Name: Driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie als leverregeneratiestrategie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Leer driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie voor leverregeneratie in een fibrotisch rattenmodel. Deze methode bevordert weefselherstel zonder leverfunctie te verstoren en biedt een veelbelovende therapeutische optie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen het personeel van de Laboratory Animal Facility van de Experimental Medicine Unit, verpleegster Carolina Baños G. voor technische en chirurgische ondersteuning, Marco E. Gudiño Z. voor ondersteuning bij microfotografen en Erick Apo voor ondersteuning in lever histologie bedanken. De Nationale Raad ondersteunde dit onderzoek voor Wetenschap en Technologie(CONACyT),subsidienummer SALUD-2016-272579 en de PAPIIT-UNAM TA200515.

Het huidige onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van de School of Medicine (DI/115/2015) aan de Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en de ethische commissie van het Hospital General de Mexico (CI/314/15). De instelling voldoet aan alle technische specificaties voor de productie, verzorging en het gebruik van proefdieren en is wettelijk gecertificeerd door de nationale wetgeving (NOM-062-ZOO-1999). Mannelijke Wistar-ratten met een gewicht van 150-250 g (6-8 weken oud) werden voor deze studie verkregen van de Laboratory Animal Facility van de School of Medicine, UNAM.
1. Collageenmatrixsteigers verkrijgen uit runderdijbeen
<ol><li>Verkrijg de condyle van runderdijbeen uit een slachthuis dat is gecertificeerd door de gezondheids- en landbouwautoriteiten van Mexico.<ol>
<li>Ontleed zorgvuldig het condylevet, de spier en het kraakbeen met een chirurgisch instrument. Snijd de condylefragmenten met een zaagsnijder in fragmenten van 3 cm x3 cm en reinig het vet en bloed met een handdoek. Was de condylefragmenten met water.</li>
		<li>Kook (92 °C) de fragmenten met 1 l anionisch des wasmiddel (10 g/L) gedurende 30 minuten. Was de condylefragmenten tweemaal om eventuele resten van het anionische reinigingsmiddel te verwijderen.</li>
		<li>Droog de condylefragmenten gedurende 3 uur met filtreerpapier (0,5 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid een driehoekig (1 cm x 1 cm x1 cm) CMS van dikte 0,5 cm uit de fragmenten vermeld in stap 1.1 (Figuur 1A).<ol>
<li>Demineraliseer de fragmenten in 100 ml van 0,5 M HCl gedurende 10 minuten met constante agitatie. Verwijder de HCl. OPMERKING: Neutraliseer de HCl met natriumhydroxide (10 M).</li>
		<li>Spoel de fragmenten drie keer met 100 ml gedestilleerd water, telkens 15 minuten, met constante agitatie. Droog het CMS met filtreerpapier (0,5 mm) gedurende 1 uur.</li>
		<li>Gebruik een stereomicroscoop15 om de structurele eigenschappen van het CMS te analyseren (grootte van de poriën, porievorming en poreuze interconnectie) (Figuur 1B).</li>
		<li>Gebruik een scanning elektronenmicroscoop16 om het ruwe oppervlak van de CMS trabeculae te analyseren(Figuur 1C).</li>
		<li>Gebruik het dissectie-instrument voor mengen en uitrekken om de mechanische veranderingen (plasticiteit en flexibiliteit) van het CMS te evalueren(figuur 1D).</li>
		<li>Verpak het CMS in het sterilisatiezakje en steriliseer het gedurende 38 minuten met waterstofperoxideplasma. Bewaar het steriele CMS in de originele verpakking in een droge ruimte bij 20-25 °C tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorbereiding van het operatiegebied en behandeling en voorbereiding van het diermodel
<ol><li>Ontsmet het operatiegebied, de werktafel, de microchirurgische microscoop en de zitting met 2% chloorhexidine-oplossing. Steriliseer alle chirurgische instrumenten, chirurgische spons, wattenstaafjes en wegwerpchirurgisch gordijn door middel van warmtesterilisatie (121 °C/30 min/100 kPa)</li>
	<li>Wijs de ratten (n= 5) toe aan drie groepen van vijf ratten per groep: 1. sham, 2. hepatectomie en 3. hepatectomie plus CMS, en volg alle groepen op dag 3, 14 en 21 dagen.<ol>
<li>Dien ketamine (35 mg/kg) en xylazine (2,5 mg/kg) intramusculair toe in de achterpoot. OPMERKING: De kalmerende periode duurt meestal 30-40 minuten.</li>
		<li>Scheer de buikhuid (5 cm x 2 cm) met chirurgische zeep en een tweesnijdend mes en desinfecteer de huid met actuele 10% povidon-jodiumoplossing in drie rondes17.</li>
		<li>Plaats het dier op een warme plaat in de dorsale positie van de decubitus, met de nek hyperextended om een doorlaatbare luchtweg te behouden (figuur 2).</li>
