Name: Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Leer mechanische signalen in neurale crest-cellen bestuderen met een geoptimaliseerd O9-1/hydrogel-systeem. Deze methode onthult interacties tussen mechanische en chemische signalen tijdens de ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Ana-Maria Zaske, exploitant van Atomic Force Microscope-UT Core-faciliteit aan het University of Texas Health Sciences Center, voor de bijgedragen expertise in AFM in dit project. We danken ook de financieringsbronnen van de National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 en R01HL142704 aan J. Wang).

1. Hydrogel voorbereiding
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een celkweekkap die vóór gebruik is gedesinfecteerd met ethanol en ultraviolet (UV) -gesteriliseerd om de steriliteit te behouden. Gereedschappen, zoals pincetten en pipetten, moeten worden besproeid met ethanol. Bufferoplossingen moeten ook steriel worden gefilterd.
<ol><li>Bereiding van aminosilane-gecoate glazen coverslips<ol>
<li>Plaats het gewenste aantal glazen afdekplaten op een stuk laboratoriumdoekje. OPMERKING: Bereid een extra 3-4 coverslips voor om ervoor te zorgen dat er voldoende back-upvoorraden zijn als ze gemakkelijk breken. Verschillende materialen van glazen coverslips zullen verschillende compatibiliteit van celzaaien en hechten opleveren. Het is beter om te bepalen welk type het beste bij het experiment past voordat u met de experimenten begint (zie de tabel met materialen).</li>
		<li>Gebruik een alcoholbrander of Bunsen-brander om elke coverslip te steriliseren door deze heen en weer door de vlam te laten gaan (30 s voor eiwittestexperimenten). Plaats elke glazen afdekplaat op een laboratoriumdoekje om af te koelen.</li>
		<li>Zodra de glazen afdekkingen zijn afgekoeld, breng je ze over op een petrischaaltje bekleed met parafilm om uitglijden te voorkomen. OPMERKING: Als de coverslips niet koel genoeg zijn, zal de restwarmte de parafilm op de slips smelten, waardoor ze onbruikbaar worden.</li>
		<li>Dek de coverslips af met ongeveer 200 μL en 800 μL van 0,1 M NaOH voor respectievelijk een coverslip van 12 mm en 25 mm en laat ze 5 minuten zitten. Adem vervolgens de 0,1 M NaOH op en laat de coverslips nog 5 minuten aan de lucht drogen om een gelijkmatige film te vormen.</li>
		<li>Pipetteer na het drogen van de coverslips ongeveer 80 μL en 150 μL 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTS) voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de oplossing op de parafilm wordt gemorst. Laat de oplossing 5 minuten zitten.</li>
		<li>Zuig zoveel mogelijk overtollige APTS op en laat de resterende APTS 5 min drogen. Spoel de coverslips goed af door ze drie keer gedurende 5 minuten onder te dompelen in steriele, gedeïoniseerde (DI) H2O. OPMERKING: Als de glazen afdekplaten niet goed worden gespoeld, veroorzaakt de resterende APTS ongewenste reacties met glutaaraldehyde, waardoor een wit neerslag ontstaat en resulteert in onbruikbare coverslips.</li>
		<li>Verplaats de coverslips naar een nieuwe petrischaal met de reactieve kant naar boven gericht. Voeg voldoende 0,5% glutaaraldehyde toe aan de petrischaal om de coverslips volledig te bedekken en laat de coverslips 30 minuten zitten.</li>
		<li>Zuig de 0,5% glutaaraldehyde op en spoel de afdeksels gedurende 3 min één keer opnieuw af in DI H2O. Zet de coverslips reactief met de zijkant naar boven op een laboratoriumdoekje of een schone petrischaal om volledig aan de lucht te drogen voor gebruik. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd; coverslips moeten tot gebruik in steriel DI H2O worden geplaatst.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van gesiliconiseerde coverslips<ol>
<li>Plaats hetzelfde aantal coverslips als de met aminosilaan gecoate coverslips (stap 1.1.1) in een petrischaaltje bekleed met parafilm.</li>
		<li>Pipetteer 40 μL of 150 μL voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips van dichlooremethylsilaan (DCMS) aan één kant van de coverslip en laat de oplossing 5 minuten zitten.</li>
		<li>Zuig de resterende oplossing uit de deklap aan, was eenmaal gedurende 1 minuut in steriel DI H2O en plaats de reactieve dekzeilen met de voorkant naar boven op een laboratoriumdoekje om volledig aan de lucht te drogen voordat u naar de volgende stap gaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Hydrogels bereiden<ol><li>Meng acrylamide, bisacrylamide en DI H2O in een centrifugebuis van 1,5 ml om 500 μL oplossingen met verschillende stijfheid te bereiden (zie tabel 1). Vortex de oplossing voor 30 s om het grondig te mengen.</li>
		<li>Voeg snel de 10% ammoniumpersulfaatoplossing (APS) en tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe aan de buis en draai de oplossingen opnieuw om de oplossingen te mengen. OPMERKING: Bereid verse 10% APS en laat het op ijs of vries het in tot aliquots voor eenmalig gebruik vanwege de gevoelige vries- / dooicyclus.</li>
		<li>Pipetteer ongeveer 33 μL of 100 μL van de oplossing op de gedroogde 12 mm of 25 mm aminosilane-gecoate coverslips (punt 1.1).</li>
