toxines, spoel de putten met 1 ml PBS en voeg 1 ml HOEM toe aan elke put. Na 20 uur incubatie kleurt u de cellen gedurende 20 minuten bij 37 °C met 500 μL annexinekleuringsbufferoplossing die calceïne (4 μM), ethidiumhomodimeer-1 (8 μM) en annexine V (5 μL buffer-Alexa Fluor 647-conjugaat) bevat. Stel de microscoop in om de intensiteiten van annexine V, calceïne AM en ethidium-1-kleuring te meten bij excitatie/ emissiegolflengten van respectievelijk 630/675 nm, 495/515 nm en 528/617 nm. Stel de cellen voor met behulp van de fluorescentiemicroscoop</li>
</ol>6. Data-analyse
<ol><li>Voer een normaliteitstest en een test voor gelijke varianties uit voordat u een variantieanalyse (ANOVA), Welch ANOVA of Kruskal-Wallis-test uitvoert. Gebruik de juiste post-hoc test om elke geteste groep te vergelijken. Stel p < 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li>
<li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal%2C+lens%2C+and+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li>
<li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li>
<li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span%3A+in+vitro+model+for+ocular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li>
<li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li>
<li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li>
<li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li>
<li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li>
<li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li>
<li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li>
<li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li>
<li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li>
<li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death & Disease. 6, 1640(2015).</li>
<li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase%3A+PP2A+structural+importance%2C+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li>
<li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation%2C+migration%2C+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+nvestigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li>
<li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li>
<li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li>
<li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li>
<li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection%3A+a+review+of+the+current+and+future+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li>
<li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li>
<li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132(2006).</li>
<li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li>
</ol>

De auteur, Lyndon W. Jones, heeft de afgelopen 3 jaar, via CORE, onderzoeksondersteuning of lectoraat honoraria ontvangen van de volgende bedrijven: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J &J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage en Visioneering. Lyndon Jones is ook consultant en/of zit in een adviesraad voor Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis en Ophtecs. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Potentiële verschillen in het gebruik van twee soorten HCEC's werden beoordeeld. Cellen werden in hetzelfde medium (HOEM) geplaatst bij identieke concentraties cellen en vervolgens blootgesteld aan korte en lange perioden van UV-straling en drie oculaire toxines. Doses UV-straling en chemicaliën werden geselecteerd op basis van hun fysiologische effecten, die schadelijk genoeg waren voor de cellen om tussenliggende reacties te produceren die konden worden vergeleken. Blootstellingstijden van 5 en 20 min voor UV-straling ...

