Name: Membraan Lipid Turnover meten met de pH-gevoelige fluorescerende lipide analoog ND6 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer membraanlipidendynamiek meten met de pH-gevoelige fluorescerende sonde ND6 in levende neuronen. Deze methode biedt directe inzichten in exocytose en endocytose tijdens synaptische activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry-subsidie (M.J.S.), Florida Department of Health Ed en Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association-subsidie AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) en NIA R21-subsidie AG061656-01A1 (Q.Z.).

Het volgende protocol omvat (1) een vereenvoudigde procedure voor het vaststellen van hippocampus- en corticale culturen van muizen op basis van een beproefd protocol22, (2) een korte inleiding tot een epifluorescentiemicroscoopopstelling voor levende neuronen, (3) een gedetailleerde beschrijving van het laden en afbeelden van ND6 in muizenneuronen, (4) een discussie over de kwantificering van membraantransport door ND6-signaal. Alle procedures volgen de bioveiligheids- en IACUC-richtlijnen van de Florida Atlantic University. De synthese van ND6 is eerder beschreven20.
1. Bereiding van hippocampus- en corticale culturen van muizen
NOTITIE: Tenzij anders aangegeven, moeten alle stappen worden uitgevoerd in een laminaire doorstromingskap van bioveiligheidsniveau 2. Steriliseer alle gereedschappen en materialen.
<ol><li>Gebruik een pincet maat 5 om glazen dekglaasjes in multiwell-kweekplaten te plaatsen. OPMERKING: Een plaat met 24 putjes is bijvoorbeeld ideaal voor dekglaasjes van 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> .</li>
	<li>Voeg het juiste volume extracellulaire matrices toe om het celkweekoppervlak te coaten (bijv. 75 μL basaalmembraanmatrixoplossing per dekglaasje van 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> ; zie de materiaaltabel)</li>
	<li>Plaats de voorbereide platen gedurende 1-4 uur in de weefselkweekincubator (5% CO2, 100% vochtigheid en 37 °C) om verknoping van de keldermembraanmatrix mogelijk te maken.</li>
	<li>Offer de dieren, open de schedel en breng de hele hersenen over in een petrischaal van 35 mm met 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 20% foetaal runderserum (H+20). Snijd de hersenen langs de middellijn en scheid de cortex en hippocampi in een laminaire flow-dissectiekap om besmetting te verminderen.</li>
	<li>Gebruik een microschaar om de weefsels in kleine stukjes te knippen (~1mm3). Breng die weefsels over in een conische buis van 15 ml met 5 ml H+20.</li>
	<li>Was de tissues drie keer met 5 ml H+20 en drie keer met 5 ml HBSS.</li>
	<li>Voeg 1,5 ml 1% trypsine met ethyleendiaminetetra-azijnzuur toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C voor enzymvertering.</li>
	<li>Herhaal stap 1.6 en gebruik vacuüm om HBSS uiteindelijk op te zuigen.</li>
	<li>Dissocieer de weefsels mechanisch in 1 ml HBSS met 2,95 g/l MgSO4•7H2O met behulp van een vuurgepolijste glazen pipet.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g, 4 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid kweekmedia om een concentratie van ~10.000.000 cellen/ml te verkrijgen.</li>
	<li>Plaat de cellen op ~1.000.000 cellen/cm2 en plaats de kweek gedurende 1-4 uur in de incubator (5% CO2, 100% vochtigheid en 37 °C) om de celbevestiging aan de glazen dekglaasjes te vergemakkelijken.</li>
	<li>Voeg een geschikte hoeveelheid kweekmedium toe (bijv. 1 ml per putje voor een plaat met 24 putjes). Voeg na 1 week hetzelfde volume kweekmedium toe. Vervang na 2 weken elke week de helft van het bestaande kweekmedium door verse media.</li>
</ol>2. Microscoopopstelling voor beeldvorming van fluorescentie met levende cellen
OPMERKING: Een voorbeeldige beeldvormingsopstelling (Afbeelding 5) omvat ten minste een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (zie de Materiaaltabel), fluorescentielichtbron met automatische sluiter, fluorescentiefiltersets (bijv. voor beeldvorming ND6, gebruik 405/10 BP voor excitatie, 495 LP voor dichroïsch en 510/20 BP voor emissie) en een zeer gevoelige camera (Materiaaltabel), die allemaal worden bestuurd door beeldacquisitiesoftware (Materiaaltabel).