		<li>Plaats met behulp van een gebogen pincet onmiddellijk de met DCMS behandelde coverslip bovenop de geloplossing met de behandelde zijde die de geloplossing raakt, waardoor de geloplossing tussen de met DCMS behandelde coverslip en aminosilane-gecoate coverslip wordt gesandwicht.</li>
		<li>Laat de geloplossing gedurende 5-15 minuten polymeriseren, terwijl u actief controleert op gelpolymerisatie van de overgebleven oplossing in de buis.</li>
		<li>Zodra de gel is gepolymeriseerd, scheidt u de met DCMS behandelde coverslip met een gebogen pincet of een scheermesje, waardoor de gel vastzit aan de originele aminosilane-gecoate coverslip.</li>
		<li>Plaats de coverslip met de aangehechte hydrogel onmiddellijk in een vooraf bepaalde 4-well/24-well en 6-well plaat bedekt met 500 μL en 2 ml steriele PBS of DI H2O voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips, om te voorkomen dat de gel uitdroogt.</li>
		<li>Herhaal stap 1.3.4-1.3.7 voor alle coverslips.</li>
		<li>Dompel de hydrogels gedurende 30 minuten onder in steriel PBS of DI H2O om overtollige acrylamideoplossing te verwijderen. Bewaar de hydrogels in steriel PBS of DI H2O bij 4 °C voor een procedurele stop hier.</li>
		<li>Bereid in een donkere kamer het sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat (sulfo-SANPAH) mengsel door 2,5 ml van 50 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethaansulfonzuur (HEPES) (pH = 8,5) te mengen met 25 μL van de 50 μg / ml sulfo-SANPAH in een conische buis, gewikkeld in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. Gebruik een pipet om de oplossing goed te mengen voor gebruik. OPMERKING: Een volume van 2,5 ml sulfo-SANPAH-oplossing is voldoende voor ongeveer vijfentwintig 12 mm hydrogels of vijf 25 mm hydrogels.</li>
		<li>Aspirateer PBS of DI H2O uit de putplaat. Voeg ongeveer 100 μL of 500 μL voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips van sulfo-SANPAH-oplossing (stap 1.3.10) toe om de gel te bedekken. Zorg ervoor dat de oplossing de gel volledig bedekt. OPMERKING: Pas de vacuümzuigkracht aan om te voorkomen dat de sterke kracht de hydrogels scheurt of verstoort.</li>
		<li>Plaats de gels met de oplossing gedurende 10 minuten onder een UV-licht van 15 W, 365 nm, onbedekt om eventuele interferentie van het UV-licht dat reageert met de sulfo-SANPAH te minimaliseren.</li>
		<li>Zuig het teveel aan sulfo-SANPAH op door de plaat te kantelen om zoveel mogelijk van de oplossing te verzamelen. Was de gel twee tot drie keer met 50 mM HEPES.</li>
		<li>Voeg 500 μL en 2 ml voor respectievelijk 12 mm en 25 mm gels van 50 mg/ml collageen I verdund in 0,2% azijnzuur toe aan elke put die de hydrogel bevat. Laat de gels een nacht incuberen in een incubator van 37 °C, 5% CO2. OPMERKING: Verdun collageen I in 0,2% azijnzuur in plaats van 50 mM HEPES om homogene distributie en aanhechting van collageen I te bevorderen.</li>
		<li>Zuig het collageen I op en was de gels drie keer met steriel PBS om overtollig collageen I gedurende 5 minuten per wasbeurt te verwijderen. Incubeer de hydrogels in PBS met 10% paardenserum, 5% FBS gedurende 2 uur in de incubator van 37 °C, 5% CO2 incubator. OPMERKING: De toevoeging van 10% paardenserum bevordert een hogere proliferatie in vergelijking met alleen het gebruik van FBS zoals gedaan in de vorige publicatie.</li>
		<li>Adem het medium op. Voeg 500 ml steriel gefilterd Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (P / S) toe aan elke put. Bewaar de gels in de 37 °C, 5% CO2 incubator totdat ze klaar zijn voor celkweek.</li>
		<li>Eenmaal klaar, bord ongeveer 1,5 × 104 O9-1 cellen / cm2 in basaal medium in de kweekschalen. Incubeer de cellen gedurende 2 dagen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2. Controleer de cellen op confluïteit om ervoor te zorgen dat de cellen voldoende aan gels zijn bevestigd en dat het aantal cellen voldoende is voordat ze worden verzameld voor analyse. OPMERKING: Zie het eerder gepubliceerde protocol voor de stappen van herstel, passage en verzameling van O9-1-cellen20.</li>
		<li>Ga verder met secties 2, 3 of 4 voor verdere analyse van de hydrogels.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kwantitatieve analyse van stijfheid via AFM
<ol><li>Start de AFM-systeemcomputer, gevolgd door de AFM-controller (zie de Tabel met Materialen).</li>
	<li>Monteer de AFM-uitkraging op de AFM-sondehouder. Gebruik een bolvormige cantilever met een silicakraal van 0,5 μm gemonteerd aan het uiteinde van de cantilever (cantilever met bolvormige kraal). OPMERKING: Voor stijvere hydrogels, zoals 10 kPa, 20 kPa en 40 kPa, werd een stijvere sonde gebruikt met de veerconstante van 0,24 N/m. Een zachtere sonde werd gebruikt voor zachtere hydrogels, zoals 0,5 kPa en 1 kPa, met een veerconstante van 0,059 N/m.</li>
	<li>Stel de AFM-software in op contactmodus.</li>
	<li>Monteer de siliciumwafer op de AFM-monstertrap om krachtcurven te verzamelen door op Engage te klikken om de cantilever het siliciumsubstraat te laten raken, waardoor de krachtcurven worden gegenereerd.</li>
