Beeldvorming van dendritische stekels bij Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft methoden voor het visualiseren van dendritische wervelkolommorfologieën en calciumtransiënten in C.elegans-neuronen. Onze aanpak moet genetische benaderingen vergemakkelijken om determinanten van een wervelkolommorfogenese en -functie te ontdekken. Ons protocol bevat dendritische stekels in GABAerge neuronen.

Stekels in andere klassen van C.elegans neuronen kunnen ook worden onderzocht met deze methoden. Ons protocol beschrijft methoden voor het immobiliseren van levende C.elegans. Het is vooral belangrijk om bewegingen van dieren tijdens beeldacquisitie te voorkomen en de juiste laserconfiguraties te kiezen om neuronale activiteit te prikkelen en vast te leggen.

Om afbeeldingen met een hoge resolutie te verkrijgen, voegt u drie microliter anesthetische oplossing toe en hoeveelheid 15 tot 20 jongvolwassen wormen op 10% agarose-pads. Breng vervolgens de coverslip aan om de wormen te immobiliseren en sluit de coverslipranden af met een gesmolten lijmkitmengsel. Gebruik voor een superresolutie-acquisitie een confocale laserscanmicroscoop die is uitgerust met superresolutiemicroscopie.

Koop Z-stacks met behulp van de stapgrootte die wordt aanbevolen door de software van de fabrikant. Verzamel een reeks optische secties die het totale volume van het Dorsale D- of DD-ventrale proces omvatten. Dien de Z-stacks in voor beeldverwerking met behulp van de software van de fabrikant en analyseer afbeeldingen met een score hoger dan zeven.

Gebruik voor Nyquist-acquisitie een confocale microscoop voor laserscanning en selecteer de optimale pixelgrootte voor de golflengte van het licht en het numerieke diafragma van de objectieflens. Dien vervolgens de stack in voor 3D-deconvolutie met behulp van een automatisch algoritme. Gebruik voor beeldanalyse een geschikte beeldverwerkingssoftware om maximale intensiteitsprojecties van de Z-stacks te maken.

En tel handmatig de uitsteeksels op de DD-dendriet. Bepaal vervolgens de lengte van de gescoorde DD-dendriet om de dichtheid van stekels per 10 micrometer DD-dendriet te berekenen. Classificeer vervolgens de stekels als dun of paddenstoel, filopodiaal, stomp of vertakt.

Maak met behulp van conventionele technieken zoals micro-injectie transgene wormen die de calciumsensor GCaMP in DD-neuronen tot expressie brengen, en Chrimson, een rood verschoven kanaal rhodopsine in presynaptische VA-neuronen. Bereid vervolgens onder een laminaire kap alle trans-retinale of ATR-platen voor door 300 microliter 's nachts gekweekte OP50-bacteriecultuur en 0,25 microliter ATR toe te voegen aan elke 60 millimeter nematodengroeimedium voedingsagarplaat. Verspreid vervolgens de cultuur met een steriele glazen staaf.

Voeg voor controleplaten 300 microliter OP50-bacteriën en 0,25 microliter ethanol toe. Om bacteriegroei mogelijk te maken, incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur, beschermd tegen omgevingslicht. Om het experiment op te zetten, plaatst u vijf L4-stadiumlarven op OP50-gezaaide ATR- of controleplaten en incubeert u de platen in het donker bij 23 graden Celsius.

Gebruik na drie dagen een stereo-ontleedmicroscoop om de vulva-ontwikkeling te bevestigen en kies L4-stadium nakomelingen uit de ATR en controleplaten voor beeldvorming. Plaats vervolgens twee microliter van 0,05 micrometer polykralen op een microscoopglaasje. En plaats ongeveer 10 L4-larven in de oplossing.

Voeg met behulp van een platinadraad een kleine bol superlijm toe aan de oplossing. Draai de oplossing voorzichtig rond om filamenteuze strengen lijm te genereren. Voeg vervolgens drie microliter M9-buffer toe.