<ol><li>Bereid een beeldvormingskamer voor die temperatuurregeling en in-/uitvoer van de oplossing mogelijk maakt voor fluorescentiebeeldvorming met levende cellen. OPMERKING: In dit protocol werd bijvoorbeeld een aangepaste beeldvormingskamer met open bad gebruikt die op een verwarmingsplatform was bevestigd (Afbeelding 6).</li>
	<li>Stel een programmeerbaar apparaat in om de perfusieoplossingen te schakelen en de elektrische stimulus op gedefinieerde tijdstippen tijdens de beeldvorming af te geven. OPMERKING: Hardware- en softwaresynchronisatie is noodzakelijk voor kwantitatieve analyses (Afbeelding 7). In dit protocol werd bijvoorbeeld een trigger-uitgang van de beeldcamera gebruikt om een computerprogramma te starten dat een automatisch schakelapparaat bestuurt, dat een meerkanaals perfusiesysteem en een vierkante pulsstimulator bestuurt.</li>
	<li>Om twee of meer fluorescerende reporters samen in beeld te brengen, voert u meerkanaals fluorescentiebeeldvorming uit door achtereenvolgens van filterset te wisselen of door tegelijkertijd verschillende fluorescentie-emissies te splitsen en op dezelfde camera te projecteren.</li>
</ol>3. Laden en beeldvorming van ND6 in neuronale culturen
<ol><li>Weeg een geschikte hoeveelheid ND6 af, los het op in dimethylsulfoxide (DMSO) en laat het bij kamertemperatuur oplossen; Kort soneren (bijv. 3 min). Filtreer de ruwe stockoplossing met een filter van 0,22 μm om grote kleurstofaggregaten te verwijderen. Bepaal na filtratie de kleurstofconcentratie door middel van absorptiespectroscopie bij 405 nm met behulp van een conventionele of microvolumespectrofotometer met behulp van ε = 10.700 M-1 cm-1.</li>
	<li>Verdun de stockoplossing vóór het aanbrengen met behulp van de badoplossing tot een concentratie van 1 μM. Bewaar de bouillonoplossing in het donker op kamertemperatuur.</li>
	<li>Etikettering van endosomen en synaptische blaasjes<ol><li>Om endosommen met endosomen alomtegenwoordig te labelen, voegt u ND6-voorraadoplossing (bijv. 1 mM in DMSO) toe aan het kweekmedium met een eindconcentratie van 1 μM en incubeert u bij 5% CO2, 100% vochtigheid en 37 °C gedurende 30 minuten. Om de mate van SV-etikettering te verminderen, moet u de spontane neuronale activiteit farmacologisch onderdrukken. Gebruik bijvoorbeeld tetrodotoxine om actiepotentialen te blokkeren of 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide (NBQX) en D-(-)-2-amino-5-fosfonopentaanzuur (D-AP5) om excitatoire transmissie te remmen23.</li>
		<li>Om SV's selectief te labelen, gebruikt u korte maar krachtige stimulatie om presynaptische exo-/endocytose op te roepen. Breng eerst het (de) kweekdekglaasje(s) over in een petrischaal van 35 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> met 2 ml normale tyrode-oplossing bij kamertemperatuur. Ten tweede, verdun de ND6-stockoplossing in de oplossing van hoge-K+ Tyrode (90 mM KCl) in de eindconcentratie van 1 μM. Ten derde, vervang de normale Tyrode-oplossing in de petrischaal door ND6-bevattende high-K+ Tyrode-oplossing en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de ND6-gelabelde celkweek over naar de beeldvormingskamer gevuld met voorverwarmde normale Tyrode-oplossing die 10 μM NBQX en 10 μM D-AP5 bevat.</li>
	<li>Pas de perfusiesnelheid aan tot ~0.2 ml/s (d.w.z. 1 druppel per seconde) en start de perfusie van voorverwarmde normale Tyrode-oplossing die NBQX en D-AP5 bevat om overmatig ND6 in de kweek te verwijderen.</li>
	<li>Pas de scherpstelling aan en zoek het juiste gezichtsveld met gezonde en goed verspreide neuronen met verbonden neurieten. Vermijd gebieden die onopgeloste kleurstofcolloïden bevatten.</li>
	<li>Probeer ND6-geladen cellen met verschillende belichtingstijden in beeld te brengen om de beste beeldvormingsinstellingen te bepalen. OPMERKING: Voor de beste belichtingstijd is de hoogste pixelfluorescentie-intensiteit in het resulterende beeld ongeveer de helft van het bitbereik (bijv. voor een 16-bits afbeelding is het bitbereik van 0 tot 65.535), wat een verdere toename van de fluorescentie mogelijk maakt wanneer de zure badoplossing wordt toegepast. De geselecteerde belichtingstijd moet worden gebruikt voor alle ND6-beeldvorming.</li>
	<li>Stel het stimulatie- en perfusieprotocol, het frame-interval en de totale duur in. Gebruik in het volgende protocol bijvoorbeeld een basislijn van 30 s, een elektrische veldstimulatie van 10 s 30 Hz, 50 s herstel, 120 s 90 mM K+, 60 s herstel, 60 s Tyrode-oplossing met 50 mM NH4Cl, 60 s Tyrode-oplossing bij pH 5.5 en een frame-interval van 3 s.</li>
	<li>Start de beeldacquisitie vergezeld van de gesynchroniseerde stimulatie en perfusie. Bewaak de simulatie en de uitwisseling van oplossingen tijdens de beeldvorming.</li>