	<li>Gebruik de krachtcurven hierboven (2.4) voor kalibratie, klik op Kalibreren in de besturingssoftware om een gemiddelde veerconstante van de cantilever onder thermische afstemconditie te verkrijgen en sla de gekalibreerde waarden op in de besturingssoftware.</li>
	<li>Monteer de monsters door de afdekplaat met de aangehechte hydrogel in een petrischaaltje van 60 mm op de AFM-scanfase te plaatsen. Voeg 3 ml PBS toe aan de schaal voordat u metingen uitvoert om te voorkomen dat de gel uitdroogt.</li>
	<li>Stel de AFM in om in contactmodus (vloeistof) te werken om de meting te starten. Schakel de bolvormige kraal in om het gelmonster continu aan te raken en op te tillen.</li>
	<li>Stel de uitkraging zo in dat de afbuigingsdrempel op 10 nm blijft. Houd de oplopende grootte van de sonde op 10 μm. Noteer vervolgens de krachtcurven zoals in stap 2.4.</li>
	<li>Verkrijg ten minste 20 krachtcurven van ten minste 3 tot 10 verschillende plekken over het oppervlak van de hydrogel.</li>
	<li>Bereken de gemiddelde Young's modulus van ~20 krachtcurves voor elke plek met AFM imaging en analyse software. Gebruik uitschuifbare hellingkrachtcurven en een lineair model (bolvormig). Bereken het gemiddelde van alle vlekken voor elk monster om de uiteindelijke stijfheid op te leveren. OPMERKING: De modulus van Young en gerelateerde gegevens(d.w.z. standaarddeviaties) worden automatisch opgeslagen als een spreadsheet.</li>
	<li>Herhaal stap 2.6-2.10 voor alle monsters.</li>
</ol>3. Moleculaire analyse van stijfheid via immunofluorescentiekleuring
<ol><li>Gebruik een pincet om de afdekplaat naar een nieuwe plaat te transporteren om valse signalen van cellen die rechtstreeks op de plaat zijn gegroeid te minimaliseren. Was de cellen driemaal met 500 μL steriel PBS om dode cellen en eventueel achtergebleven kweekmedium te verwijderen.</li>
	<li>Fixeer de cellen met 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten ongestoord bij kamertemperatuur. Spoel de cellen vervolgens drie keer opnieuw met 500 μL PBS / put gedurende 2 minuten elk. OPMERKING: Bewaren bij 4 °C voor een procedurele stop.</li>
	<li>Behandel de cellen met 500 μL van 0,1% Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens drie keer met 500 μL PBS /put.</li>
	<li>Blokkeer de cellen met 250 μL 10% ezelserum (verdund in PBS en 0,1% Tween 20) per put gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 250 μL primaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Was de cellen vervolgens drie keer met 500 μL PBS / put gedurende 5 minuten elk. OPMERKING: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) en anti-AP2 alfa (1:250) werden gebruikt in dit experiment en werden verdund in 10% ezelsserum.</li>
	<li>Incubeer de cellen met overeenkomstige secundaire antilichamen en/of falloïdine die worden gebruikt voor F-actinekleuring bij een verdunning van 1:400 in 250 μL 10% ezelserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten. OPMERKING: 568 nm falloïdine kan worden gecoïncubeerd met 488 nm of 647 nm secundaire antilichamen of op zichzelf.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:1000 verdunning) in 250 μL PBS gedurende 10 minuten gevolgd door een laatste wasbeurt van PBS gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Voeg 3-4 druppels montagemedium toe aan elke put. Bewaar de monsters bij 4 °C om ten minste 2 uur vóór het afbeelden in te stellen om ervoor te zorgen dat het montagemedium correct is ingesteld.</li>
	<li>Leg beelden vast van ten minste 3 willekeurige frames per hydrogelmonster met een fluorescentiemicroscoop, waardoor individuele en samengevoegde kanalen worden geproduceerd.</li>
</ol>4. Kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR)
<ol><li>Breng de hydrogels met de aanhangende cellen voor RNA-verzameling over naar een nieuwe plaat om ongewenst RNA van cellen die aan de celplaat zijn bevestigd te minimaliseren. Was de cellen drie keer met PBS om dode cellen en kweekmedium te verwijderen.</li>
	<li>Extraheer het totale mRNA met behulp van een RNA-extractiekit. Voer reverse-transcriptie van RNA naar cDNA uit met behulp van een reverse transcriptie supermix volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Voer RT-qPCR uit met primers voor Vcl als de stijfheidsmarker van keuze en analyseer met behulp van de 2-ΔΔCT-methode. OPMERKING: Primervolgorde van Vcl: Voorwaarts 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; omgekeerd 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het doel van de huidige studie is om een effectief en efficiënt in vitro systeem te bieden om de impact van mechanische signalen in NCC's beter te begrijpen. Naast het volgen van het hierboven genoemde stapsgewijze protocol, moeten onderzoekers in gedachten houden dat de celcultuur van O9-1 NCC's wordt beïnvloed door het type glazen afdekkingsplaten dat wordt gebruikt om hydrogels te bereiden. Er werd bijvoorbeeld opgemerkt dat cellen gezaaid op een specifiek type glazen afdekplaat (zie de tabel met mate...