In vitro toxicologische studies worden uitgevoerd om de toxische effecten van chemicaliën en andere agentia te voorspellen die schade aan cellen kunnen veroorzaken. Bij de beoordeling van de toxiciteit voor het hoornvlies zijn menselijke cornea-epitheelcellen (HCEC's) gebruikt in modellen voor het evalueren van deze effecten 1,2,3,4. Deze modellen evalueren meestal fysiologische effecten zoals veranderingen in de metabole activiteit van de cel, celproliferatie en andere celfuncties zoals de productie en afgifte van inflammatoire cytokines. Voor deze toxicologische studies zijn cellen uit verschillende bronnen geselecteerd om de schadelijke effecten van chemicaliën en UV-straling op HCECs 2,3 te beoordelen. pHCEC-lijnen zijn verkrijgbaar bij bedrijven die deze cellen leveren uit donorweefsels van volwassenen. Primaire cellen kunnen worden behandeld met dispase en voorzichtig van het hoornvlies worden geschraapt voor kweek5. De cellen worden vervolgens getest op virussen en besmetting en vervolgens gecryopreserveerd in 10% dimethylsulfoxide.
Het voordeel van primaire cellijnen is dat de cellen genetisch identiek zijn aan de cellen van de donor. Dit is ideaal, omdat een in vitro model het in vivo weefsel zoveel mogelijk moet nabootsen. Het nadeel van primaire cellijnen is dat ze een beperkt aantal celdelingen of passages hebben6. Het beperkte aantal beschikbare cellen beperkt het aantal experimenten dat kan worden uitgevoerd met een enkele primaire cultuur, waardoor de kosten van de experimenten stijgen.
Vereeuwigde cellijnen zijn ook gebruikt in celkweektoxiciteitsmodellen. In tegenstelling tot de primaire cellijn verkregen uit in vivo weefsel, is de vereeuwigde cellijn echter genetisch veranderd. Vereeuwigde cellen worden gemaakt door de genen van een virus op te nemen in het DNA van primaire cellen 6,7,8. Cellen met succesvolle virale genintegratie worden geselecteerd voor de vereeuwigde cellijn. Het voordeel van onsterfelijkheid is dat het onbeperkte snelle proliferatie mogelijk maakt, waardoor een onbeperkt aantal cellen meerdere experimenten kan uitvoeren met dezelfde cellijn. Dit zorgt voor consistentie tussen experimenten en verlaagt de kosten.
Naast veranderingen in de genen die de celproliferatie beperkten, konden ook veranderingen in de expressie van genen met kritische functionaliteit optreden9. Daarom is het nadeel van het gebruik van onsterfelijke cellen dat ze mogelijk niet langer de oorspronkelijke in vivo cellen vertegenwoordigen in termen van hun reactie op verschillende externe stimuli10. Vergelijkingen hebben betrekking op het observeren van de toxische effecten van chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke corneale keratocyten11, evenals onsterfelijke HCECs en primaire cellen van konijnenhoornvliesepitheel12. De vergelijking tussen de effecten van toxines op primaire menselijke keratocyten en vereeuwigde keratocyten toonde geen significante verschillen11. Met behulp van de methoden die in dit artikel worden beschreven, zal de effectiviteit van deze testen om de toxiciteit van UV-straling en oculaire toxines op pHCECs en iHCECs te beoordelen, worden bepaald.
Drie oculaire toxines die vaak worden gebruikt in in vitro assays werden geselecteerd: BAK, H 2 O2en SDS. BAK is een kationisch conserveermiddel dat vaak wordt gebruikt in oogheelkundige oplossingen 13,14, H 2 O2wordt vaak gebruikt om contactlenzen te desinfecteren 15 en SDS is een anionogene oppervlakteactieve stof die wordt aangetroffen in detergentia en shampoos 14. Net als oculaire toxines kan UV-straling ook aanzienlijke schade aan HCECs3 veroorzaken. Bovendien kan overmatige blootstelling aan UV een oculaire aandoening veroorzaken die bekend staat als fotokeratitis en wordt gekenmerkt door symptomen van scheuren, lichtgevoeligheid en een gevoel van korreligheid16.
Er is een onbeperkt aantal primaire celculturen die kunnen worden gebruikt en verschillende vereeuwigde cellijnen die zijn ontwikkeld. Daarom werd een onderzoek uitgevoerd om primaire HCEC's te vergelijken met een vereeuwigde HCEC-lijn om overeenkomsten en verschillen te bepalen tussen modellen die dit soort cellen bevatten.
Dit onderzoek gebruikte microscopie om mogelijke verschillen tussen pHCECs en iHCECs op celfysiologische respons op UV en toxines te beoordelen. De effecten van UV-straling en chemicaliën op de metabole activiteit van cellen en de inflammatoire cytokine-afgifte voor de twee cellijnen werden ook geëvalueerd. Het belang van het bepalen van de verschillen tussen de twee cellijnen is om het optimale gebruik van deze cellijnen te begrijpen voor het evalueren van: 1) het effect van UV-straling op cellen, 2) de effecten van toxines op cellen en 3) de resulterende veranderingen in metabolisme, levensvatbaarheid van cellen en celcytokine-afgifte voor toekomstige studies.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 Vented Flask</td><td>Corning</td><td>354485</td><td>Dit is het BioCoat merk, met een laagje collageen</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Annexin Staining buffer solution</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 microscope met een Zeiss confocal laser scanning microscope 510 systeem</td><td>Carl Zeiss Inc., Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 48 Well plates</td><td>Corning</td><td>354505</td><td>Dit is het BioCoat merk, met een laagje collageen</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>Kan fluorescentie lezen van 280 - 700 nm (voor assay 540/590)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hycone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>glasbodem dekglasjes</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Corneal Epithelial Cells</td><td>University of Ottawa</td><td>N/A</td><td>SV40-geïmmortaliseerde humane cornea-epitheliale cellen van Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) en zijn gekenmerkt Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functionele humane cornea-equivalenten geconstrueerd uit cellijnen. Science. 1999;286:2169-72.</td></tr><tr><td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) met de volgende supplementen:</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCMC001</td><td>Epigro basismedia gesupplementeerd met 6 mM L-Glutamine, 0,002% EpiFactor O (celmedium supplement O in artikel), 1,0 &mu;M Epinephrine, 0,4% EpiFactor P (celmedium supplement P in artikel), 5 &mu;g/mL rh Insulin, 5 &mu;g/mL Apo- Transferrine en 100 ng/mL Hydrocortison Hemisuccinate in met Collageen-1 gecoate kweekkolven (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td></tr><tr><td>Live Dead calcien en ethidium homodimer</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x concentratie dus voeg 1 mL toe aan elke 99 mL medium</td></tr><tr><td>Primary Corneal Epithelial Cells</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCCE016</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax fluorescentie multi-well plate reader</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (celdissocatie oplossing)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr></tbody></table>