	<li>Stop de perfusie nadat de beeldvorming is beëindigd, verwijder het dekglaasje en reinig de beeldvormingskamer voor de volgende proef.</li>
</ol>4. Kwantificering van membraantransport door een verandering in ND6-fluorescentie
<ol><li>Maak een back-up en/of maak een elektronische kopie van alle afbeeldingsbestanden.</li>
	<li>Kies een analyseprogramma voor data-extractie, bijvoorbeeld een open-source beeldanalysesoftware zoals ImageJ24 en/of FIJI25.</li>
	<li>Open of importeer een afbeeldingsstapel in het analyseprogramma.</li>
	<li>Stel de eerste afbeelding in als referentie en lijn de rest erop uit met behulp van functies/plug-ins zoals Rigid Registration26, die artefacten als gevolg van xy-drifting zullen verminderen. Zie afbeelding 8 voor bijvoorbeeld afbeeldingen.</li>
	<li>Bereken het gemiddelde van alle beelden die zijn verkregen tijdens de 30 seconden pre-baseline om een referentiebeeld te produceren. Bewaar een kopie van deze afbeelding voor toekomstig gebruik.</li>
	<li>Stel de intensiteitsdrempel in om een binair beeld te genereren op basis van het basislijngemiddelde beeld.</li>
	<li>Gebruik Watershed in ImageJ of vergelijkbare functies in een ander programma om verbindende neurieten of cellen te scheiden.</li>
	<li>Gebruik de functie Deeltje analyseren met de juiste gebiedsgrootte en circulariteit om interessegebieden (ROI's) te vragen die overeenkomen met celmembranen, endosomen, lysosomen of synaptische boutons. Sla alle geselecteerde ROI's op.</li>
	<li>Selecteer vier achtergrond-ROI's in celvrije gebieden binnen het gezichtsveld.</li>
	<li>Meet de gemiddelde pixelintensiteiten voor elke ROI in elk frame van de afbeeldingsstapel en exporteer de resultaten voor statistische analyse.</li>
	<li>Bereken de gemiddelde intensiteit van de achtergrond-ROI's als de basisruis, die wordt afgetrokken van de gemiddelde pixelintensiteiten voor elke ROI.</li>
	<li>Bereken het gemiddelde van de drie hoogste gemiddelde intensiteiten voor elke geselecteerde ROI tijdens de toepassing van pH 5.5 Tyrode-oplossing om de maximale fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, die wordt gedefinieerd als 100% voor normalisatie.</li>
	<li>Gemiddeld de drie laagste gemiddelde intensiteiten voor elke geselecteerde ROI tijdens de toepassing van 50 mM NH4Cl om de minimale fluorescentie-intensiteit in te stellen, die wordt gedefinieerd als 0% voor normalisatie.</li>
	<li>Bereken de relatieve fluorescentieveranderingen voor elke ROI op basis van zijn eigen 0% en 100% intensiteiten. Leid gemiddelde fluorescentieveranderingen, veranderingskinetiek en andere waarden/grafieken af uit individuele ROI-gegevens.</li>
</ol>

<ol><li>Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).</li>
<li>Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+and+beta-amyloid%3A+a+harmful+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Pept+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection.</a> Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).</li>
<li>Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis%3A+proteins+and+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis: proteins and perturbations.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).</li>
<li>Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+in+regulated+exocytosis%3A+what+are+they+doing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipids in regulated exocytosis: what are they doing.</a> Frontiers in Endocrinology. 4, 125(2013).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112 (4), 519-533 (2003).</li>
<li>Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+cellular+membranes%3A+a+convergence+with+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386(2017).</li>
<li>Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+pHluorin+for+quantitative%2C+kinetic+and+high-throughput+analysis+of+endocytosis+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587(2016).</li>
<li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li>
<li>Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biophysical+properties+of+lipid+membranes+by+environment-sensitive+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).</li>
<li>Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+recycling+by+staining+and+destaining+vesicles+with+FM+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).</li>
<li>Gaus, K., Zech, T., Harder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+membrane+microdomains+by+Laurdan+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy.</a> Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).</li>
<li>Kahms, M., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pH-sensitive+lipid+based+exo-endocytosis+tracers+reveal+fast+intermixing+of+synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18(2018).</li>