Neurale crest-cellen (NCC's) zijn een groep stamcellen tijdens gewervelde embryogenese met een opmerkelijk vermogen om te migreren en bij te dragen aan de ontwikkeling van verschillende organen en weefsels. NCC's kunnen differentiëren in verschillende celtypen, waaronder sensorische neuronen, kraakbeen, bot, melanocyten en gladde spiercellen, afhankelijk van de locatie van axiale oorsprong en de lokale omgevingsrichtlijnen van de NCC1,2. Met het vermogen om te differentiëren in een breed scala aan celtypen, kunnen genetische afwijkingen die ontregeling veroorzaken in elk stadium van de ontwikkeling van de neurale top (NC) leiden tot tal van aangeboren ziekten2. Verstoringen tijdens de vorming, migratie en ontwikkeling van NCC's leiden bijvoorbeeld tot ontwikkelingsstoornissen die gezamenlijk bekend staan als neurocristopathieën1,3. Deze ziekten variëren van craniofaciale defecten als gevolg van falen in NCC-vorming, zoals het Treacher Collins-syndroom, tot de ontwikkeling van verschillende kankers als gevolg van NCC-gemetastaseerd migratievermogen, zoals te zien bij melanoom3,4,5,6. In de afgelopen decennia hebben onderzoekers opmerkelijke ontdekkingen gedaan over de rollen en mechanismen van NCC's in ontwikkeling en ziekten, waarbij de meeste bevindingen gericht zijn op chemische signalen7,8. Meer recent is aangegeven dat mechanische signalen een kritische maar slecht begrepen rol spelen in de ontwikkeling van NCC9,10.
De omgevingsfactoren van NCC's spelen een cruciale rol tijdens hun ontwikkeling, inclusief de regulering van NCC-differentiatie in verschillende celtypen. Omgevingssignalen, bijvoorbeeld fysieke signalen, beïnvloeden cruciaal gedrag en cellulaire reacties, zoals functionele diversificatie. Mechanotransductie stelt cellen in staat om die signalen te detecteren en erop te reageren om verschillende biologische processen in stand te houden2. NCC's zijn omgeven door naburige cellen en verschillende substraten, zoals de extracellulaire matrix (ECM), die aanleiding kan geven tot mechanische stimuli om de homeostase te behouden en zich aan te passen aan de veranderingen door lotbepaling, proliferatie en apoptose11. Mechanotransductie begint bij het plasmamembraan waar de sensorische component van mechanische extracellulaire stimuli optreedt, wat resulteert in de intracellulaire regulatie van de cel12. Integrinen, focale verklevingen en juncties van het plasmamembraan geven mechanische signalen, zoals schuifkrachten, spanning en de stijfheid van omliggende substraten, in chemische signalen om cellulaire reacties te produceren12. Het doorgeven van chemische signalen van het plasmamembraan naar de uiteindelijke cellulaire regulatie wordt uitgevoerd via verschillende signaalroutes om vitale processen voor het organisme, zoals differentiatie, af te ronden.
Verschillende studies hebben gesuggereerd dat mechanische signalering van substraatstijfheid een rol speelt bij celdifferentiatie13,14. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat mesenchymale stamcellen (MSC's) gekweekt op zachte substraten met een stijfheid vergelijkbaar met die van hersenweefsel (in het bereik van 0,1-1,0 kPa) resulteerden in neuronale celdifferentiatie15,16. Meer MSC's differentiëren echter in myocytachtige cellen wanneer ze worden gekweekt op 8-17 kPa-substraten die de stijfheid van spieren nabootsen, terwijl osteoblastachtige differentiatie werd waargenomen wanneer MSC's werden gekweekt op stijve substraten (25-40 kPa)15,16. Het belang van mechanotransductie wordt benadrukt door de onregelmatigheden en afwijkingen in de mechanische signaleringsroute die mogelijk leiden tot ernstige ontwikkelingsstoornissen en ziekten, waaronder kanker, hart- en vaatziekten en osteoporose17,18,19. Bij kankers is normaal borstweefsel zacht en neemt het risico op borstkanker toe in stijf en dicht borstweefsel, een omgeving die meer lijkt op borsttumoren15. Met deze kennis kunnen de effecten van mechanische signalering op de ontwikkeling van NCC worden bestudeerd door eenvoudige manipulatie van substraatstijfheid door middel van een in vitro systeem, wat verdere voordelen en mogelijkheden biedt bij het begrijpen van de fundamenten van NC-gerelateerde ziekteprogressie en etiologie.
Om de impact van mechanische signalen in NCC's te bestuderen, hebben we een efficiënt in vitro systeem voor NCC's opgezet op basis van de optimalisatie van eerder gepubliceerde methoden en evaluatie van de reacties van NCC's op verschillende mechanischesignalen 20,21. Er werd een gedetailleerd protocol verstrekt voor de voorbereiding van de variërende hydrogelstijfheid en evaluatie van de impact van mechanische signalering in NCC's. Om dit te bereiken, worden O9-1 NCC's gebruikt als het NC-model om de effecten en veranderingen in reactie op stijve versus zachte hydrogels te bestuderen. O9-1 NCC's zijn een stabiele NC-cellijn geïsoleerd uit muizenembryo (E) op dag 8,5. O9-1 NCC's bootsen NCC's in vivo na omdat ze kunnen differentiëren in verschillende NC-afgeleide celtypen in gedefinieerde differentiatiemedia22. Om de mechanische signalering van NCC's te bestuderen, werd een matrixsubstraat vervaardigd met instelbare elasticiteit van verschillende concentraties acrylamide en bis-acrylamide-oplossingen om de gewenste stijfheid te bereiken, correlerend met de biologische substraatstijfheid20,21,23. Om de omstandigheden van matrixsubstraat voor NCC's, met name O9-1-cellen, te optimaliseren, werden wijzigingen aangebracht in het eerder gepubliceerde protocol20. Een verandering in dit protocol was het incuberen van hydrogels in collageen I, verdund in 0,2% azijnzuur in plaats van 50 mM HEPES, bij 37 °C gedurende de nacht. De lage pH van azijnzuur leidt tot een homogene verdeling en een hogere collageen I-opname, waardoor een meer uniforme aanhechting van het ECM-eiwit mogelijk is24. Daarnaast werd een combinatie van paardenserum en foetaal runderserum (FBS) gebruikt in concentraties van respectievelijk 10% en 5% in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), voordat de hydrogels in de couveuse werden bewaard. Paardenserum werd gebruikt als een extra aanvulling op FBS vanwege het vermogen om celproliferatie en differentiatie te bevorderen bij een concentratie van 10%25.
Met deze methode werd een biologische omgeving nagebootst door de ECM-eiwitcoating (bijv. Collageen I) om een nauwkeurige in vitro omgeving te creëren voor NCC's om te groeien en te overleven20,21. De stijfheid van de bereide hydrogels werd kwantitatief geanalyseerd via atomic force microscopy (AFM), een bekende techniek om de elastische modulus weer te geven26. Om het effect van verschillende stijfheidsniveaus op NCC's te bestuderen, werden wild-type O9-1-cellen gekweekt en bereid op hydrogels voor immunofluorescentie (IF) kleuring tegen filamenteuze actine (F-actine) om de verschillen in celadhesie en morfologieën aan te tonen als reactie op veranderingen in substraatstijfheid. Met behulp van dit in vitro systeem zullen onderzoekers in staat zijn om de rol van mechanische signalering in NCC's en de interactie met andere chemische signalen te bestuderen om een dieper inzicht te krijgen in de relatie tussen NCC's en mechanische signalering.