het bepalen van de toxiciteit van uv-straling en chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Dit artikel beschrijft de methoden voor het meten van de toxiciteit van ultraviolette (UV) straling en oculaire toxines op primaire (pHCEC) en vereeuwigde (iHCEC) menselijke cornea-epitheelcelculturen. Cellen werden blootgesteld aan UV-straling en toxische doses benzalkoniumchloride (BAK), waterstofperoxide (H 2 O2) en natriumdodecylsulfaat (SDS). De metabole activiteit werd gemeten met behulp van een metabole test. De afgifte van inflammatoire cytokines werd gemeten met behulp van een multi-plex interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8 en tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) assay, en cellen werden geëvalueerd op levensvatbaarheid met behulp van fluorescerende kleurstoffen.
De schadelijke effecten van UV op de metabole activiteit van cellen en de afgifte van cytokines traden op bij 5 minuten UV-blootstelling voor iHCEC en 20 minuten voor pHCEC. Vergelijkbare procentuele dalingen in metabole activiteit van de iHCEC en pHCEC traden op na blootstelling aan BAK, H 2 O2of SDS, en de meest significante veranderingen in cytokineafgifte traden op voor IL-6 en IL-8. Microscopie van fluorescerend gekleurde iHCEC- en pHCEC BAK-blootgestelde cellen toonde celdood bij 0,005% BAK-blootstelling, hoewel de mate van ethidiumkleuring groter was in de iHCECs dan pHCECs. Met behulp van meerdere methoden voor het beoordelen van toxische effecten met behulp van microscopie, beoordelingen van metabole activiteit en cytokineproductie, kon de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines worden bepaald voor zowel primaire als onsterfelijke cellijnen.

Celgrootte De primaire en vereeuwigde HCEC's werden gevisualiseerd met drie fluorescerende kleurstoffen, die drie verschillende stadia van levensvatbaarheid van cellen weerspiegelen. Levende cellen zijn groen (calceïne-AM), dode cellen zijn rood (ethidium homodimeer-1) en apoptotische cellen zijn geel (annexine V-computer-aangepaste kleur voor een betere visualisatie van het fluorescentiesignaal). Levende cellen bevatten esterasen in het celcytoplasma en zetten calceïne-AM om in calceïne. Dode cellen ...

Dit artikel beschrijft de procedures die worden gebruikt om de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines op een primaire en onsterfelijke cellijn te evalueren.

