Gestandaardiseerde Mediator Release Assay als een uitlezing voor allergeen potentie

De test is een belangrijk onderzoeksinstrument om de degranulaties van basofielen te simuleren die worden geïnduceerd door de cross-linking van het IgE van patiënten en de allergenen. Zo kan de test worden gebruikt om type 1, allergische reacties na te bootsen. De test is robuust, reproduceerbaar en aanpasbaar.

Bovendien is het zeer gevoelig omdat het kan worden uitgevoerd met kleine hoeveelheden recombinant of gezuiverd allergeen of zelfs met complexe allergeenextracten. De methode wordt gebruikt om allergieën te diagnosticeren terwijl het de reactiviteit van het IgE van patiënten op allergenen analyseert. Ook is deze methode geschikt om kruisreactiviteit te analyseren en de werkzaamheid van de AIT-behandeling te controleren.

Begin met het oogsten van Ag8-cellen uit de celkweekkolf en breng de cellen over in een centrifugatiebuis. Pellet de cellen door centrifugeren gedurende vijf minuten, bij 250 maal g bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant en resuspend de celkorrel tot een eindconcentratie van ongeveer één keer 10 tot de zesde cel, per milliliter in ges vermenselijkt, RBL-cellenmedium.

Verdun menselijke sera één tot 10 in Ag8-celsuspensie voor de uiteindelijke serumverdunning van één tot 20 in de test en incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius en vijf tot 7% koolstofdioxide. Wanneer de gesualiseerde RBL-cellen 50 tot 90% confluentie bereiken, aspirateert u het medium zorgvuldig uit een T-75 celkweekkolf zonder de aangehleefde gesualiseerde RBL-cellen aan te raken. Was de cellen tweemaal door 10 milliliter DPBS aan de andere kant van de kolf toe te voegen en niet rechtstreeks op de cellen.

AspirateER DPBS, voeg vijf milliliter voorverwarmd één keer trypsine-EDTA toe voor celonthechting en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Tik zachtjes op de kolf om de cellen los te maken. Breng de celsuspensie over in een 15 millimeter centrifugatiebuis en vul de buis met gemens vermenselijkt RBL-celmedium of DPBS om de trypsine-EDTA te verdunnen.

Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 250 maal g. Adem het supernatant op en resuspend de pellet in vijf milliliter gemens vermenselijkt RBL-celmedium voor het tellen van cellen. Verdun na het tellen van de cellen de cellen in gemens vermenselijkt RBL-celmedium om een uiteindelijke concentratie van twee keer 10 tot de zesde cel per milliliter te verkrijgen.

Voeg 50 microliter gesistente RBL-celsuspensie toe, per put, wat overeenkomt met één keer 10 tot de vijfde cel per put in een steriele 96-putplaat. Centrifugeer de voorgebroede Ag8-serumsuspensie en breng 50 microliter van de gecentrifugeerde Ag8-serumsuspensie over naar elke put met gemensualiseerde RBL-cellen, zonder de Ag8-celkorrel te verstoren. Gebruik gesensibiliseerde niet-gestimuleerde cellen zonder antigeen als geen antigeencontrole voor indicatie van het onderste signaalplateau of de achtergrond, en sensibiliseer de achtergrond en maximale lysiscontroleputten niet.

Bedek de plaat met het deksel en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius en vijf tot 7% koolstofdioxide. Aspirateer de sera die het celmedium bevatten, keer om en tik op de plaat op het absorberende papier om de plaat te legen voor het wassen van gemensualiseerde RBL-cellen. Was de cellen drie keer door 200 microliter tyrode's buffer per put toe te voegen en incubeer gedurende ongeveer 30 seconden per wasbeurt voor de eerste twee wasbeurten.

Nadat u de buffer van Tyrode voor de derde keer hebt toegevoegd, zuigt u de buffer op en laat u de oplossing in de putjes totdat u klaar bent om de antigeenverdunning toe te voegen. Breng 100 microliter antigeenoplossing over naar elke put die de voorgesensibiliseerde gestandaardiseerde RBL-cellen bevat, maar stimuleer de maximale lysis en niet-gesensibiliseerde achtergrondcellen niet met antigeen. Voeg 100 microliter tyrode's buffer toe in de maximale lysis controleputten, niet-gesensibiliseerde achtergrondcontroleputten en gesensibiliseerde no-antigeenputten.

Incubeer de cellen gedurende een uur bij 37 graden Celsius en vijf tot 7% koolstofdioxide. Behandel de maximale lysiscontroleputten met 10 microliter van 10% Triton X-100 per put en meng goed om de cellen volledig te lyseren voor 100% afgifte van bèta-hexosaminidase. Voeg 50 microliter substraatoplossing toe aan een nieuwe niet-bindende 96-wells plaat.

Breng 50 microliter supernatant over van de putten van gesistualiseerde RBL-cellen die de plaat bevatten naar de nieuwe plaat met de substraatoplossing en incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 graden Celsius om omzetting van het fluorogene substraat mogelijk te maken. Voeg 100 microliter stopoplossing per put toe en meet de fluorescentie zoals beschreven in het teksthandschrift. De klokvormige curve verkregen in de bèta-hexosaminidase-activiteitstest, die de monovalente bezetting van antigeeneptopen van immunoglobuline E aangeeft als gevolg van de overmaat aan allergeen, dat het allergeen immunoglobuline E cross-linking bij hoge antigeenconcentraties remt.

De antigeenconcentratie die nodig is voor de halve maximale mediatorafgifte werd berekend met behulp van de lineaire regressieanalyse. De levensvatbaarheidstest van de cel werd uitgevoerd om de cytotoxische effecten uit te sluiten die zijn afgeleid van het sensibiliserende serum of het antigeen dat wordt gebruikt voor stimulatie. Vijf verschillende menselijke serums werden gebruikt voor de bèta-hexosaminidase-activiteitstest en vier van de vijf sera afgeleid van de berkenpollenallergiepatiënten reageerden op Bet v 1-stimulatie, wat aantoont dat Bet v 1 een krachtig allergeen is dat verantwoordelijk is voor immunoglobuline E-gemedieerde allergische symptomen.

De kruisreactiviteit van immunoglobuline E op homologe allergenen werd beoordeeld. De respons op Bet v 1 werd gevonden bij beide patiënten, maar patiënt twee reageerde ook op Cor a 1. De Bet v 1 homoloog voedselallergeen, wat wijst op hogere Cor a 1 kruisreactieve immunoglobuline E-niveaus bij patiënt twee.

De hypoallergene aard van mutante varianten van de allergenen werd beoordeeld en vergeleken met hun tegenhanger van het wilde type. De afgiftecurve van de Bet v 1-voudige variant verschoof naar een hogere antigeenconcentratie in vergelijking met het wildtype allergeen, wat resulteerde in een aanzienlijk hogere concentratie antigeen om de half maximale afgifte te veroorzaken, waardoor de mutant minder allergisch is en daarom een kandidaat voor allergeenspecifieke immunotherapie. Vergeet niet om de wasoplossingen op de cellen te laten totdat de antigeenverdunning wordt aangebracht om te voorkomen dat de cellen uitdrogen, anders zou dit resulteren in slechte prestaties van de test.

De test kan voor veel verschillende toepassingen worden gebruikt, waaronder de standaardisatie van allergene producten, op basis van hun biologische activiteit, zoals huidpriktestoplossingen of extracten die worden gebruikt voor allergeenspecifieke immunotherapie.