		<li>Evalueer de diepte van de anesthesie door het ademhalingspatroon en het verlies van de ontwenningsreflex in de ledematen.</li>
		<li>Plaats een wegwerpchirurgisch gordijn rond de geschoren huid en maak een incisie (2,5 cm) op de albeuze lijn met een scalpel, met het xiphoid-proces als referentiepunt. Vermijd het bloedvat van de buikwand om bloedingen te voorkomen.</li>
		<li>Plaats de abdominale retractor op zijn plaats en observeer de buikholte. Gebruik de dissectie-tang om de linker leverkwab te extraheren en op de metalen plaat te plaatsen(figuur 3A). OPMERKING: In de schijngroep, extraheer alleen de linker leverkwab en breng de lever vervolgens terug naar de buikholte. Hecht de buikwand en huid met een 3-0 nylon hechting.</li>
		<li>Gebruik in de experimentele groepen met en zonder CMS een scalpelmes en steriel scalpelmes (# 15) om hepatectomie (ongeveer 40%) uit te voeren met twee sneden. Gebruik een driehoekige metalen sjabloon (1 cm x 1 cm x 1 cm) om de hepatectomie uit te voeren(figuur 3B).</li>
		<li>Om bloedingen van de lever te voorkomen, handhaaft u de chirurgische compressie met een wattenstaafje aan de rand van de lever gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Hydrateer het CMS in steriele zoutoplossing gedurende 20 minuten vóór de chirurgische ingreep. Implanteer het CMS op de hepatectomieplaats met vier hechtingen tussen het leverweefsel en het CMS om verplaatsing van het biomateriaal te voorkomen. Gebruik 7-0 niet-absorbeerbare polypropyleen hechtingen(figuur 3C). OPMERKING: Verwijder de hechtingen niet bij een tweede operatie; hechtingen kunnen worden gebruikt als referentie om de plaats van CMS-implantatie te identificeren.</li>
		<li>Breng de lever terug naar de buikholte en hecht de buikwand en de huid met een 3-0 nylon hechting. Reinig de chirurgische incisie met een chirurgische jodium-gedrenkte spons in twee rondes. Observeer en bewaak de vitale functies van de dieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Postoperatieve zorg
<ol><li>Dien meglumine flunixine (2,5 mg/kg) intramusculair toe in de achterpoot. Analgetica toedienen zoals goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.</li>
	<li>Voor anesthesieherstel plaatst u de dieren in individuele polycarbonaatdozen met laboratoriumdierstrooisel in een geruisvrije ruimte met temperatuurregeling (23 °C).</li>
	<li>Observeer het herstel van de dieren en controleer hun water- en voedselconsumptie gedurende 2 uur. Bewaak dieren postoperatief zoals goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.</li>
</ol>4. Evaluatie van de leverfunctie in serum
<ol><li>Verzamel bloedmonsters (500 μL) van de laterale staartaderen van de verdoofde dieren vóór de chirurgische ingreep (uitgangswaarden) en op evaluatiedagen 3, 14 en 21.</li>
	<li>Centrifugeer de bloedmonsters bij 850 × g/10 min bij kamertemperatuur (23 °C); scheid het serum en bewaar het bij -80°C tot gebruik.</li>
	<li>Voer een panel van leverfunctietests uit: serumalbumine (ALB), alkalische fosfatase (ALP), alanineaminotransferase (ALAT), aspartaataminotransferase (ASAT), totaal bilirubine (TB) en direct bilirubine (DB) (tabel 1).</li>
</ol>5. Euthanasie en weefselmanagement
<ol><li>Verdoof de dieren voor elke evaluatie (dag 3, 14 en 21) door het hierboven beschreven protocol te volgen.</li>
	<li>Euthanaseer via methoden die zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.</li>
	<li>Voer een incisie (5-6 cm) uit op de albeuze lijn met een scalpel om de organen van de buikholte te observeren en foto's te maken van het hepatectomiegebied van de sham en de experimentele groepen, met en zonder het CMS.</li>
	<li>Neem levermonsters (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) van alle dieren in de onderzoeksgroep en plaats ze gedurende 24 uur in een 4% formaldehyde-oplossing voor daaropvolgende histologische evaluatie.</li>
</ol>6. Histologische analyse
<ol><li>Bewaar de leverweefsels in 4% formaldehyde en droger het weefsel uit met behulp van een reeks alcoholconcentraties (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); plaats ze in xyleen (1 uur) en ingebed ze in paraffine16.</li>
	<li>Snijd de paraffineblokken met een microtoom in 4 μm dikke secties voor de voorbereiding van acht dia's.</li>
	<li>Voer H&E en Masson's trichrome kleuringuit 16.</li>
	<li>Observeer de gekleurde secties onder een lichtmicroscoop om de representatieve gebieden van de lever te selecteren, met en zonder CMS. Verkrijg fotomicrografen met een vergroting van 4x, 10x en 40x en verwerk de afbeeldingen met behulp van de juiste software18 (zie de tabel met materialen).</li>
</ol>

