Hyperactief biggeBac Transposase-gemedieerde kiembaantransformatie in de herfst Legerworm, Spodoptera frugiperda
23 september 2021
Succesvolle kiembaantransformatie in de herfstlegerworm, Spodoptera frugiperda, werd bereikt met behulp van mRNA van hyperactief piggyBac transposase.
Dit protocol toont de productie van transgene Fall Armyworm met behulp van piggyBac-gebaseerd transformatiesysteem. We hopen dat deze methoden ten goede zullen komen aan een betere transformatie, niet alleen in de Fall Armyworm, maar ook in lepidoptera-insecten. De hier beschreven methode maakt de kiembaantransformatie van lepidopteran plaaginsecten efficiënt.
De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Xien Chen, een postdoctoraal fellow in mijn laboratorium. Begin met het plaatsen van 12 mannelijke poppen en 12 vrouwelijke poppen in een doos. Plaats een 10% sucrose-oplossing in de doos voor het voeden van volwassenen.
Bedek de doos met een papieren handdoek. Stel op dag twee na eclosie de volwassenen 's nachts bloot aan intens licht. Breng op dag drie na de eclosie de volwassenen over naar een donkere plaats.
Verzamel de embryo's binnen twee uur na overpositie. Voeg druppels water toe aan het stuk van de papieren handdoek met verse eieren die in een petrischaaltje op ijs worden bewaard. Breng de eieren voorzichtig over op een glazen schuif met een fijne borstel en lijn ze een voor een uit op een glazen dia.
Houd de glazen glijden met de eieren uitgelijnd op ijs voordat ze micro-injectie. Injecteer een mengsel van de 200 nanogram per microliter piggyBac-gebaseerde EGFP-tot expressie brengende plasmide, 200 nanogram per microliter hyperactief varkenBac transposase mRNA en steriel gedestilleerd water in de eieren met behulp van de compensatiedruk van de geautomatiseerde micro-injector. Houd de geïnjecteerde eieren op 27 plus of min één graad Celsius, 60 plus of min 10% relatieve vochtigheid totdat ze uitkomen.
Voed de uitgekomen larven op een kunstmatig dieet en breng elke larve over naar een klein kopje in het vroege wrongel- en sterstadium. Verzamel de poppen en plaats ongeveer 150 vrouwelijke en 150 mannelijke poppen in een kooi. Hang verschillende stukken keukenpapier van 30 centimeter bij 15 centimeter groot in de kooi om de eieren te verzamelen.
Verzamel de papieren handdoeken met eieren dagelijks en bewaar de eieren in de juiste omstandigheden totdat ze uitkomen. Houd de pasgeboren larven vijf minuten op vier graden Celsius om ze te immobiliseren en breng ze vervolgens over op een ijskoude plaat. Screen de geïmmobiliseerde pasgeboren larven onder een fluorescentie stereomicroscoop.
Selecteer de EGFP-positieve pasgeborenen, til ze op naar het popstadium, in ongeveer twee weken bij 27 plus of min één graad Celsius. Het hyperactieve piggyBac transposase mRNA dat in vitro werd gesynthetiseerd, werd gedetecteerd met behulp van een 1%Agarose-gel. De PDS-geïnjecteerde embryo's vertoonden geen EGFP-signaal, terwijl de EGFP-tot expressie brengende plasmide en hyperactieve piggyBac transposase mRNA-geïnjecteerde embryo's EGP-fluorescentie vertoonden, wat aangeeft dat de piggyBac-constructie succesvol was.
De G1-larven verkregen uit eieren die het resultaat waren van een zelfkruising van G0-volwassenen vertoonden een sterk EGFP-signaal. Een fragment met de promotor en het EGFP-fragment werd met succes versterkt met behulp van het genomische DNA geïsoleerd uit de EGFP-positieve larven als sjabloon. Hetzelfde fragment werd echter niet gedetecteerd toen genomisch DNA werd geïsoleerd uit de larven van het wilde type als de sjabloon.
De eieren voor micro-injectie moeten zo vers mogelijk zijn en moeten altijd op ijs worden gehouden voordat ze micro-injecties maken om hun ontwikkeling te vertragen. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om vragen te beantwoorden in de functionele genomica van plaaginsecten en genetische bestrijdingsmethoden voor deze wereldwijde plaag te ontwikkelen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert een protocol voor succesvolle kiembaantransformatie bij de herfstlegerrups, Spodoptera frugiperda, gebruikmakend van een piggyBac-gebaseerd transformatiesysteem. De methode belooft een verbeterde transformatie-efficiëntie bij lepidoptera-plagen en bevordert functioneel genomisch onderzoek bij deze organismen.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Onderzoeksgebied
- Genetische manipulatie bij plaaginsecten
- Technieken voor transformationele biologie
- Toepassingen van functionele genomica
Achtergrond
- De herfstlegerrups is een aanzienlijke landbougplaag.