<table><tbody><tr><td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-012</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-Acrylamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662165</td><td></td></tr><tr><td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-025</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>4-well cell culture plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>J61899-AP</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>50% glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>6-well cell culture plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>AFM cantilever (bolvormige kraal)</td><td>Novascan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM software</td><td>Catalyst NanoScope</td><td></td><td>Model: 8.15 SR3R1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>248614</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>anti-AP-2&alpha; Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-12726</td><td></td></tr><tr><td>anti-Vinculin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I (100mg)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-fenylindoldihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethylsilane (DCMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440272</td><td></td></tr><tr><td>Donkey serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Leica</td><td></td><td>Model DMi8</td></tr><tr><td>Fluoromount-G montagemedium</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-35</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Corning</td><td>35-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin antibioticum</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 1x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Steriele gedeïoniseerd water</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>U284</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472908</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

een geoptimaliseerd o9-1/hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neurale crest-cellen (NCC's) zijn embryonale multipotente cellen van gewervelde dieren die kunnen migreren en differentiëren in een breed scala aan celtypen die aanleiding geven tot verschillende organen en weefsels. Weefselstijfheid produceert mechanische kracht, een fysieke aanwijzing die een cruciale rol speelt bij NCC-differentiatie; het mechanisme blijft echter onduidelijk. De hier beschreven methode biedt gedetailleerde informatie voor de geoptimaliseerde generatie van polyacrylamidehydrogels met verschillende stijfheid, de nauwkeurige meting van dergelijke stijfheid en de evaluatie van de impact van mechanische signalen in O9-1-cellen, een NCC-lijn die in vivo NCC's nabootst.
Hydrogelstijfheid werd gemeten met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM) en gaf dienovereenkomstig verschillende stijfheidsniveaus aan. O9-1 NCC's gekweekt op hydrogels met verschillende stijfheid vertoonden verschillende celmorfologie en genexpressie van stressvezels, wat duidde op verschillende biologische effecten veroorzaakt door mechanische signaalveranderingen. Bovendien werd vastgesteld dat het variëren van de hydrogelstijfheid resulteerde in een efficiënt in vitro systeem om mechanische signalering te manipuleren door de gelstijfheid te veranderen en de moleculaire en genetische regulatie in NCC's te analyseren. O9-1 NCC's kunnen differentiëren in een breed scala aan celtypen onder invloed van de overeenkomstige differentiatiemedia, en het is handig om chemische signalen in vitrote manipuleren . Daarom is dit in vitro systeem een krachtig hulpmiddel om de rol van mechanische signalering in NCC's en de interactie met chemische signalen te bestuderen, wat onderzoekers zal helpen de moleculaire en genetische mechanismen van de ontwikkeling en ziekten van de neurale top beter te begrijpen.