<li>Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+of+molecular+probes+based+on+the+fluorophore+4-amino-1%2C8-naphthalimide%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide.</a> Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).</li>
<li>Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l%2C8-Naphthalimide+based+DNA+intercalators+and+anticancer+agents.+A+systematic+review+from+2007+to+2017%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).</li>
<li>Ulla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+emitting+1%2C8-naphthalimides+with+electron+transport+properties+for+organic+light+emitting+diode+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications.</a> Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).</li>
<li>Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+fluorescent+anion+sensors%3A+An+overview+of+recent+developments+in+the+use+of+1%2C8-naphthalimide-based+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors.</a> Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).</li>
<li>Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+intramolecular+charge+transfer+%28ICT%29+process+in+push-pull+systems%3A+Effect+of+nitro+groups%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups.</a> RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+pH-sensitive+fluorescent+membrane+probes+for+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells.</a> ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).</li>
<li>Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+breadth+of+4-amino-1%2C8-naphthalimide+photophysical+properties+through+substitution+of+the+naphthalimide+core%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+-+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core.</a> Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).</li>
<li>Liu, G. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+synaptic+transmission+at+single+hippocampal+synaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons.</a> Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).</li>
<li>Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+provide+an+optical+signal+specific+to+full+collapse+fusion+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium+chloride+alters+neuronal+excitability+and+synaptic+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5061(2017).</li>
<li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).</li>
<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).</li>
<li>DelBove, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+modulation+between+amyloid+precursor+protein+and+synaptic+membrane+cholesterol+revealed+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging.</a> Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).</li>
<li>Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+sterols+are+essential+for+synaptic+vesicle+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling.</a> Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
<li>Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis-endocytosis+with+pH-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn.

Op lipiden gebaseerde kleurstoffen, zoals 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI) en 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanineperchloraat (DiO), worden al lang gebruikt om de celmorfologie te illustreren en cellulaire processen te volgen, zoals de axonprojecties van neuronen. Styrylkleurstoffen, zoals FM1-43, zijn uitgevonden en met succes gebruikt voor de studie van exocytose34. Vanwege hun lage membraanaffiniteit labelen ze selectief endocytose-blaasjes waar ze worden opgesloten, terw...

De lipide dubbellaag is een van de meest voorkomende biomolecuulassemblages en is onmisbaar voor alle cellen. Buiten de cellen vormt het het plasmamembraan dat de cellen en hun omgeving met elkaar verbindt; In cellen compartimenteert het verschillende organellen die gespecialiseerd zijn voor aangewezen functionaliteiten. In plaats van stilstaand, ervaren lipidemembranen voortdurend fusie en splijting, wat het transport van biomateriaal, organelhervorming, morfologische verandering en cellulaire communicatie bemiddelt. Ongetwijfeld is het lipidemembraan de fysieke basis voor bijna alle cellulaire processen, en de disfunctie ervan speelt een cruciale rol bij verschillende aandoeningen, variërend van kanker1 tot de ziekte van Alzheimer2. Hoewel lipidemoleculen veel minder divers zijn dan eiwitten, is membraanonderzoek tot nu toe vooral gericht geweest op eiwitten. Er is bijvoorbeeld veel meer bekend over eiwitmachines dan over lipiden in exocytose 3,4,5. Bovendien blijven de organisatie, distributie, dynamiek en homeostase van lipiden over oppervlakte- en intracellulaire membranen grotendeels onontgonnen in vergelijking met membraaneiwitten6.