- Het piggyBac-transposonsysteem staat bekend om zijn efficiëntie bij gentransfer.
- Het verbeteren van kiemlijn-transformatie is cruciaal voor strategieën ter bestrijding van plagen.
Gebruikte methoden
- Micro-injectie van eitjes met piggyBac-plasmide en mRNA
- Spodoptera frugiperda als biologisch model
- Fluorescentiemicroscopie voor het screenen van transgene larven
Belangrijkste resultaten
- De succesvolle expressie van EGFP in transgene larven toonde de functionaliteit van het piggyBac-systeem aan.
- EGFP-expressie werd geverifieerd via amplificatie van genomisch DNA, waarbij onderscheid werd gemaakt tussen transgene en wild-type larven.
- De transformatietechniek bleek efficiënt voor het produceren van genetisch gemodificeerde plaaginsecten.
Conclusies
- De studie stelt een robuuste methode vast voor kiemlijn-transformatie in Spodoptera frugiperda.
- De bevindingen dragen bij aan de vooruitgang van genetische beheersmaatregelen voor landbouwongedierte.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Het tot stand brengen van efficiënte kiembaan-transformatie bij landbouwpestinsecten zoals de herfstlegger maakt functionele genomica mogelijk voor doelwitvalidatie en het mechanistisch verminderen van risico's in pijplijnen voor plaagbestrijding. Dit protocol ondersteunt vroege ontdekking door een schaalbaar systeem te bieden om genfuncties te onderzoeken en fenotypische uitkomsten te beoordelen in een ziekte-relevant insectmodel. Succesvolle transgenese faciliteert stroomafwaartse screening en de ontdekking van biomarkers voor genetische strategieën voor plaagbestrijding.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele analyse van genen van plagen mogelijk om doelwitten voor genetische bestrijdingsstrategieën te valideren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor het genereren van transgene lijnen voor een consistente beoordeling van doelwitten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door gendisruptie te koppelen aan fenotypische effecten in een plaagmodel.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert fluorescente reporterlijnen voor high-throughput screening van genetische perturbaties.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde PCR-gebaseerde genotypering en TAIL-PCR mogelijk voor validatie van de insertieplaats.
- Assay-gereedheid: Produceert stabiele transgene stammen die geschikt zijn voor compound screening en fenotypische assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt genvalidatie in de ontdekkingsfase met preklinische evaluatie van genetische controlemechanismen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Faciliteert de beoordeling van gen-essentialiteit en fenotypische impact voorafgaand aan toepassing in het veld.
- Biomarker-afstemming: Ondersteunt de identificatie van genetische markers die geassocieerd zijn met eigenschappen van vatbaarheid of resistentie.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door targetvalidatie via transgenese mogelijk te maken, lead-identificatie via fenotypische screening te ondersteunen en preklinische beslissingen te informeren via stabiele genetische modellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door gene knockout of overexpressie in de herfstlegerworm mogelijk te maken om de relevantie van het target te beoordelen.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde transgene lijnen voor reproduceerbare screening van genetische of chemische modulatoren.
- Analytics: Biedt kwantitatieve PCR- en fluorescentie-readouts om de integratie van het transgen en de expressieniveaus te meten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de ontdekking van genfuncties met preklinische evaluatie van genetische benaderingen voor plaagbestrijding.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar transgeneseplatform dat toepasbaar is op diverse lepidoptera-plaagsoorten voor targetvalidatie over de gehele portfolio.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van doelwitten door directe genetische manipulatie in een plaagmodel.
- Operationele waarde: Levert een schaalbaar, reproduceerbaar transgenesesysteem met gestandaardiseerde protocollen voor micro-injectie en screening.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid over de essentialiteit van doelwitten te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van in vivo fenotypische validatie in een plaagmodel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in insectembryologie en microinjectietechnieken.
- Vereist een geautomatiseerde micro-injector, een fluorescentie stereomicroscoop en PCR-apparatuur voor validatie.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor embryo-collectie, injectiecondities en transgene screening tussen teams.
- Vereist aanpassing van temperatuur-, vochtigheids- en dieetprotocollen voor verschillende lepidoptera-soorten.
- Afhankelijk van de kwaliteit en versheid van de embryo's, waarbij de efficiëntie van de micro-injectie wordt beïnvloed door de timing van de ontwikkeling.