Hydrogelvoorbereiding en stijfheidsbeoordeling via AFM en het Hertz-model Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om polyacrylamidehydrogels van verschillende stijfheid te genereren door de verhouding acrylamide en bis-acrylamide te reguleren. De polyacrylamide hydrogels zijn echter niet klaar voor de hechting van cellen vanwege het gebrek aan ECM-eiwitten. Sulfo-SANPAH, dat als linker fungeert, bindt dus covalent aan de hydrogels en reageert met de primaire amines van ECM-eiwitten om de <...

Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

De methode helpt bij de studie van de mechanische signalering van de neurale crest-cellen en de interactie met chemische signalen. Het kan ook helpen bij de moleculaire en genetische mechanismen van de ontwikkeling van de neurale top bij ziekten. Het overbrengen van de glassportreten is het meest uitdagend, daarom breng je ze langzaam en aandachtig over om te voorkomen dat ze breken en vallen.De procedure wordt gedemonstreerd door mij en Dr. Sherry Zhao, een postdoctoraal fellow uit mijn laboratorium. Begin met het plaatsen van het gewenste aantal glazen afdeksels op een stuk laboratoriumdoekje. Steriliseer vervolgens elke afdekplaat door deze heen en weer te laten gaan door de vlam van de alcoholbrander.Wanneer de afdekking afkoelt, bedek u de afdekslip van 12 millimeter met ongeveer 200 microliter en de afdekslip van 25 millimeter met 800 microliter 0,1 molair natriumhydroxide. Zuig na vijf minuten natriumhydroxide op en laat de afdeksels vijf minuten aan de lucht drogen om een gelijkmatige film te vormen. Zodra de afdekslips zijn gedroogd, voegt u ongeveer 18 microliter aminopropyltriethoxysilaan of APTS toe aan een afdekslip van 12 millimeter en 150 microliter APTS aan een afdekslip van 25 millimeter.Aspiraat toegang tot APTS om de resterende APTS vijf minuten te laten drogen. Spoel de afdekzeilen driemaal af door ze telkens vijf minuten onder te dompelen in steriel gedeïoniseerd water. Verplaats de gewassen hoesjes naar een verse petrischaal met de reactieve kant naar boven gericht.En behandel de afdekslip door gedurende 30 minuten voldoende 0,5% glutaaraldehyde in te weken. Na het aanzuigen van het glutaaraldehyde spoelt u de afdekplaat eenmaal drie minuten af met gedeïoniseerd water en droogt u de afdekking aan de lucht met de reactieve kant naar boven. Om de gesiliconiseerde afdekslips voor te bereiden, plaatst u het gelijke aantal afdekslips als die met aminosilane gecoate afdekplaat in een petrischaaltje bekleed met parafilm.Behandel vervolgens de 12 millimeter afdekslips met 40 microliter en 25 millimeter afdekslips met 150 microliter dichloormethaansilaan of DCMS gedurende vijf minuten. Was de afdekslipjes eenmaal gedurende één minuut met steriel gedeïoniseerd water voordat u de reactieve afdekslipjes met de voorkant naar boven op een laboratoriumdoekje plaatst. Om de hydrogels te bereiden, pipetteer vers bereide acrylamidegeloplossing op de gedroogde aminosilaan gecoate afdekslips.Breng met behulp van een gebogen pincet onmiddellijk de dcms-behandelde afdekslip over op de geloplossing met de behandelde zijde die de geloplossing raakt, waardoor de geloplossing tussen twee afdekslips wordt gesandwicht. Zodra de gel is gepolymeriseerd, scheidt u de met DCMS behandelde afdekslip met een gebogen pincet, waardoor de gel aan de met aminosilane gecoate afdekslip blijft zitten. Dompel vervolgens de 12 millimeter afdekslip met de bijgevoegde hydrogel onder in een vooraf bepaalde 4-well of 24-well plaat bedekt met 500 microliter steriel PBS of gedeïoniseerd water en de 25 millimeter cover slip in een 6-well plaat bedekt met twee milliliter steriel PBS of gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten.Na het verwijderen van overtollig acrylamide-oplossing, bewaar de hydrogels in steriel PBS of gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aspirateer later PBS of gedeïoniseerd water uit de putplaat