<ol><li>Li, N., Hua, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Immune cells in liver regeneration.</a> Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).</li>
<li>Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering.</a> Science. 260 (5110), 920-926 (1993).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+liver+decellularized+extracellular+matrix+bioink+for+three-dimensional+cell+printing-based+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Shafiee, A., Atla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Toward+a+new+era+of+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Toward a new era of medicine.</a> Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).</li>
<li>Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+derivatives+effectively+promotes+liver+regeneration+to+attenuate+acetaminophen-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88(2020).</li>
<li>Sancho-Bru, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+possibilities+of+stem+cells+in+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterologia+y+Hepatologia%22%5BJournal%5D)">Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases.</a> Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).</li>
<li>Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+Identification%2C+phenotypic+characterization%2C+biological+properties+and+potential+for+regenerative+medicine+through+biomaterial+micro-engineering+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche.</a> Methods. 99, 62-68 (2016).</li>
<li>Freedman, B. R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+to+mimic+and+heal+connective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials to mimic and heal connective tissues.</a> Advanced Materials. 31 (19), 1806695(2019).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+collagen+based+biomaterials+and+the+resulting+materials+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties.</a> Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24(2019).</li>
<li>El Baz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplant+of+hepatocytes%2C+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells%2C+and+in+vitro+hepatocyte-differentiated+mesenchymal+stem+cells+in+a+chronic+lver+failure+experimental+model%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).</li>
<li>Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+multiple+osteogenic+differentiation+pathways+of+mesenchymal+stem+cells+through+different+scaffold+configurations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).</li>
<li>Chan, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+collagen+scaffold+promotes+intrinsic+vascularisation+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications.</a> PLoS One. 11 (2), 0149799(2016).</li>
<li>Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+for+whole+organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularization for whole organ bioengineering.</a> Biomedical Materials. 8 (1), 014106(2013).</li>
<li>Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+decellularized+extracellular+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomedical Materials. 11 (2), 022003(2016).</li>
<li>Gacek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo+microscope%2C+neglected+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochemii%22%5BJournal%5D)">Stereo microscope, neglected tool.</a> Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).</li>
<li>Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+survivable+liver+biopsy+procedure+in+mice+to+assess+non-alcoholic+steatohepatitis+%28NASH%29+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).</li>
<li>The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Use+of+Chemical+Depilatory+Agents+on+Laboratory+Animals%22">Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://research.utexas.edu">https://research.utexas.edu</a> (2021).</li>
<li>Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+learning+in+neural+net+models+with+Poisson+and+Gauss+connectivities%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Networks%22%5BJournal%5D)">The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities.</a> Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).</li>
<li>León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physico-chemical+characterization+of+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).</li>
<li>León, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematological+and+biochemical+parameters+in+Sprague+Dawley+laboratory+rats+breed+in+CENPALAB%2C+Cenp%3ASPRD%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Electronica+de+Veterinaria%22%5BJournal%5D)">Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD.</a> Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).</li>
<li>Tsuchiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapies+for+liver+cirrhosis%3A+MSCs+as+%22conducting+cells%22+for+improvement+of+liver+fibrosis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 18(2019).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
<li>Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Universidad+Nacional+Aut%C3%B3noma+de+M%C3%A9xico%22">Universidad Nacional Autónoma de México</a>. , Specialty of Urology thesis (2011).</li>
<li>Montalvo-Jave, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbable+bioprosthesis+for+the+treatment+of+bile+duct+injury+in+an+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model.</a> International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. Benjamín León-Mancilla is een doctoraatsstudent van het Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en hij ontving dgapa-unam fellowship.

