Membraan Lipid Turnover meten met de pH-gevoelige fluorescerende lipide analoog ND6
29 juli 2021
Dit protocol presenteert een fluorescentiebeeldvormingsmethode die een klasse van pH-gevoelige lipidefluoroforen gebruikt om het transport van lipidemembranen tijdens celexocytose en de endocytosecyclus te volgen.
Dit protocol beschrijft de karakterisering en toepassing van een nieuwe pH-gevoelige fluorescerende lipidensonde, specifiek voor celmembranen, waarmee onderzoekers exo- en endocytose in levende cellen kunnen volgen. De meeste eerdere verslaggevers over membraaneiwit op basis van pH-gevoelig groen fluorescentie-eiwit, dat indirect is. Als lipidenmimeticum integreert ND6 in het celmembraan en rapporteert zo getrouw het verkeer van lipidemembranen.
ND6-sonde wordt alleen fluorescerend als deze is ingebed in een biologische membraanomgeving. De fluorescentie-intensiteit van die sonde correleert met protonering en deprotonering van de piperazinekopgroep. Het fluoresceert dus veel sterker bij een lagere pH.
Exocytose en endocytose zijn alomtegenwoordige processen die ten grondslag liggen aan de secretie en opname van veel signaalmoleculen. Daarom kan ND6 worden gebruikt om enkele fundamentele vragen in de celbiologie en de biomedische wetenschappen te bestuderen. Haley, Oliver en Jonathan, studenten uit mijn lab, zullen de procedure demonstreren.
Begin met het voorbereiden van een beeldvormingskamer die temperatuurregeling en oplossingsinvoer mogelijk maakt voor beeldvorming van levende celfluorescentie. Stel een programmeerbaar apparaat in om de perfusieoplossingen te schakelen en de elektrische stimulus op gedefinieerde tijdstippen tijdens de beeldvorming af te geven. Weeg een geschikte hoeveelheid ND6 af.
Los het op in dimethylsulfoxide en laat het bij kamertemperatuur oplossen. Soneer vervolgens de oplossing kort. Filtreer de ruwe stockoplossing met behulp van een filter van 0,22 micrometer om grote kleurstofaggregaten te verwijderen.
Bepaal met behulp van een conventionele of microvolumespectrofotometer de kleurstofconcentratie op 405 nanometer. Verdun de stockoplossing vóór het aanbrengen met behulp van de badoplossing tot een concentratie van één milligram per milliliter. Bewaar de bouillonoplossing in het donker op kamertemperatuur.
Voeg ND6-voorraadoplossing toe aan het kweekmedium met een uiteindelijke concentratie van één microgram per microliter en incubeer deze om alomtegenwoordig endocytose-membraancompartimenten, zoals endosomen, te labelen. Om de mate van etikettering van synaptische blaasjes te verminderen, moet de spontane neuronale activiteit farmacologisch worden onderdrukt. Na het selectief labelen van synaptische blaasjes zoals beschreven in het manuscript, monteer je het dekglaasje met cellen in de beeldvormingskamer.
Sluit de temperatuursensor, perfusie-ingang en vacuümtip aan op de beeldkamer. Pas de perfusiesnelheid aan tot ongeveer 0.2 milliliter per seconde en start de perfusie van voorverwarmde normale tyrode-oplossing die NBQX en DAP5 bevat om overmatig ND6 in de cultuur te verwijderen. Pas de scherpstelling aan en zoek het juiste gezichtsveld met gezonde en goed verspreide neuronen met verbonden neurieten.
Het vermijden van gebieden met onopgeloste dicolloïden. Probeer ND6-geladen cellen met verschillende belichtingstijden in beeld te brengen om de beste beeldvormingsinstellingen te bepalen. Stel het stimulatie- en perfusieprotocol, het frame-interval en de totale duur in met behulp van de informatie in het tekstmanuscript.
Start de beeldacquisitie vergezeld van gesynchroniseerde stimulatie en perfusie. Bewaak de stimulatie en oplossingsuitwisseling tijdens beeldvorming. Stop de perfusie nadat de beeldvorming is beëindigd.
Verwijder het afdekglaasje en reinig de beeldvormingskamer voor de volgende proef. Maak een back-up en maak een elektronische kopie van alle afbeeldingsbestanden. Kies en open het analyseprogramma voor gegevensextractie.
Open of importeer een afbeeldingsstapel in het analyseprogramma. Nadat u een binair masker hebt gegenereerd, gebruikt u de functie voor het analyseren van deeltjes met de juiste gebiedsgrootte en circulariteit om interessegebieden of ROI's te vragen die overeenkomen met celmembranen, endosomen, lysosomen of synaptische boutons. Selecteer vier achtergrond-ROI's in celvrije gebieden binnen het gezichtsveld.