Dit is niet verwonderlijk, aangezien moderne moleculair-biologische technieken, zoals mutagenese, een methodologisch voordeel bieden voor het bestuderen van eiwitten in plaats van lipiden. Transgene tagging van pH-gevoelig groen fluorescerend eiwit (ook bekend als pHluorin) naar vesiculaire eiwitten vergemakkelijkt bijvoorbeeld de kwantitatieve meting van de hoeveelheid en snelheid van vesiculaire eiwitomzet tijdens exo-/endocytose 7,8,9. Het is echter bijna onmogelijk om membraanlipiden in vivo genetisch te modificeren. Bovendien zijn kwalitatieve en zelfs kwantitatieve manipulaties van eiwithoeveelheden en -verdelingen veel haalbaarder dan die van lipiden10. Niettemin zijn native en synthetische fluorescerende lipiden geïsoleerd en ontwikkeld om endogene membraanlipiden in vitro en in vivo te simuleren11. Een groep veelgebruikte fluorescerende lipiden zijn styrylkleurstoffen, bijvoorbeeld FM1-43, die membraanversterkte fluorescentie vertonen en een krachtig hulpmiddel zijn bij het bestuderen van de afgifte van synaptische blaasjes (SV) in neuronen12. De laatste tijd zijn omgevingsgevoelige lipidekleurstoffen uitgevonden en op grote schaal gebruikt als een nieuwe klasse van verslaggevers om verschillende celmembraaneigenschappen te bestuderen, waaronder membraanpotentiaal11, fasevolgorde13 en secretie14.
Een nieuwe klasse van lipide-mimetica waarvan de fluorescentie zowel pH-gevoelig (bijv. pHluorin) als membraangevoelig (bijv. FM1-43) is, werd ontwikkeld om de lipideverdeling in het plasmamembraan en endosomen/lysosomen en het lipidenverkeer tijdens exo-/endocytose direct te meten. Hiervoor werden de bekende solvatochrome fluoroforen geselecteerd die push-pull-eigenschappen vertonen als gevolg van intramoleculaire ladingsoverdracht. Van de bestaande solvatochrome fluoroforen is de 1,8-naftalimide (ND)-steiger relatief eenvoudig aan te passen, veelzijdig voor tagging, en is uniek in de fotofysica15 en is daarom gebruikt in DNA-intercalatoren, organische lichtgevende diodes en biomolecuulsensoren 16,17,18.
Het bevestigen van een elektronendonerende groep aan de C4-positie van de ND-steiger genereert een push-pull-structuur, die leidt tot een verhoogd dipoolmoment door de elektronendichtheid in de aangeslagen toestand19,20 te herverdelen. Zo'n intramoleculaire ladingsoverdracht produceert grote kwantumopbrengsten en Stokes-verschuivingen, wat resulteert in heldere en stabiele fluorescentie21. Deze groep heeft onlangs een reeks solvatochrome lipide-analogen ontwikkeld op basis van de ND-steiger en deze verkregen met goede synthetische opbrengsten20.
Spectroscopische karakterisering toont aan dat ND6 van deze producten de beste fluorescentie-eigenschappen bezit (Figuur 1)20. Ten eerste heeft het goed gescheiden excitatie- en emissiepieken (d.w.z. respectievelijk ~400 nm en ~520 nm in figuur 2A,B) in vergelijking met populaire fluoroforen zoals fluoresceïne-isothiocyanaat, rodamine of GFP, waardoor het spectraal van hen kan worden gescheiden en dus nuttig is voor meerkleurige beeldvorming. Ten tweede vertoont ND6-fluorescentie een meer dan achtvoudige toename van de fluorescentie in aanwezigheid van micellen (Figuur 2C), wat wijst op een sterke membraanafhankelijkheid. Eerdere fluorescentiebeeldvormingsonderzoeken met levende cellen met verschillende soorten cellen toonden een uitstekende membraankleuring door ND620. Ten derde, wanneer de pH van de oplossing wordt verlaagd van 7,5 (vaak aangetroffen in extracellulaire of cytosolische omgevingen) tot 5,5 (vaak aangetroffen in endosomen en lysosomen), vertoont ND6 een ongeveer tweevoudige toename van de fluorescentie (Figuur 2D), wat de pH-gevoeligheid aangeeft. Bovendien geeft simulatie van de moleculaire dynamica aan dat ND6 gemakkelijk integreert in de lipidedubbellaag met zijn ND-steiger naar buiten gericht naar het membraan en piperazineresidu dat sterke interacties vertoont met fosfolipidekopgroepen (Figuur 3). Al met al maken deze eigenschappen ND6 tot een ideale fluorescerende lipide-analoog om de membraanlipideomzetting tijdens exo-/endocytose te visualiseren en te meten.