Orgaantransplantatie is de steunpilaar van de behandeling bij patiënten met leverfibrose of cirrose. Enkele patiënten hebben baat bij deze procedure, waardoor het noodzakelijk is om therapeutische alternatieven te bieden voor patiënten op de wachtlijst. Tissue engineering is een veelbelovende strategie die gebruik maakt van steigers en cellen met regeneratief potentieel2,4,13. Het verwijderen van een deel van de lever is een kri...

De lever is een van de belangrijkste organen die betrokken zijn bij het handhaven van homeostase en eiwitproductie1. Helaas is leverziekte wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. In gevorderde stadia van leverschade, waaronder cirrose en hepatocellulair carcinoom, is levertransplantatie de klinisch aanbevolen procedure. Vanwege de schaarste aan donoren en het lage aantal succesvolle transplantaties zijn echter nieuwe technieken in tissue engineering (TE) en regeneratieve geneeskunde (RM) ontwikkeld2,3.
TE omvat het gebruik van stamcellen, steigers en groeifactoren4 om het herstel van ontstoken, fibrotische en oedemateuze organen en weefsels te bevorderen1,5,6. De biomaterialen die in steigers worden gebruikt, bootsen de inheemse ECM na en bieden de fysische, chemische en biologische aanwijzingen voor geleide cellulaire remodellering7. Collageen is een van de meest voorkomende eiwitten verkregen uit de dermis, pees, darm en pericard8,9. Bovendien kan collageen worden verkregen als een biopolymeer om twee- en driedimensionale steigers te produceren door middel van bioprinting of elektrospinning10,11. Deze groep is de eerste die het gebruik van collageen uit een botbron voor de regeneratie van leverweefsel meldt. Een andere studie meldt het gebruik van steigers gesynthetiseerd uit rundercollageen, dat werd verkregen uit de huid, met homogene en dicht bij elkaar gelegen poriën, zonder enige communicatie tussen hen12.
Decellularisatie behoudt de inheemse ECM, waardoor de daaropvolgende integratie van cellen met stamcelpotentiaal13,14mogelijk is. Deze procedure bevindt zich echter nog steeds in de experimentele fase in de lever, het hart, de nieren, de dunne darm en de urineblaas van muizen, ratten, konijnen, varkens, schapen, runderen en paarden3,14. Momenteel wordt het gereseceerde levermassavolume niet vervangen in een van de dierhepatectomiemodellen. Het gebruik van extra ondersteuning of netwerk (biomaterialen) dat celproliferatie en angiogenese mogelijk maakt, kan echter essentieel zijn voor het snelle herstel van leverparenchymale functies. Steigers kunnen dus worden gebruikt als alternatieve benaderingen om weefsel te regenereren of te herstellen bij chronische leverziekten, waardoor beperkingen als gevolg van donatie en de klinische complicaties van levertransplantatie worden geëlimineerd.