Sla vervolgens alle geselecteerde ROI's op. Lijn alle frames binnen de ND6 time-lapse-beeldstapels uit. Stel de eerste afbeelding in als referentie en lijn de rest erop uit met behulp van rigide registratie, waardoor artefacten als gevolg van XY-drifting worden verminderd.
Sla vervolgens de uitgelijnde afbeeldingsstapels op. Pas de opgeslagen ROI's toe op uitgelijnde ND6-afbeeldingsstapels. Meet de gemiddelde pixelintensiteit van ND6-fluorescentie voor elke ROI in elk frame van de afbeeldingsstapel.
Exporteer vervolgens de resultaten voor statistische analyse. Bereken de gemiddelde intensiteit van de achtergrond-ROI's om de basisruis te verkrijgen, die wordt afgetrokken van alle geselecteerde ROI's. Bereken het gemiddelde van de drie hoogste gemiddelde intensiteiten voor elke geselecteerde ROI tijdens de toepassing van pH 5,5 tyrode-oplossing om de maximale fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, gedefinieerd als 100% voor normalisatie.
Bereken het gemiddelde van de drie laagste gemiddelde intensiteiten voor elke geselecteerde ROI tijdens de toepassing van 50 millimolair ammoniumchloride om de minimale fluorescentie-intensiteit in te stellen, gedefinieerd als 0% voor normalisatie. Bereken de relatieve fluorescentieveranderingen voor elke ROI op basis van zijn eigen 0%- en 100%-intensiteiten. Leid gemiddelde fluorescentieveranderingen, veranderkinetiek en andere waarden of grafieken af uit individuele ROI-gegevens.
Heldergroene fluorescerende puncta langs de neuronale processen waren zichtbaar na het laden van de neuronale cellen met ND6. Een sterke correlatie tussen ND6- en FM464-fluorescentie-intensiteiten suggereerde ook synaptische blaasjeskleuring door ND6. Er werd een afname waargenomen in de ND6-fluorescentie als reactie op zowel elektrische stimulatie als stimulatie met een hoog kaliumgehalte, wat suggereert dat ND6 zich in het synaptische blaasjesmembraan bevindt en dat het lumen van het synaptische blaasje wordt geneutraliseerd tijdens de afgifte.
Onder een uitputtende elektrische stimulatie verminderde de M-bèta-cd-behandeling de afgifte en het ophalen van synaptische blaasjes aanzienlijk, gemeten door ND-beeldvorming, wat suggereerde dat membraancholesterol de exocytose en endocytose van synaptische blaasjes vergemakkelijkt. Baf A1 verhinderde het herstel van ND6-fluorescentie na stimulatie door de herverzuring van opgehaalde synaptische blaasjes acuut te blokkeren. Basiskennis van fluorescentiemicroscopie is een must.
Zorgvuldige planning voor fysiologische omstandigheden ter ondersteuning van beeldvorming van levende cellen is erg belangrijk. Het is van cruciaal belang om de concentratie van de ND-voorraadoplossing nauwkeurig te bepalen. Meet indien mogelijk voor elk gebruik de concentratie van de voorraadoplossing opnieuw.
Houd het uit de buurt van direct zonlicht om het bleken van foto's en ontbinding van de sonde te voorkomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een fluorescentiebeeldmethode met pH-gevoelige lipidesondes voor het monitoren van lipide-membraantransport tijdens cel-exocytose en endocytose. De ND6-lipidemimetica integreren in het celmembraan, waardoor real-time inzicht wordt verkregen in deze dynamische processen in levende cellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Fluorescentiemicroscopie
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- De ND6-probe is pH-gevoelig en specifiek ontworpen voor celmembranen.
- Eerdere methoden met gebruik van groene fluorescentie-eiwitten zijn indirect, terwijl ND6 een directe meting mogelijk maakt.
- De fluorescentie-intensiteit correleert met de protonering en deprotonering van de kopgroep.
- Het onderzoeken van exocytose en endocytose is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire signalering.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het direct observeren van lipidemembraandynamiek in levende cellen.
- Om de studie van fundamentele processen in de celbiologie te faciliteren.
- Om inzicht te verschaffen in mechanismen van vesikeltransport en membraaninteractie tijdens neuronale activiteit.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van live-cell imaging om fluorescentieveranderingen met behulp van ND6 in gecultiveerde neurale cellen te monitoren.
- De belangrijkste procedures omvatten de preparatie van een imagingkamer, de solubilisatie van ND6 en gecontroleerde perfusie.