Breng vervolgens een afdekslip aan en sluit de randen af zoals eerder gedemonstreerd. Om opgeroepen calciumtransiënten in de dendritische stekels vast te leggen, gebruikt u een spinschijf confocale microscoop en past u het microscoopstadium aan om de DD-stekels in het brandpuntsvlak te positioneren. Stel vervolgens time-lapse-acquisitie in om het monster te verlichten met een 488 nanometer laserlijn in elk frame voor het detecteren van GCaMP-fluorescentie en een 561 nanometer laserlijn met periodieke intervallen voor Chrimson-excitatie.

Gebruik voor in vivo calciumbeeldvorming 2D-deconvolutie en beelduitlijning om kleine afwijkingen van de wormbeweging tijdens de acquisitie te corrigeren. Definieer vervolgens de DD dendritische wervelkolom als het interessegebied of de ROI. Dupliceer de ROI en verplaats naar een naburig gebied in de worm om het achtergrondsignaal te verzamelen.

Exporteer vervolgens met behulp van de juiste software de GFP-intensiteiten naar Excel voor elk tijdstip en trek achtergrondfluorescentie af van de ROI-fluorescentie van de wervelkolom. Bepaal de verandering in fluorescentie door de GFP-fluorescentie in het frame af te trekken onmiddellijk vóór de excitatie van 561 nanometer of op nul vanaf elk tijdstip na excitatie of Delta F.Deel vervolgens door F nul om Delta F over F nul te bepalen. En breng de genormaliseerde sporen in kaart.

Bepaal eerst of de gegevens normaal worden gedistribueerd met behulp van een Shapiro-Wilk-test. Voor gegevens die normaal niet worden gedistribueerd, gebruikt u een niet-parametrische ANOVA met post-hoccorrectie voor meerdere tests. Als alternatief, voor metingen die de normale of Gaussische verdeling laten zien, voert u een gepaarde parametrische ANOVA-test uit voor elke meting van GCaMP-fluorescentie voor en na elke puls van 561 nanometer.

En correct voor meerdere vergelijkingen in elk van de twee groepen. Labeling van DD dendritische stekels met drie onafhankelijke markers, cytosolic mCherry, MYR:mRuby en LifeAct:GFP leverde een gemiddelde dichtheid op van 3,4 DD dendritische stekels per 10 micron DD-dendriet bij wildtype jongvolwassenen. De GFP:Utrofinemarker werd uitgesloten van deze analyse omdat het een significant lagere wervelkolomdichtheid opleverde, mogelijk als gevolg van interacties van utrofine met het actinecytoskelet dat de morfogenese van de wervelkolom aandrijft.

De live cell imaging-benadering bevestigde dat de dunne paddestoelvormige morfologie van de DD-stekels overheerst bij de volwassene in vergelijking met alternatieve wervelkolomvormen zoals filopodiaal, stomp en vertakt. Activering van DD dendritische stekels werd beoordeeld door presynaptische cholinerge signalering in transgene wormen die GCaMP tot expressie brengen in DD-neuronen en Chrimson in presynaptische VA-neuronen. Voorbijgaande uitbarstingen van het GCaMP-signaal werden gedetecteerd in DD-stekels onmiddellijk na optogenetische activering van Chrimson in presynaptische VA-neuronen.

Een controle-experiment bij afwezigheid van ATR bevestigde dat de maat voor het GCaMP-signaal afhankelijk is van de optogenetische activering van Chrimson, die strikt ATR-afhankelijk is. Om DD-stekels te visualiseren, is het het beste om dieren die op hun zij liggen in beeld te brengen, zoals de stekels die uitsteken haaks op het lichtpad staan. Met deze methode kunnen wetenschappers ook farmacologische manipulaties gebruiken om de mechanismen te begrijpen die calciumtransiënten in DD-stekels aandrijven.