Dit artikel presenteert een methode om de omloopsnelheid en dynamiek van SV-lipiden te bestuderen met behulp van gekweekte hippocampusneuronen van muizen. Door neuronen te stimuleren met hoge K+ Tyrode-oplossingen, werden SV's en het plasmamembraan geladen met ND6 (Figuur 4A,B). Vervolgens werden neuronen opnieuw gestimuleerd met verschillende stimuli, gevolgd door NH4Cl-bevattende en pH 5,5 Tyrode-oplossingen (Figuur 4D). Dit protocol vergemakkelijkt de kwantitatieve meting van de geassembleerde exocytose- en endocytosepercentages onder verschillende omstandigheden (Figuur 4C).

<table><tbody><tr><td>Digidata 1440A Data Acquistion System</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Voor gesynchroniseerde stimulatie en oplossingsuitwisseling</td></tr><tr><td>Dual Channel Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>Voor live-cel beeldvorming</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>OMEGA Scientific</td><td>FB-01</td><td>Voor het maken van H+20 oplossing gebruikt bij dissectie en weefselkweek</td></tr><tr><td>Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera</td><td>Hamamatsu Inc.</td><td>C13440-20CU</td><td>hooggevoelige camera</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td>Voor het maken van H+20 oplossing gebruikt bij dissectie en weefselkweek</td></tr><tr><td>Heated Platform</td><td>Warner Instruments</td><td>PH-1</td><td>Voor live-cel beeldvorming</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Voor weefselkweek</td></tr><tr><td>Micro-G Vibration Isolation Table</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>Voor live-cel beeldvorming</td></tr><tr><td>Micro-manager</td><td>https://micro-manager.org/</td><td>NA</td><td>Voor beeldverwervingscontrole</td></tr><tr><td>Multi-Line In-Line Solution Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>SHM-6</td><td>Voor live-cel beeldvorming</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus Medium</td><td>THermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Voor weefselkweek</td></tr><tr><td>Nikon Ti-E Inverted Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/B</td><td>Voor live-cel beeldvorming</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C1340-20CU</td><td>Voor live-cel beeldvorming</td></tr><tr><td>Perfusion Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>Voor live-cel beeldvorming</td></tr><tr><td>Six-Channel Valve Control Perfusion System</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td>Voor oplossingsuitwisseling</td></tr><tr><td>Square Pulse Stimulator</td><td>Grass Instrument</td><td>SD9</td><td>Voor elektrische veldstimulatie</td></tr></tbody></table>

membraan lipid turnover meten met de ph-gevoelige fluorescerende lipide analoog nd6

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytose is een veelvoorkomend proces dat de uitwisseling van biomoleculen tussen cellen en hun omgeving en tussen verschillende cellen bemiddelt. Gespecialiseerde cellen gebruiken dit proces om vitale lichaamsfuncties uit te voeren, zoals insulinesecretie uit β cellen en het vrijkomen van neurotransmitters uit chemische synapsen. Vanwege zijn fysiologische betekenis is exo-/endocytose een van de meest bestudeerde onderwerpen in de celbiologie. Er zijn veel tools ontwikkeld om dit proces op gen- en eiwitniveau te bestuderen, waardoor er veel bekend is over de eiwitmachinerie die aan dit proces deelneemt. Er zijn echter zeer weinig methoden ontwikkeld om de membraanlipideomzet te meten, die de fysieke basis is van exo-/endocytose.
Dit artikel introduceert een klasse van nieuwe fluorescerende lipide-analogen die pH-afhankelijke fluorescentie vertonen en demonstreert hun gebruik om lipiderecycling tussen het plasmamembraan en de secretoire blaasjes te traceren. Met behulp van eenvoudige pH-manipulaties maken deze analogen ook de kwantificering van de lipidenverdeling over het oppervlak en de intracellulaire membraancompartimenten mogelijk, evenals de meting van de lipidenomloopsnelheid tijdens exo-/endocytose. Deze nieuwe lipidenreporters zullen van groot belang zijn voor verschillende biologische onderzoeksgebieden zoals celbiologie en neurowetenschappen.