<table><tbody><tr><td>Anodisch wasmiddel</td><td>Alconox</td><td>Z273228</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie cassettes</td><td>Leica</td><td>3802453</td><td></td></tr><tr><td>Camera DMX</td><td>Nikon</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine gluconate 4%</td><td>BD</td><td>372412</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes 25 mm x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-224</td><td></td></tr><tr><td>Eosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>200-M</td><td>CAS 17372-87-1</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol, puur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>CAS 64-17-5</td></tr><tr><td>Flunixine meglumide</td><td>MSD</td><td>Q-0273-035</td><td></td></tr><tr><td>Glijbanen 75 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>101081022</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylinen</td><td>Merck</td><td>H9627</td><td>CAS 571-28-2</td></tr><tr><td>Zoutzuur 37%</td><td>Merck</td><td>339253</td><td>CAS 7647-01-0</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Pisa agropecuaria</td><td>Q-7833-028</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Nikon</td><td>Microphoto-FXA</td><td></td></tr><tr><td>Microchirurgie stereomicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>OPMI F170</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer gele cape</td><td>Beckton Dickinson</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2125</td><td></td></tr><tr><td>Modeldier: Wistar ratten</td><td>Universidad Nacional Aut&oacute;noma de M&eacute;xico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon 3-0 (Dermalon)</td><td>Covidien</td><td>1750-41</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen 7-0</td><td>Atramat</td><td>SE867/2-60</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-jodium10% cutane oplossing</td><td>Diafra SA de CV</td><td>1.37E+86</td><td></td></tr><tr><td>Scanning elektronenmicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>DSM-950</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, pellets</td><td>J. T. Baker</td><td>3722-01</td><td>CAS 1310-73-2</td></tr><tr><td>Software ACT-1</td><td>Nikon</td><td>Ver 2.70</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>EZ4Stereo 8X-35X</td><td></td></tr><tr><td>Sterrad 100S</td><td>Johnson and Johnson</td><td>99970</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Spuit van 1 mL met naald (27G x 13 mm)</td><td>SensiMedical</td><td>LAN-078-077</td><td></td></tr><tr><td>Weefselprocessor (Histokinette)</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek TEC 5 (Weefsel inbedder)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>5229</td><td></td></tr><tr><td>Trichrome kleurkit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT15</td><td></td></tr><tr><td>Unicell DxC600 Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td>BC 200-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Pisa agropecuaria</td><td>Q-7833-099</td><td></td></tr><tr><td>XYleen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>CAS 1330-20-7</td></tr></tbody></table>

driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie als leverregeneratiestrategie