Het bepalen van de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Deze methode kan worden gebruikt om in vitro de toxiciteit van nieuwe oogheelkundige productformuleringen te evalueren. Door de concentraties van chemicaliën en productformuleringen te verfijnen met behulp van oculaire cellen in vitro, kan het gebruik van dieren voor het beoordelen van nieuwe productveiligheid worden geminimaliseerd. In vitro assays evalueren toxiciteitseindpunten die niet in vivo kunnen worden beoordeeld, zoals het bepalen van het effect van een chemische stof op de mitochondriale functie, celmembraanintegriteit en enzymactiviteit.Het evalueren van celtoxiciteit in vitro is de sleutel tot het begrijpen van potentiële mechanismen van toxiciteit. Dit is essentieel voor het vaststellen van een maximaal aanvaardbare dosis therapeutische chemicaliën in het oog. De procedure wordt gedemonstreerd door Nijani Nagaarudkumaran, een onderzoeker van het Jones Laboratory.Begin met het plaatsen van zowel pHCECs als iHCECs op met collageen gecoate petrischalen met glazen bodembedekking in een concentratie van 1 x 10 tot de 5e met 1 milliliter menselijk oculair epitheelmedium, of HOEM. Kweek pHCECs en iHCECs 1 set culturen gedurende 24 uur en een andere set gedurende 48 uur in een 37-graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxide. Na incubatie kleurt u de cellen met 500 microliter annexinekleuringsbufferoplossing met 4 micromolaire calceïne, 8 micromolaire ethidiumhomodimeer 1 en annexine 5 gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.Nadat u de cellen hebt gekleurd, past u de confocale laserscanmicroscoop aan om de excitatie- en emissiegolflengten vast te leggen, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Verkrijg de tweedimensionale en driedimensionale afbeeldingen volgens de instructies in het manuscript. Zaai de cellen op 5 x 10 tot de 4e per milliliter HOEM in elk putje van een 24-well collageen 1 gecoate kweekplaat en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 3 uur.Verminder na incubatie het volume van het medium in de putten tot 300 microliter. Stel de cellen vervolgens bloot aan UVA-straling met 6,48 watt per vierkante meter en UVB-straling met 1,82 watt per vierkante meter bij 37 graden Celsius gedurende 5 en 20 minuten in afzonderlijke experimenten. Voeg na UV-straling 200 microliter verse HOEM toe aan elke put en incuber gedurende 20 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Verzamel de volgende dag het celsupernatant in elk putje en breng het over in steriele polypropyleenbuizen van 2 milliliter. Vries het supernatant in bij min 80 graden Celsius. Om de cytokineniveaus te bepalen die vrijkomen door de pHCECs en iHCECs na UV-blootstelling, gebruikt u een multiplex cytokine-assay en volgt u de instructies van de kit om interleukine 6, interleukine 8, interleukine-1 bèta en TNF-alfa te kwantificeren.Bereid 10% metabolisch assay-reagens in DMEM en F12. Vervang het kweekmedium in elke put door 1 milliliter van de 10% metabole testoplossing en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 4 uur. Meet de fluorescentie van elke oplossing met behulp van een fluorescerende plaatlezer op 530 nanometer excitatie en 590 nanometer emissiegolflengten.Zaadcellen op 5 x 10 tot de vierde per milliliter HOEM in elk putje van een 24-well collageen 1 gecoate kweekplaat. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 3 uur. Verwijder na incubatie het medium en stel de cellen bloot aan 1 milliliter chemische toxines, waaronder 0,001% benzalkoniumchloride of BAK, 0,01% waterstofperoxide en 0,0025% natriumdodecylsulfaat in PBS gedurende 5 en 15 minuten.Verwijder na blootstelling aan de chemische toxines de gifstoffen uit de putten, spoel af met 1 milliliter PBS en voeg 1 milliliter HOEM toe aan elke put. Voer na 20 uur incubatie een metabole test uit door het medium te vervangen door 1 milliliter van een 10% metabole testoplossing en gedurende 4 uur bij 37 graden Celsius te broeden met 5% koolstofdioxide. Meet de fluorescentie van elke oplossing met behulp van een fluorescerende plaatlezer bij 530 nanometer excitatie en 590 nanometer emissiegolflengten.Breng de celsupernatanten uit de putten na de 20 uur durende incubatie over in afzonderlijke steriele polypropyleenbuizen van 2 milliliter en vries ze in bij min 80 graden Celsius. Gebruik hetzelfde multiplexplatform dat wordt gebruikt om de cytokines van de UV-behandelde cellen te beoordelen volgens de instructies van de kit om interleukine 6, interleukine 8, interleukine-1 bèta en TNF-alfa te kwantificeren. Zaadcellen op 1 x 10 tot de 5e per milliliter HOEM in elke put van een 24-well collageen 1 gecoate kweekplaat en incuberen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.Verwijder na incubatie het medium en stel de cellen gedurende 5 minuten bloot aan 1 milliliter chemische toxines, waaronder 0,001% BAK, 0,005% BAK en 0,01% BAK in PBS. Verwijder na blootstelling de chemische toxines, spoel de putten af met 1 milliliter PBS en voeg 1 milliliter HOEM toe aan elke put. Na 20 uur incubatie, kleurt u de cellen met 500 microliter annexine kleuringsbufferoplossing met calceïne, ethidiumhomodimeer en annexine 5 gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.Stel de microscoop in om intensiteiten te meten bij excitatie- en emissiegolflengten van 630 en 675 nanometer voor annexine 5, 495 en 515 nanometer voor calceïne AM en 528 en 617 nanometer voor ethidium 1-kleuring. Verkrijg vervolgens beelden van de cellen met behulp van de fluorescentiemicroscoop. De iHCECs bleken kleine cellen te zijn die variëren van 10 tot 20 micrometer en de pHCECs lagen in het bereik van 20 tot 50 micrometer na 24 uur groei.Vergelijkbare verschillen in groottebereik werden waargenomen voor iHCECs en pHCECs na 48 uur groei. Vergeleken met de niet-UV-blootgestelde cellen was de metabole activiteit van bestraalde pHCECs significant verminderd na 20 minuten blootstelling. Voor iHCECs nam de metabole activiteit af voor cellen die na zowel 5 als 20 minuten werden bestraald.Daarom duurde het langer voordat de blootstelling de metabole activiteit van de pHCECs verminderde dan de iHCECs. De maximale cytokineafgifte door de iHCECs was bij 5 minuten UV-blootstelling. De maximale cytokineafgifte voor pHCECs vond plaats na 20 minuten UV-blootstelling.In termen van totale hoeveelheden inflammatoire cytokines die vrijkwamen, gaven de pHCECs aanzienlijk meer interleukine-1 bèta, interleukine 8 en TNF-alfa vrij dan de iHCECs, terwijl de iHCECs meer interleukine 6 vrijgaven. Zowel pHCECs als iHCECs vertoonden een verandering in de afgifte van interleukine 6 na blootstelling aan alle drie de chemicaliën. BAK veroorzaakte een afname van de afgifte van interleukine 6 in vergelijking met de controle voor zowel primaire als onsterfelijke HCEC's.Waterstofperoxide veroorzaakte een toename van de afgifte van interleukine 6 uit iHCECs en een afname van de afgifte van pHCECs. Zowel pHCECs als iHCECs waren significant beschadigd bij 0,005% en 0,1% van BAK. Na het uitvoeren van in vitro beoordelingen van oculaire celtoxiciteit, konden verdere diermodellen van oculaire toxiciteit worden uitgevoerd om het effect van een oculair product op de hoornvlieszenuwen of het oculaire immuunsysteem te bepalen.Deze technieken zijn essentieel voor het bepalen van de mechanismen van chemische en productformuleringstoxiciteit op het oog en zullen helpen het gebruik van dieren voor productontwikkelingstests te minimaliseren.

