Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

De methode helpt bij de studie van de mechanische signalering van de neurale crest-cellen en de interactie met chemische signalen. Het kan ook helpen bij de moleculaire en genetische mechanismen van de ontwikkeling van de neurale top bij ziekten. Het overbrengen van de glassportreten is het meest uitdagend, daarom breng je ze langzaam en aandachtig over om te voorkomen dat ze breken en vallen.

De procedure wordt gedemonstreerd door mij en Dr. Sherry Zhao, een postdoctoraal fellow uit mijn laboratorium. Begin met het plaatsen van het gewenste aantal glazen afdeksels op een stuk laboratoriumdoekje. Steriliseer vervolgens elke afdekplaat door deze heen en weer te laten gaan door de vlam van de alcoholbrander.

Wanneer de afdekking afkoelt, bedek u de afdekslip van 12 millimeter met ongeveer 200 microliter en de afdekslip van 25 millimeter met 800 microliter 0,1 molair natriumhydroxide. Zuig na vijf minuten natriumhydroxide op en laat de afdeksels vijf minuten aan de lucht drogen om een gelijkmatige film te vormen. Zodra de afdekslips zijn gedroogd, voegt u ongeveer 18 microliter aminopropyltriethoxysilaan of APTS toe aan een afdekslip van 12 millimeter en 150 microliter APTS aan een afdekslip van 25 millimeter.

Aspiraat toegang tot APTS om de resterende APTS vijf minuten te laten drogen. Spoel de afdekzeilen driemaal af door ze telkens vijf minuten onder te dompelen in steriel gedeïoniseerd water. Verplaats de gewassen hoesjes naar een verse petrischaal met de reactieve kant naar boven gericht.

En behandel de afdekslip door gedurende 30 minuten voldoende 0,5% glutaaraldehyde in te weken. Na het aanzuigen van het glutaaraldehyde spoelt u de afdekplaat eenmaal drie minuten af met gedeïoniseerd water en droogt u de afdekking aan de lucht met de reactieve kant naar boven. Om de gesiliconiseerde afdekslips voor te bereiden, plaatst u het gelijke aantal afdekslips als die met aminosilane gecoate afdekplaat in een petrischaaltje bekleed met parafilm.

Behandel vervolgens de 12 millimeter afdekslips met 40 microliter en 25 millimeter afdekslips met 150 microliter dichloormethaansilaan of DCMS gedurende vijf minuten. Was de afdekslipjes eenmaal gedurende één minuut met steriel gedeïoniseerd water voordat u de reactieve afdekslipjes met de voorkant naar boven op een laboratoriumdoekje plaatst. Om de hydrogels te bereiden, pipetteer vers bereide acrylamidegeloplossing op de gedroogde aminosilaan gecoate afdekslips.

Breng met behulp van een gebogen pincet onmiddellijk de dcms-behandelde afdekslip over op de geloplossing met de behandelde zijde die de geloplossing raakt, waardoor de geloplossing tussen twee afdekslips wordt gesandwicht. Zodra de gel is gepolymeriseerd, scheidt u de met DCMS behandelde afdekslip met een gebogen pincet, waardoor de gel aan de met aminosilane gecoate afdekslip blijft zitten. Dompel vervolgens de 12 millimeter afdekslip met de bijgevoegde hydrogel onder in een vooraf bepaalde 4-well of 24-well plaat bedekt met 500 microliter steriel PBS of gedeïoniseerd water en de 25 millimeter cover slip in een 6-well plaat bedekt met twee milliliter steriel PBS of gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten.

Na het verwijderen van overtollig acrylamide-oplossing, bewaar de hydrogels in steriel PBS of gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aspirateer later PBS of gedeïoniseerd water uit de putplaat voordat u Sulfo-succinimydyl of Sulfo-SUNPAH-oplossing toevoegt om de gel volledig te bedekken. En plaats de gels met de oplossing onder een 15 watt, 365 nanometer ultraviolet licht onbedekt gedurende 10 minuten.