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Leverziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Overmatig alcoholgebruik, een vetrijk dieet en hepatitis C-virusinfectie bevorderen fibrose, cirrose en / of hepatocellulair carcinoom. Levertransplantatie is de klinisch aanbevolen procedure om de levensduur van patiënten in gevorderde ziektestadia te verbeteren en te verlengen. Slechts 10% van de transplantaties is echter succesvol, met orgaanbeschikbaarheid, prechirurgische en postoperatieve procedures en verhoogde kosten die direct gecorreleerd zijn met dat resultaat. Extracellulaire matrix (ECM) steigers zijn naar voren gekomen als een alternatief voor weefselherstel. Biocompatibiliteit en entacceptatie zijn de belangrijkste gunstige eigenschappen van die biomaterialen. Hoewel het vermogen om de grootte en de juiste functie van de lever te herstellen is geëvalueerd in leverhepatectomiemodellen, is het gebruik van steigers of een soort ondersteuning ter vervanging van het volume van de uitgeroeste levermassa niet beoordeeld.
Gedeeltelijke hepatectomie werd uitgevoerd in een rattenlever met de xeno-implantatie van een collageenmatrixsteiger (CMS) van een rundercondylus. Linker leverkwabweefsel werd verwijderd (ongeveer 40%) en een gelijk deel van CMS werd chirurgisch geïmplanteerd. Leverfunctietests werden geëvalueerd voor en na de chirurgische ingreep. Na dag 3, 14 en 21 werden de dieren geëuthanaseerd en werden macroscopische en histologische evaluaties uitgevoerd. Op dag 3 en 14 werd vetweefsel rond het CMS waargenomen, zonder klinisch bewijs van afstoting of infectie, net als vaatneoformatie en CMS-reabsorptie op dag 21. Er was histologisch bewijs van een onbeduidend ontstekingsproces en migratie van aangrenzende cellen naar het CMS, waargenomen met de hematoxyline en eosine (H & E) en Masson's trichrome kleuring. Het CMS bleek goed te presteren in leverweefsel en zou een nuttig alternatief kunnen zijn voor het bestuderen van weefselregeneratie en -herstel bij chronische leverziekten.

Botdemineralisatie beïnvloedt de mechanische eigenschappen van CMS zonder de oorspronkelijke vorm of interconnectie van de poriën te veranderen. CMS kan elke vorm hebben en kan daarom worden aangepast aan de grootte en vorm van het geselecteerde orgaan of weefsel19. In het huidige protocol gebruikten we een driehoekig CMS (Figuur 1A-D). Een rattenmodel werd gebruikt om het regeneratieve vermogen van de CMS-xeno-impla...

Leverziekten worden veroorzaakt door vele oorzaken die fibrose of cirrose bevorderen. Transplantatie is de enige optie om de gezondheid te herstellen. Gezien de schaarste aan transplanteerbare organen moeten echter alternatieven worden onderzocht. Ons onderzoek stelt de implantatie van collageensteigers in leverweefsel voor vanuit een diermodel.

Driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie als leverregeneratiestrategie

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...

