Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Met dit protocol kunnen de fibroblasten hun eigen omgeving bouwen en organiseren onder gedefinieerde mechanische omstandigheden. Dit resulteert in anisotrope weefsels met stijfheid en matrixsamenstellingen die vergelijkbaar zijn met de natuurlijke omgeving van de cel. Deze methode maakt het mogelijk om tot 48 omstandigheden parallel te vergelijken.

Het is flexibel met betrekking tot het gebruikte celtype en de kweekomstandigheden. Door slechts enkele goed gedefinieerde componenten te gebruiken, is het reproduceerbaar tussen laboratoria. Door pro-fibrotische factoren of antifibrotica toe te passen, kan dit protocol worden gebruikt om de onderliggende processen en therapieën van fibrotische ziekten van welke aard dan ook te bestuderen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Alisa Degrave, een promovendus uit ons laboratorium, en ikzelf. Ontdooi om te beginnen de cryo-geconserveerde cardiale fibroblasten in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer twee minuten totdat de injectieflacon slechts een kleine hoeveelheid ijs overhoudt. Breng vervolgens de celsuspensie druppelsgewijs over met behulp van een serologische pipet van twee milliliter in een geschikte steriele centrifugebuis met 10 milliliter fibroblastgroeimedium.

Voor een optimale celophaling spoelt u de cryoflacon met één milliliter VGV en brengt u deze over naar de centrifugebuis. Reuspend de cellen voorzichtig opnieuw op en breng over in een celkweekkolf. Vul VGV om de dag aan gedurende vijf dagen of totdat de cellen 80% confluentie hebben bereikt.

Na het opzuigen van het medium uit de gekweekte cellen, wast u cellen met zes milliliter PBS en aspiraat, voegt u vervolgens zes milliliter van het celdissociatiereagens toe aan de cellen en incubeert u totdat de celloslating zichtbaar is. Neutraliseer enzymatische activiteit door zes tot 12 milliliter VGV toe te voegen aan de losgeraakte cellen in het celassociatiereagens. Pipetteer vier tot acht keer voorzichtig op en neer met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter om een eencellige suspensie te garanderen en breng de cellen over in een verse opvangbuis van 50 milliliter.

Controleer de opbrengst met behulp van een geautomatiseerde celteller volgens de instructies van de fabrikant en pellet de cellen. Na het centrifugeren, zuig het supernatant op, veeg de buis om de pellet los te maken en resuspend de cellen in VGV. Druk vervolgens de celsuspensie door een 40 micrometer mesh-celzeef, gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller, beoordeel het celnummer en de levensvatbaarheid door uitsluiting van elektrische stroom om betrouwbare celnummers te garanderen voordat u doorgaat met gemanipuleerde bindweefsels of ECT-voorbereiding.

Om je voor te bereiden op ECT, pas je de celsuspensie aan op de 8,9 miljoen cellen per milliliter bij 20 tot 25 graden Celsius door VGV toe te voegen en de cellen op ijs te houden. Breng alle andere buizen die de afzonderlijke componenten van het ECT-hydrogelmengsel bevatten over op ijs en koel een lege centrifugebuis van 50 milliliter voor om het mengsel te bereiden. Begin met het bereiden van het ECT-hydrogelmengsel door componenten die in de tekst worden beschreven toe te voegen aan de voorgekoelde centrifugebuis van 50 milliliter, waardoor de vorming van luchtbellen wordt voorkomen.

Pipetteer eerst de zuur oplosbare collageen type I hydrogel in een serologische pipet met een brede boorpunt. Pas het zoutgehalte van de collageenoplossing aan door de DMEM toe te voegen terwijl u de buis voorzichtig ronddraait voor een goede menging. Om de pH te neutraliseren, voegt u 0,2 molair natriumhydroxide toe terwijl u de buis draait en bevestigt u de neutralisatie door de rode kleur van de fenolrode indicator te observeren.

Voeg vervolgens de celsuspensie druppelsgewijs toe terwijl u de buis voorzichtig ronddraait. Meng de suspensie door slechts één keer voorzichtig op en neer te spuiten met behulp van een serologische pipet met een brede boorpunt om bubbelvorming te voorkomen en de schuifspanning te minimaliseren. Draai de buis 10 keer voorzichtig rond voor een grondige menging.

Houd de centrifugebuis met ECT-hydrogelmengsel gedurende het gietproces op ijs. Maak een pipetpunt van één milliliter nat in het ECT-hydrogelmengsel en verdeel vervolgens 180 microliter hydrogelmengsel gelijkmatig in elke mal van de 48-well gietplaat om overmatige schuifkrachten te vermijden die de integriteit van de collageenmatrixassemblage kunnen beïnvloeden en ervoor te zorgen dat de hele plaat binnen 15 tot 20 minuten klaar is. Zorg ervoor dat zich een volledige lus vormt in de mal, omdat discontinue verdeling van ECT-mengsel een volledige ECT-ringvorming voorkomt.