SV's zijn gespecialiseerd in het vrijkomen van neurotransmitters via evoked exo-/endocytose27. SV's hebben een zeer zuur lumen (d.w.z. pH 5,5), wat ideaal is voor ND6. We gebruikten hoge K+ stimulatie om SV exo-/endocytose op te roepen om ND6 toegang te geven tot SV. Naar verwachting verschenen na het laden felgroene fluorescerende puncta langs neuronale processen (Figuur 9A). Het lijnprofiel in figuur 4B vertoonde een sterke overlap tussen...

Dit protocol presenteert een fluorescentiebeeldvormingsmethode die een klasse van pH-gevoelige lipidefluoroforen gebruikt om het transport van lipidemembranen tijdens celexocytose en de endocytosecyclus te volgen.

Membraan Lipid Turnover meten met de pH-gevoelige fluorescerende lipide analoog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Dit protocol beschrijft de karakterisering en toepassing van een nieuwe pH-gevoelige fluorescerende lipidensonde, specifiek voor celmembranen, waarmee onderzoekers exo- en endocytose in levende cellen kunnen volgen. De meeste eerdere verslaggevers over membraaneiwit op basis van pH-gevoelig groen fluorescentie-eiwit, dat indirect is. Als lipidenmimeticum integreert ND6 in het celmembraan en rapporteert zo getrouw het verkeer van lipidemembranen.ND6-sonde wordt alleen fluorescerend als deze is ingebed in een biologische membraanomgeving. De fluorescentie-intensiteit van die sonde correleert met protonering en deprotonering van de piperazinekopgroep. Het fluoresceert dus veel sterker bij een lagere pH.Exocytose en endocytose zijn alomtegenwoordige processen die ten grondslag liggen aan de secretie en opname van veel signaalmoleculen. Daarom kan ND6 worden gebruikt om enkele fundamentele vragen in de celbiologie en de biomedische wetenschappen te bestuderen. Haley, Oliver en Jonathan, studenten uit mijn lab, zullen de procedure demonstreren.Begin met het voorbereiden van een beeldvormingskamer die temperatuurregeling en oplossingsinvoer mogelijk maakt voor beeldvorming van levende celfluorescentie. Stel een programmeerbaar apparaat in om de perfusieoplossingen te schakelen en de elektrische stimulus op gedefinieerde tijdstippen tijdens de beeldvorming af te geven. Weeg een geschikte hoeveelheid ND6 af.Los het op in dimethylsulfoxide en laat het bij kamertemperatuur oplossen. Soneer vervolgens de oplossing kort. Filtreer de ruwe stockoplossing met behulp van een filter van 0,22 micrometer om grote kleurstofaggregaten te verwijderen.Bepaal met behulp van een conventionele of microvolumespectrofotometer de kleurstofconcentratie op 405 nanometer. Verdun de stockoplossing vóór het aanbrengen met behulp van de badoplossing tot een concentratie van één milligram per milliliter. Bewaar de bouillonoplossing in het donker op kamertemperatuur.Voeg ND6-voorraadoplossing toe aan het kweekmedium met een uiteindelijke concentratie van één microgram per microliter en incubeer deze om alomtegenwoordig endocytose-membraancompartimenten, zoals endosomen, te labelen. Om de mate van etikettering van synaptische blaasjes te verminderen, moet de spontane neuronale activiteit farmacologisch worden onderdrukt. Na het selectief labelen van synaptische blaasjes zoals beschreven in het manuscript, monteer je het dekglaasje met cellen in de beeldvormingskamer.Sluit de temperatuursensor, perfusie-ingang en vacuümtip aan op de beeldkamer. Pas de perfusiesnelheid aan tot ongeveer 0.2 milliliter per seconde en start de perfusie van voorverwarmde normale tyrode-oplossing die NBQX en DAP5 bevat om overmatig ND6 in de cultuur te verwijderen. Pas de scherpstelling aan en zoek het juiste gezichtsveld met gezonde en goed verspreide neuronen met verbonden neurieten.Het vermijden van gebieden met onopgeloste dicolloïden. Probeer ND6-geladen cellen met verschillende belichtingstijden in beeld te brengen om de beste beeldvormingsinstellingen te bepalen. Stel het stimulatie- en perfusieprotocol, het frame-interval en de totale duur in met behulp van de informatie in het tekstmanuscript.Start de beeldacquisitie vergezeld van gesynchroniseerde stimulatie en perfusie. Bewaak de stimulatie en oplossingsuitwisseling tijdens beeldvorming. Stop