Deze methode omvat het plaatsen van een implantaat van collageenmatrix als een steiger in de lever om leverregeneratie te bevorderen. Deze implantatiemethode heeft de deur geopend voor een strateeg die het herstel van de vorm en ballon van de gereseceerde weefsels onderzoekt, waardoor anesthesie, chirurgische duur en hersteltijd worden verminderd. Deze methode kan worden gebruikt om regeneratie te bevorderen met modellen van leverfibrose, evenals andere zoogdiersoorten.Deze methode is gebaseerd op tissue engineering en regeneratieve geneeskunde om het herstel van gewond weefsel te bevorderen. Begin met het ontsmetten van de werktafel van het operatiegebied, de microchirurgiemicroscoop en de zitting met een 2% chloorhexidine-oplossing en hydrateer vervolgens de collageenmatrixsteiger verkregen uit een rundercondylus in steriele zoutoplossing gedurende 20 minuten. Scheer vervolgens met behulp van chirurgische zeep en een tweesnijdend mes de buikhuid van een verdoofde zes tot acht weken oude mannelijke Wistar-rat en desinfecteer de huid vervolgens drie keer met een 10% povidon jodiumoplossing.Plaats het dier op een warme plaat in de dorsale positie van de decubitus met de nek hyperextended om een doorlaatbare luchtweg te behouden. Evalueer de diepte van de anesthesie door het ademhalingspatroon en het verlies van ontwenningsreflex in de ledematen. Plaats vervolgens een wegwerpchirurgisch gordijn rond de geschoren huid en gebruik het xiphoid-proces als referentiepunt, maak een incisie van 2,5 centimeter op de alpis-lijn met dissectie-tang, waarbij u ervoor zorgt dat het bloedvat van de buikwand wordt vermeden om bloedingen te voorkomen.Na het plaatsen van de abdominale retractor, observeer de buikholte. Gebruik de dissectie-tang om de linker leverkwab te extraheren en op de metalen plaat te plaatsen. Gebruik een steriele één voor één centimeter driehoekige metalen sjabloon om een hepatectomie uit te voeren.Om bloedingen van de lever te voorkomen, handhaaft u de chirurgische compressie met een wattenstaafje aan de rand van de lever gedurende vijf minuten. Implanteer vervolgens met behulp van 7-O niet-absorbeerbare polypropyleen hechtingen de gehydrateerde collageenmatrixsteiger op de hepatectomieplaats met vier hechtingen tussen het leverweefsel en de steiger om verplaatsing van het biomateriaal te voorkomen. Breng de lever terug naar de buikholte en hecht de buikwand en de huid met een 3-O nylon hechting.Reinig de chirurgische incisie twee keer met een chirurgische jodium-gedrenkte spons en controleer de vitale functies van het dier. Plaats het dier vervolgens in laterale decubituspositie. Na toediening van een pijnstiller, plaatst u het dier in een individuele polycarbonaatdoos met laboratoriumdierstrooisel in een ruisvrije ruimte met temperatuurregeling.Observeer het herstel van anesthesie en controleer de water- en voedselconsumptie gedurende twee uur. Er was geen verschil in de leverfunctie tussen de SHAM-groep en de experimentele groepen met en zonder de collageenmatrixsteiger na drie, 14 en 21 dagen, wat aangeeft dat de collageenmatrixsteiger de leverfunctie niet verstoort. Histologische analyse op dag drie toont aan dat de aanwezigheid van de collageenmatrixsteiger in de lever geen reactie van het vreemde lichaam bevorderde en de opvallende aanwezigheid van laks bindweefsel wordt waargenomen.Op dag 14 en 21 is het lakse bindweefsel overvloediger met de collageenmatrix scaffold trabeculae omringd door hepatocyten die suggereren dat hepatocyten zijn gemigreerd naar de collageenmatrixsteiger. Gebieden van hepatocyten geïrrigeerd door een vat kunnen worden gezien en de hepatocyten die zich aan de collageenmatrixsteiger trabeculae houden, zijn soms omgeven door laks bindweefsel. Gebruik tijdens het uitvoeren van de hepatectomie een aseptische techniek om infectie te voorkomen en pas daarna compressie toe om bloedingen uit de lever te voorkomen.Gebruik ook 7-O hechtingen voor implantatie van collageenmatrixsteigers om scheuren te voorkomen. Na implantatie van de collageenmatrixsteiger in een fibrotisch diermodel kunnen de voordelen van sinogene implantatie voor leverregeneratie worden geëvalueerd. Het gebruik van collageenmatrixsteiger ter vervanging van de leverextubeerde massa is tot nu toe niet geëvalueerd.Deze genogene materialen effenen de weg als een andere therapeutische optie op het gebied van de chronische leverziekten.

three-dimensional-collagen-matrix-scaffold-implantation-as-liver

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Perfusie decellularisatie is een nieuwe techniek om hele lever scaffolds dat het orgel van de extracellulaire matrix samenstelling en microarchitectuur behoudt produceren. Hierin wordt de werkwijze voor het bereiden gehele orgel steigers met behulp van perfusie decellularisatie en de daaropvolgende herstel van de populatie met hepatocyten beschreven. Functionele en transplanteerbare lever enten kan worden gegenereerd met behulp van deze techniek.

Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

Voor het creëren van hoog georganiseerde structuren van complex weefsel, moet men meerdere materiaal- en celtypen samenvoegen tot een geïntegreerd composiet. Dit combinatoire ontwerp bevat orgaanspecifieke gelaagde cellagen met twee verschillende biologisch afgeleide materialen die een sterke vezelachtige matrixbasis bevatten, en endotheelcellen voor het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten.

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Weefselmanipulatie omvat vaak in vitro expansie om autologe voor weefselregeneratie creëren. Deze studie geeft een werkwijze voor weefselexpansie, regeneratie, reconstructie en in vivo werd ontwikkeld om de verwerking van cellen en biologische materialen buiten het lichaam te minimaliseren.

Gehakt Tissue in Compressed Collageen: A-cel met Biotransplant voor Single-geënsceneerde Reconstructieve Repair

Er is een innovatieve biofabricagetechniek ontwikkeld om driedimensionale constructies te engineeren die lijken op de architecturale kenmerken, componenten en mechanische eigenschappen van in vivo weefsel. Deze techniek beschikt over een nieuw ontwikkeld opofferbaar materiaal, BSA-rubber, dat gedetailleerde ruimtelijke kenmerken overdraagt en de in vivo architectuur van een grote verscheidenheid aan weefsels reproduceert.

Driedimensionale Biomimetic Technologie: Novel Biorubber Creëert Defined micro- en macro-schaal Architectures in Collageen Hydrogels

Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol voor de fabricage van een opkomend driedimensionaal hepatocytencultuurplatform, het omgekeerde colloïdale kristal-scaffold, en de bijbehorende technieken om hepatocytengedrag te beoordelen. De grootte-controleerbare poriën, interconnectiviteit en de mogelijkheid om extracellulaire matrixeiwitten te binden aan het poly(ethyleenglycol) (PEG)-scaffold verbeteren de prestaties van Huh-7.5-cellen.

Fabricage van Inverted Colloïdaal Crystal Poly (ethyleen glycol) Steiger: Een drie-dimensionale Cultuur van de Cel Platform for Liver Tissue Engineering

Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze "levende steigers", het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Dit protocol presenteert een 3D biomimetisch model met bijbehorend fibrotisch stromaal compartiment. Bereid met fysiologisch relevante hydrogels in verhoudingen die de biofysische eigenschappen van de stromale extracellulaire matrix nabootsen, een actieve bemiddelaar van cellulaire interacties, tumorgroei en uitzaaiingen.

Een biomimetisch model voor leverkanker om tumor-stroma-interacties te bestuderen in een 3D-omgeving met afstembare bio-fysische eigenschappen

Het huidige protocol optimaliseert de lever in situ perfusie / decellularisatie en twee-foton microscopie methoden om een betrouwbaar platform te creëren om de dynamiek van extracellulaire matrix (ECM) remodellering tijdens niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) te visualiseren.

3D-beeldvorming van de extracellulaire levermatrix in een muismodel van niet-alcoholische steatohepatitis

Organoïden revolutioneren gepersonaliseerde weefselmodellering voor orgaanontwikkeling, medicijnontdekking en ziekteonderzoek. De voortgang in organoïdengineering leidt tot het creëren van ingewikkelde synthetische weefsels. Het doel is om morfogenese, assembloïdtechnologie en biomatrices te integreren om weefselengineering te bevorderen. Dit protocol helpt bij het modelleren van leverorganogenese en het vaststellen van richtlijnen voor de constructie van synthetisch weefsel.

In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen

Leer driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie voor leverregeneratie in een fibrotisch rattenmodel. Deze methode bevordert weefselherstel zonder leverfunctie te verstoren en biedt een veelbelovende therapeutische optie.

Driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie als leverregeneratiestrategie

Meer video's verkennen