Vermijd pipetteren in de binnenput en het vormen van bellen tijdens het pipetteren om een uniforme ECT-hydrogelgieting te garanderen voor homogene en functionele weefselvorming. Plaats de 48-well gietplaat voorzichtig in de celkweekincubator om het ECT-hydrogelmengsel gedurende 15 tot 30 minuten te reconstitueren. Na incubatie lijkt het gelachtig en ondoorzichtig.

Voeg 600 microliter van 37 graden Celsius warme VGV per put voorzichtig langs de muur toe om ECT-loslating van de bodem te voorkomen. Vervang het medium elke dag door 500 microliter VGV tot de analyse. Gebruik op de gewenste tijdstippen een stereomicroscoop om microscopische beelden van de boven- en zijaanzichten van de ECT op te nemen.

Gebruik een beeldverwerkingsprogramma om een lijnscananalyse uit te voeren. Stel een schaal in en gebruik het rechtlijnige gereedschap om de ECT-diameters te traceren en te meten op minimaal zes posities per arm in elk beeldvlak. Beeld de 48-well gietplaat onder een opnameapparaat met een geïntegreerde gebiedsscancamera die op een vaste afstand is geplaatst en is uitgerust met een monochrome beeldsensor met hoge resolutie en een bijna-UV-lichtbron.

Voer geautomatiseerde detectie uit van de uiteinden van de polen die fluorescerende kleurstof bevatten voor het maximaliseren van het contrast. Meet de afstand tussen de polen van dagelijkse records met behulp van een geautomatiseerde analyse door de opgenomen beelden op software uit te voeren om contrastrijke heldere pixels op een donkere achtergrond of een beeldverwerkingsprogramma te detecteren. Verwijder de ECT van de bevestigingspalen en plaats een overdrachtskliak en ECT-lus.

Breng vervolgens de ECT over op twee haken die op de stationaire arm zijn geklemd en de transducerarm van een extensieve dynamische mechanische riometer uitgerust met een 37 graden Celsius getemperd orgaanbad gevuld met PBS. Breng de uniaxiale spanning met een constante lineaire snelheid aan door de riometer in te stellen op ongeveer 1% van de initiële afstand tussen de haken per seconde. Een constante reksnelheid van 0,03 millimeter per seconde kan worden gebruikt met typische ECT-afmetingen.

Scheur de kracht van de transducer en initieer de stretch. Blijf registreren tot het punt van ECT-breuk na het normaliseren van de gemeten kracht per dwarsdoorsnede en plot de spannings-rekcurve die verschillende biomechanische parameters bepaalt. Vlak voordat het weefsel begint met microfractureren, komt de bovengrens van het elastische gebied overeen met het vloeipunt en is de spanning een maat voor de elasticiteit van het weefsel.

Het plastic gebied bevindt zich tussen het vloeipunt en het faalpunt. Het faalpunt komt overeen met een plotselinge daling van de spanning als gevolg van breuk van het weefsel, wat de ultieme stam definieert die een maat is voor de uitbreidbaarheid van het weefsel. Het derde meetpunt komt overeen met de maximale sterkte die wordt gedefinieerd door de hoogste spanning die het weefsel kan dragen zonder te breken tijdens het uitrekken.

De veerkracht en taaiheid van het gebied onder de curve komt overeen met de energie die door het weefsel wordt geabsorbeerd tot respectievelijk het vloeipunt en het faalpunt. Voor elke verkregen kromme komt de helling van het lineaire deel van het elastische gebied overeen met de modulus van Young, ook wel elastische modulus genoemd. Het is een mechanische eigenschap die de stijfheid van het weefsel meet.

Met behulp van dit protocol volgde ECT-verdichting en contractie onder controleomstandigheden en in aanwezigheid van FCS een paar uur na het gieten en nam met name toe tot dag vijf. Wanneer ECT werd behandeld met de actinepolymerisatieremmer Latrunculine A, werd de ECT-verdichting verminderd zoals aangegeven door het significant hogere doorsnedegebied in vergelijking met controle. De samentrekking van de weefsels werd beoordeeld tijdens de vijf dagen van de kweek.

Bij afwezigheid van Latrunculine A nam de contractie geleidelijk toe tot dag vijf tot ongeveer 40% krimp. De aanwezigheid van Latrunculine A beïnvloedde echter de weefselcontractie, wat resulteerde in slechts ongeveer 20% maximale contractie. Actinepolymerisatieremming leidde tot een significante vermindering van ongeveer 50% in de weefselstijfheid ten opzichte van de controle.

Deze resultaten tonen aan dat de actine cytoskeletale integriteit essentieel is voor ECT-verdichting, contractie en verstijving. Het is belangrijk om een betrouwbare, hoogwaardige collageenoplossing te selecteren en ervoor te zorgen dat een eencellige suspensie met hoge levensvatbaarheid wordt gebruikt om gemanipuleerde bindweefsels te reconstitueren.