voordat u Sulfo-succinimydyl of Sulfo-SUNPAH-oplossing toevoegt om de gel volledig te bedekken. En plaats de gels met de oplossing onder een 15 watt, 365 nanometer ultraviolet licht onbedekt gedurende 10 minuten.Verzamel zoveel mogelijk van de Sulfo-SANPAH per oplossing door de plaat te kantelen. En was de gel vervolgens twee tot drie keer met 15 millimolaire HEPES. Voeg 15 milligram per milliliter Collageen 1 verdund in 0,2% azijnzuur toe aan elke put die de hydrogel bevat.En incubeer de gels 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voer de volgende dag de was uit zoals beschreven in het manuscript voordat u de hydrogels incubeert met PBS met 10% paardenserum en 5% FBS bij 37 Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg na twee uur incubatie 500 microliter steriel gefilterd DMEM met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine toe aan elke put en bewaar de gels bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Wanneer de celkweek klaar is, plaat ongeveer 1,5 maal 10 tot de vierde 09-1 cellen per centimeter in het kwadraat in het basismedium. Gebruik een pincet om de afdeksels naar een nieuwe plaat te transporteren om valse signalen van de cellen die rechtstreeks op de plaat zijn gegroeid te minimaliseren. Fixeer vervolgens de cellen met 500 microliter 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten voordat u de cellen behandelt met 500 microliter van 0,1% Triton X-100 bij kamertemperatuur.Loop na 15 minuten door de cellen met 250 microliter 10% ezelserum. Kleur de cellen voor F-actine met felodipine bij een verdunning van 1 tot 400 in 250 microliter 10% ezelsserum, gevolgd door incubatie met DAPI gedurende 10 minuten. Was de cellen twee minuten met PBS voordat u drie tot vier druppels bevestigingsmedium aan elke put toevoegt.Leg op een fluorescentiemicroscoop de beelden vast van ten minste drie willekeurige frames per hydrogelmonster dat individuele en samengevoegde kanalen produceert. Bij de stijfheidsbeoordeling van de hydrogel door middel van atoomkrachtmicroscopie of AFM was de helling van de krachtcurve zacht voor zachte hydrogels omdat de vereiste kracht van de AFM-sonde minder was. Op stijve hydrogels was de gegenereerde helling echter veel steiler.De AFM-metingen werden vervolgens gebruikt om de gemiddelde stijfheid van hydrogels uit de elastische modulus van Young in kilopascals te berekenen. De groeikenmerken van P19- en 09-1-cellen werden waargenomen in één kilopascal en 40 kilopascals hydrogels van controle- en gemodificeerde gelsystemen. De 09-1 cellen gekweekt op de oorspronkelijke gelsystemen resulteerden in een hoger aantal dode cellen.Daarentegen vertoonden de 09-1 cellen gekweekt op de gemodificeerde gelsystemen een gezonde celgroei en voldoende hechting aan het hydrogelssubstraat met weinig celdek aangegeven door minimale ronde cellen. De P19-cellen op beide hydrogelsystemen vertoonden een overmaat aan ronde drijvende cellen en een gebrek aan celsubstraataanhechtingen. De compatibiliteit van neurale crest-cellen of NCC's met het gemodificeerde hydrogelsysteem werd beoordeeld door immunofluorescente kleuring voor AP-2.Een significante toename van AP-2-expressie in 09-1-cellen op het gemodificeerde hydrogelsysteem werd waargenomen. Bovendien vertoonden de 09-1-cellen verschillende morfologieën op basis van de hydrogels met lage of hoge stijfheid door verschillende hoeveelheden van de stressvezels. De anti-vinculine-expressie in 09-1 cellen gekweekt op de 40 kilopascals hydrogel was hoger dan die gekweekt op de hydrogel van één kilopascal, wat aangeeft dat de cellen die op zachtere substraten worden gekweekt minimale focale toevoegingscomplexen vormen dan het stijve substraat.De juiste wachttijd is cruciaal voor de polymerisatie van de hydrogels, omdat acrylamiden giftig zijn voor de cellen. Dompel de hydrogels minstens 30 minuten onder in PBS of gedeïoniseerd water om betere resultaten te garanderen.