determining-toxicity-uv-radiation-chemicals-on-primary-immortalized

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes an in vitro fluorometric assay to assess the effects of artificial tear formulations on the cellular metabolic activity of corneal epithelial cells using resazurin-based Alamar blue solution. A non-toxic formulation maintains the cells in a healthy, metabolically active state, facilitating the reduction of resazurin into a highly fluorescent resorufin.

alamarBlue Assay: A Sensitive Fluorometric Method to Screen the Cytotoxic Effects of Artificial Tear Formulations on Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells

Epidermale keratinocyten vormen een functionele huidbarrière en worden gepositioneerd in de voorste lijn van de gastheerverdediging tegen externe milieubeledigingen. Hier beschrijven we methoden voor isolatie en primaire cultuur van epidermale keratinocyten van neonatale en volwassen muishuid, en inductie van terminale differentiatie en UVB-geactiveerde ontstekingsrespons van keratinocyten.

Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid

Hoge-doorvoer kleine remmende RNA screening is een belangrijk instrument die helpen kan sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. Hierin presenteren wij de ontwikkeling en validatie van blootstelling modellen en methoden mbt de hoge doorvoer screening van waterstoffluoride en chloorpikrine-geïnduceerde hoornvlies epitheliale letsel.

High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

Dit protocol introduceert een eenvoudige twee stappen methode voor het differentiëren van hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen kostenefficiënte en grootschalige productie van klinische kwaliteit cellen toepassing op hoornvlies cel therapie gebruik.

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

Het doel van dit protocol is om te evalueren of verschillende kunstmatige traanformuleringen menselijke hoornvliesepitheelcellen kunnen beschermen tegen uitdroging met behulp van een in vitro model. Na blootstelling aan kunstmatige traanformuleringen en uitdroging worden menselijke hoornvliesepitheelcellen beoordeeld op metabole activiteit.

Effect van kunstmatige traanformuleringen op de metabolische activiteit van menselijke cornea-epitheelcellen na blootstelling aan uitdroging

Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.

Ex vivo en in vivo diermodellen voor mechanische en chemische verwondingen van cornea-epitheel

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

Ex vivo orgaancultuur van het hoornvlies van varkens en epitheliale wondgenezing bieden een economisch, ethisch, reproduceerbaar en kwantitatief middel voor het testen van de oculaire toxiciteit van chemicaliën. Ze helpen ook bij het ophelderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van epithelisatie en weefselherstel, en bij het evalueren van therapieën voor de behandeling van diabetische keratopathie en vertraagde wondgenezing.

Evaluatie van therapeutische en chemische toxiciteit met behulp van orgaangekweekte varkenshoornvliezen en epitheliale wondgenezing

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor het kweken van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen van explantaten van menselijke bronchiale luchtwegen weefsel inclusief gedifferentieerde groei van een lucht-water grensvlak. Deze methode biedt een overvloedige bron van primaire cellen voor onderzoek naar de rol van de luchtweg epitheel in de menselijke longen gezondheid en ziekte.

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

Leer hoe je de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën bepaalt op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen. Deze methode minimaliseert dierproeven bij de veiligheidsbeoordeling van oogheelkundige producten.

Het bepalen van de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen

Meer video's verkennen