Verzamel zoveel mogelijk van de Sulfo-SANPAH per oplossing door de plaat te kantelen. En was de gel vervolgens twee tot drie keer met 15 millimolaire HEPES. Voeg 15 milligram per milliliter Collageen 1 verdund in 0,2% azijnzuur toe aan elke put die de hydrogel bevat.

En incubeer de gels 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voer de volgende dag de was uit zoals beschreven in het manuscript voordat u de hydrogels incubeert met PBS met 10% paardenserum en 5% FBS bij 37 Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg na twee uur incubatie 500 microliter steriel gefilterd DMEM met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine toe aan elke put en bewaar de gels bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Wanneer de celkweek klaar is, plaat ongeveer 1,5 maal 10 tot de vierde 09-1 cellen per centimeter in het kwadraat in het basismedium. Gebruik een pincet om de afdeksels naar een nieuwe plaat te transporteren om valse signalen van de cellen die rechtstreeks op de plaat zijn gegroeid te minimaliseren. Fixeer vervolgens de cellen met 500 microliter 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten voordat u de cellen behandelt met 500 microliter van 0,1% Triton X-100 bij kamertemperatuur.

Loop na 15 minuten door de cellen met 250 microliter 10% ezelserum. Kleur de cellen voor F-actine met felodipine bij een verdunning van 1 tot 400 in 250 microliter 10% ezelsserum, gevolgd door incubatie met DAPI gedurende 10 minuten. Was de cellen twee minuten met PBS voordat u drie tot vier druppels bevestigingsmedium aan elke put toevoegt.

Leg op een fluorescentiemicroscoop de beelden vast van ten minste drie willekeurige frames per hydrogelmonster dat individuele en samengevoegde kanalen produceert. Bij de stijfheidsbeoordeling van de hydrogel door middel van atoomkrachtmicroscopie of AFM was de helling van de krachtcurve zacht voor zachte hydrogels omdat de vereiste kracht van de AFM-sonde minder was. Op stijve hydrogels was de gegenereerde helling echter veel steiler.

De AFM-metingen werden vervolgens gebruikt om de gemiddelde stijfheid van hydrogels uit de elastische modulus van Young in kilopascals te berekenen. De groeikenmerken van P19- en 09-1-cellen werden waargenomen in één kilopascal en 40 kilopascals hydrogels van controle- en gemodificeerde gelsystemen. De 09-1 cellen gekweekt op de oorspronkelijke gelsystemen resulteerden in een hoger aantal dode cellen.

Daarentegen vertoonden de 09-1 cellen gekweekt op de gemodificeerde gelsystemen een gezonde celgroei en voldoende hechting aan het hydrogelssubstraat met weinig celdek aangegeven door minimale ronde cellen. De P19-cellen op beide hydrogelsystemen vertoonden een overmaat aan ronde drijvende cellen en een gebrek aan celsubstraataanhechtingen. De compatibiliteit van neurale crest-cellen of NCC's met het gemodificeerde hydrogelsysteem werd beoordeeld door immunofluorescente kleuring voor AP-2.

Een significante toename van AP-2-expressie in 09-1-cellen op het gemodificeerde hydrogelsysteem werd waargenomen. Bovendien vertoonden de 09-1-cellen verschillende morfologieën op basis van de hydrogels met lage of hoge stijfheid door verschillende hoeveelheden van de stressvezels. De anti-vinculine-expressie in 09-1 cellen gekweekt op de 40 kilopascals hydrogel was hoger dan die gekweekt op de hydrogel van één kilopascal, wat aangeeft dat de cellen die op zachtere substraten worden gekweekt minimale focale toevoegingscomplexen vormen dan het stijve substraat.

De juiste wachttijd is cruciaal voor de polymerisatie van de hydrogels, omdat acrylamiden giftig zijn voor de cellen. Dompel de hydrogels minstens 30 minuten onder in PBS of gedeïoniseerd water om betere resultaten te garanderen.