- Beeldacquisitie wordt gesynchroniseerd met elektrische stimulatie en perfusieprotocollen.
- De statistische analyse omvat het berekenen van relatieve fluorescentieveranderingen en het genereren van binaire maskers voor regio's van belang.
Belangrijkste resultaten
- Heldere fluorescentie van ND6-puncta duidt op een succesvolle markering van synaptische blaasjes.
- Veranderingen in de ND6-fluorescentie correleren met de dynamiek van synaptische blaasjes tijdens stimulatie.
- Experimenten onthulden interacties tussen cholesterol en het transport van synaptische blaasjes.
- Behandeling met Baf A1 beïnvloedde het herstel van de ND6-fluorescentie, wat de rol van pH bij de re-acidificatie van blaasjes benadrukt.
Conclusies
- Dit protocol maakt gedetailleerde onderzoeken naar lipidemembraantransport in levende neuronen mogelijk.
- Inzichten uit deze methode dragen bij aan een beter begrip van de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan exocytose en endocytose.
- De bevindingen hebben belangrijke implicaties voor cellulaire signalering en neurobiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het meten van de omzetting van membraanlipiden biedt direct inzicht in de fysieke basis van exo-/endocytose, een proces dat centraal staat bij cellulaire signalering en vesikeltransport. De pH-gevoelige fluorescente lipide-analoga ND6 maakt real-time, kwantitatieve tracking mogelijk van lipiderecycle tussen het plasmamembraan en intracellulaire compartimenten, wat bijdraagt aan mechanistische risicoanalyse bij targetvalidatie en assay-ontwikkeling. Deze benadering verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door lipidedynamiek te koppelen aan functionele uitkomsten in secretie- en opnamepaden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar lipidemembraantransport mogelijk als therapeutische hypothese in secretie-gerelateerde routes.
- Operationele waarde: Biedt een directe uitlezing van de lipidomzetting, waardoor de afhankelijkheid van indirecte eiwitgebaseerde reporters wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door lipidendynamiek te correleren met de afgifte en terugwinning van blaasjes.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen die proportioneel zijn aan de lipidemembraandynamiek tijdens stimulatie.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare meting van exo-/endocytose-kinetiek in levende cellen mogelijk.
- Assay-gereedheid: Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen voor compound-screening en studies naar padmodulatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt metingen van lipidenomzetting met ziekterelevante systemen, zoals neuronale secretie en insulinerestrictie.
- Mechanistisch risicobeheer: Verduidelijkt de rol van membraancholesterol en pH bij vesikeltransport, wat bijdraagt aan inzicht in de veiligheid en effectiviteit van targets.
- Predictieve betrouwbaarheid: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door lipidendynamiek te koppelen aan functionele secretoire output.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische validatie door directe, kwantitatieve read-outs van lipidenmembraandynamiek te bieden, die bijdragen aan het mechanistische begrip en functionele screening.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests van lipid-gemedieerde mechanismen in exocytose- en endocytosepaden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-outputs voor het evalueren van compound-effecten op de lipid-omzetting.
- Analyses: Maakt de afleiding van gemiddelde fluorescentieveranderingen, kinetiek en normalisatiemetrieken mogelijk voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt lipid-dynamiek met secretie functies in neuronen en endocriene cellen, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het monitoren van lipid-membraantransport over verschillende celtypen en stimulatieparadigma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een directe, kwantitatieve meting van de omzetting van lipide-membranen, waardoor mechanistische ambiguïteit in secretiepaden wordt verminderd.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays voor lipidetransport mogelijk via pH-gebaseerde normalisatie en ROI-analyse.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door lipidedynamiek te koppelen aan functionele vesicle-afgifte en -terugwinning.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van targets die betrokken zijn bij membraantransport en secretoire processen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie, live-cell imaging en het omgaan met pH-gevoelige probes.
- Vereist instrumentatie voor gecontroleerde perfusie, temperatuurregeling en gesynchroniseerde stimulatie tijdens de beeldvorming.
- Vereist standaardisatie tussen teams van probeconcentratie, verdunning en beeldinstellingen voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende celtypen, membraansamenstellingen en stimulatieprotocollen.
- Omvat praktische beperkingen zoals het risico op fotobleken, de noodzaak voor donkere opslag en de optimalisatie van belichtingstijden en pH-oplossingen.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Microscope Setup, Loading and Imaging ND6 in Neuronal Cultures
4:17
Quantification of Membrane Trafficking by a Change in ND6 Fluorescence
6:44
Results: Membrane Lipid Turnover with the pH‐Sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6
8:00
Conclusion
