Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

Dit protocol vergemakkelijkt het screenen van nieuwe formuleringen om beter te begrijpen hoe modificaties hun weefselresidentietijden beïnvloeden, wat van cruciaal belang is bij het ontwerpen van een optimaal medicijnafgiftesysteem. Deze techniek is niet-invasief en maakt realtime beeldvorming mogelijk, waardoor het overmatige gebruik van dieren voor bemonstering wordt verminderd. Medicijnafgiftesystemen kunnen opnieuw worden ontworpen voor beeldvorming en therapeutische toepassingen door eenvoudigweg het therapeutische medicijn en het beeldvormingsgedeelte in één nanodrager op te nemen.

Dit heeft nuttige toepassingen bij zowel de behandeling van kanker als infectieziekten. Rasha Msallam, een senior research fellow uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Om te beginnen, twee uur voor subconjunctivale injectie, injecteer de muis intraveneus via de staart met 2,5 milligram per kilogram Evans blue, of EB. Na het verdoven van de muis met 5% isofluraan, brengt u de muis over naar een neuskegel en houdt u de verdoofde muis op een verwarmingskussen.

Snijd vervolgens de snorharen in de buurt van het oog dat moet worden geïnjecteerd. Breng een druppel van 0,5% proxymetacaine hydrochloride-oplossing direct op het oog aan. Laad vervolgens een glazen spuit van 10 microliter uitgerust met een 32-gauge naald met fluorescerende liposomen en zorg ervoor dat de luchtbellen niet in de spuit aanwezig zijn.

Til met een pincet het bindvlies op en injecteer langzaam liposomen in de subconjunctivale ruimte en trek de naald vervolgens langzaam terug, waardoor terugstroming wordt voorkomen. Zorg voor de vorming van bleb gevuld met fluorescerende liposomen. Dien een 1% fusitische zuurdruppel op het oog toe en controleer de muis totdat deze weer bij bewustzijn komt.

Schakel het CLM-systeem in. Sluit de sonde aan op het CLM-systeem. Kies op dit punt het gezichtsveld en de locatie voor de acquisitiebestanden.

Pas de laserintensiteit aan om ervoor te zorgen dat de fluorescentiedetectie voor fluoresceïne DHPE zich in het lineaire bereik bevindt en houd de intensiteit consistent voor vergelijking tussen afbeeldingen die op verschillende tijdstippen zijn gemaakt. Nadat het systeem gedurende 15 minuten is opgewarmd, kalibreert u het systeem volgens de instructies van de fabrikant met behulp van de kalibratiekit met de reinigings-, spoel- en fluoro-4-oplossingen voor elke laser. Begin kort met kalibreren door de punt gedurende vijf seconden onder te dompelen in de reinigingsflacon en vervolgens in de spoelflacon.

Laat de punt in de lucht voor achtergrondopname om de achtergrondwaarden van de verschillende vezels van de sondes te normaliseren, waardoor de uniformiteit van het beeld wordt gegarandeerd. Dompel de punt nogmaals gedurende vijf seconden onder in de reinigingsflacon en vervolgens in de spoelflacon. Dompel vervolgens de tip gedurende vijf seconden onder in de injectieflacon met fluor-4 488-nanometer om de signaalwaarden te normaliseren.

Herhaal de tip onderdompeling gedurende vijf seconden in de reinigingsflacon, gevolgd door de spoelflacon. Houd de punt in de spoelflacon totdat het fluorescentiesignaal dat in de vorige stap is geregistreerd, verdwijnt. Breng vervolgens de tip over in de injectieflacon met fluoro-4 660-nanometer om de signaalwaarden van verschillende vezels in de sonde te normaliseren.

Controleer na kalibratie of de waarde minder dan 100 is voor de achtergrond van de sonde. Voer anders herhaalde reiniging van de sonde uit met een wattenstaafje applicator. Schakel de diertemperatuurregelaar in met een aangesloten verwarmingskussen en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius.

Nadat u het verwarmingskussen hebt bedekt met een chirurgisch gordijn, bevestigt u de neuskegel op het verwarmingskussen. Na het verdoven van de muis met behulp van 5% isofluraan in een inductiekamer, brengt u de muis over naar de neuskegel en houdt u de verdoofde muis op een verwarmingskussen. Breng vervolgens een druppel verdovingsmiddel 0,5% proxymetacainehydrochloride-oplossing op het oog aan.

Om het oogoppervlak te wassen en de kristallisatie van de lens te voorkomen, houdt u de ogen gesmeerd door een paar zoute druppels te laten vallen. Draai en pas vervolgens het oculair van de microscoop aan om het muisoog ergonomisch in de directe focus te bekijken met een vergroting van 0,67 keer. Schakel de laser in en plaats de sonde als een pen direct op het ooggebied dat in beeld moet worden gebracht.

Begin vervolgens met het registreren van acquisitie om de fluorescentie in het oog in het betreffende gebied te observeren. Stop de opname wanneer alle regio's zijn gemarkeerd en gelabeld volgens de oogkaart om de exacte sondelocatie op het exacte frame te kennen. De acquisitiebestanden worden automatisch opgeslagen als videobestanden op de eerder gekozen locatie.

De fluorescentiebeeldvorming onthulde een duidelijk onderscheid tussen de sclera- en hoornvliesgebieden. Hoge vascularisatie van de episclera en conjunctiva zorgde ervoor dat het sclera-gebied rood kleurde met EB. Het hoornvlies, dat geen vasculatuur heeft, leek zwart. De contrastfluorescentie van limbus en sclera werd waargenomen in zeven dagen durende studie.

Met fluoresceïnekleurstof geïnjecteerde controlemuizen bevestigden de specificiteit van liposoom-afgeleide fluorescentie. De fluorescentie-intensiteiten waren hoog op de eerste en derde dag. Groene fluorescentie proxied de liposoom vermindering in de limbus en sclera regio's in de loop van de tijd.

De verschillen in de fluorescentiesignalen van dag één na injectie tot dag drie in temporale limbus- en superieure limbusregio's waren niet significant, wat wijst op de voorkeur van neutrale liposomen voor het limbusgebied, met name de cornea-periferie. Voor de temporale en superieure regio's op de eerste dag na injectie was de fluorescentie in de sclera zes keer hoger dan in de limbus. Tegen de derde en zevende dag waren liposomen significant verminderd in de sclera in de temporale en superieure regio's, toegeschreven aan oculaire klaringsmechanismen.

De laagste hoeveelheid fluorescentie werd gedetecteerd in de nasale en inferieure regio's, vanwege de afstand tot de injectieplaats. Het is belangrijk om de vlekframes te labelen volgens de oogkaart voordat de opname wordt gestopt. Houd de laserintensiteit consistent en definieer de maximale achtergrondwaarde voor een goede vergelijking tussen verschillende experimenten.

Na de identificatie van loodformuleringen kunnen uitgebreide farmacokinetische en biodistributiestudies bij dieren worden uitgevoerd om de biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel te bestuderen en de therapeutische werkzaamheid van hun formuleringen te valideren.