an-optimized-o9-1hydrogel-system-for-studying-mechanical-signals

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.

Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device

In this video, we describe the procedure to perform fluorescence staining using fluorescence microscopy to demonstrate phalloidin staining of neural crest cells cultured on hydrogels of varying stiffness to visualize and analyze cytoskeletal organization.

Fluorescence Staining of Neural Crest Cells Cultured on Hydrogels of Varying Stiffness

We presenteren een nieuw polyacrylamide hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM, die een directe binding van ECM eiwitten mogelijk maakt met minimale kosten of deskundigheid. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogels met microcontactprinten vergemakkelijkt onafhankelijke controle van de vele signalen van de natuurlijke cel micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire mechanostransduction.

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze "levende steigers", het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

Dit protocol beschrijft een fysiologisch relevante, hydrofoor vloeistof aanpak voor snelle en omkeerbare inductie van varicosities in de neuronen.

Een Microbiomechanical systeem voor het bestuderen van de vorming van de Varicosity en herstel in Midden Neuron axonen

O9-1 is een cellijn van multipotente muis crest van de neurale. Hier beschrijven we gedetailleerde stapsgewijze protocollen voor kweken O9-1 cellen, O9-1 cellen in specifieke celtypes te differentiëren en genetisch manipuleren O9-1 cellen met behulp van siRNA-gemedieerde knockdown of bewerken van CRISPR-Cas9-genoom.

Kweken en manipulatie van O9-1 neurale kamcellen

Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Dit protocol beschrijft de dissectie en de cultuur van craniale neurale Crest cellen van muismodellen, voornamelijk voor de studie van de Celmigratie. We beschrijven de gebruikte technieken voor Live Imaging en de analyse van veranderingen in snelheid en celvorm.

Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie

Deze methodologie heeft tot doel de mechanismen te illustreren waarmee extracellulaire matrixsignalen zoals substraatstijfheid, eiwitsamenstelling en celmorfologie het fenotype van Schwann-cel (SC) reguleren.

Voorbereiding van Tunable Extracellular Matrix Microenvironments om Schwann Cell Phenotype Specification te evalueren

Dit protocol schetst een in vitro migratie-experiment dat geschikt is voor de functionele analyse van de moleculen die betrokken zijn bij de in vivo migratie van neurale topcellen naar de hyaluronrijke extracellulaire matrix.

In vitro Onderzoek naar de effecten van de hyaluronaatrijke extracellulaire matrix op neurale topcelmigratie

Leer mechanische signalen in neurale crest-cellen bestuderen met een geoptimaliseerd O9-1/hydrogel-systeem. Deze methode onthult interacties tussen mechanische en chemische signalen tijdens de ontwikkeling.

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

Meer video's verkennen