de perfusie nadat de beeldvorming is beëindigd.Verwijder het afdekglaasje en reinig de beeldvormingskamer voor de volgende proef. Maak een back-up en maak een elektronische kopie van alle afbeeldingsbestanden. Kies en open het analyseprogramma voor gegevensextractie.Open of importeer een afbeeldingsstapel in het analyseprogramma. Nadat u een binair masker hebt gegenereerd, gebruikt u de functie voor het analyseren van deeltjes met de juiste gebiedsgrootte en circulariteit om interessegebieden of ROI's te vragen die overeenkomen met celmembranen, endosomen, lysosomen of synaptische boutons. Selecteer vier achtergrond-ROI's in celvrije gebieden binnen het gezichtsveld.Sla vervolgens alle geselecteerde ROI's op. Lijn alle frames binnen de ND6 time-lapse-beeldstapels uit. Stel de eerste afbeelding in als referentie en lijn de rest erop uit met behulp van rigide registratie, waardoor artefacten als gevolg van XY-drifting worden verminderd.Sla vervolgens de uitgelijnde afbeeldingsstapels op. Pas de opgeslagen ROI's toe op uitgelijnde ND6-afbeeldingsstapels. Meet de gemiddelde pixelintensiteit van ND6-fluorescentie voor elke ROI in elk frame van de afbeeldingsstapel.Exporteer vervolgens de resultaten voor statistische analyse. Bereken de gemiddelde intensiteit van de achtergrond-ROI's om de basisruis te verkrijgen, die wordt afgetrokken van alle geselecteerde ROI's. Bereken het gemiddelde van de drie hoogste gemiddelde intensiteiten voor elke geselecteerde ROI tijdens de toepassing van pH 5,5 tyrode-oplossing om de maximale fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, gedefinieerd als 100% voor normalisatie.Bereken het gemiddelde van de drie laagste gemiddelde intensiteiten voor elke geselecteerde ROI tijdens de toepassing van 50 millimolair ammoniumchloride om de minimale fluorescentie-intensiteit in te stellen, gedefinieerd als 0% voor normalisatie. Bereken de relatieve fluorescentieveranderingen voor elke ROI op basis van zijn eigen 0%- en 100%-intensiteiten. Leid gemiddelde fluorescentieveranderingen, veranderkinetiek en andere waarden of grafieken af uit individuele ROI-gegevens.Heldergroene fluorescerende puncta langs de neuronale processen waren zichtbaar na het laden van de neuronale cellen met ND6. Een sterke correlatie tussen ND6- en FM464-fluorescentie-intensiteiten suggereerde ook synaptische blaasjeskleuring door ND6. Er werd een afname waargenomen in de ND6-fluorescentie als reactie op zowel elektrische stimulatie als stimulatie met een hoog kaliumgehalte, wat suggereert dat ND6 zich in het synaptische blaasjesmembraan bevindt en dat het lumen van het synaptische blaasje wordt geneutraliseerd tijdens de afgifte.Onder een uitputtende elektrische stimulatie verminderde de M-bèta-cd-behandeling de afgifte en het ophalen van synaptische blaasjes aanzienlijk, gemeten door ND-beeldvorming, wat suggereerde dat membraancholesterol de exocytose en endocytose van synaptische blaasjes vergemakkelijkt. Baf A1 verhinderde het herstel van ND6-fluorescentie na stimulatie door de herverzuring van opgehaalde synaptische blaasjes acuut te blokkeren. Basiskennis van fluorescentiemicroscopie is een must.Zorgvuldige planning voor fysiologische omstandigheden ter ondersteuning van beeldvorming van levende cellen is erg belangrijk. Het is van cruciaal belang om de concentratie van de ND-voorraadoplossing nauwkeurig te bepalen. Meet indien mogelijk voor elk gebruik de concentratie van de voorraadoplossing opnieuw.Houd het uit de buurt van direct zonlicht om het bleken van foto's en ontbinding van de sonde te voorkomen.

measuring-membrane-lipid-turnover-with-ph-sensitive-fluorescent-lipid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.

Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties

Het gebruik van fluoroforen voor in vivo beeldvorming kan sterk beperkt worden door opsonisatie, snelle klaring, lage detectiegevoeligheid en cytotoxische effecten op de gastheer. Encapsulatie van fluoroforen in liposomen door filmhydratie en extrusie leidt tot fluorescentiekwelving en bescherming, wat in vivo beeldvorming met hoge detectiegevoeligheid mogelijk maakt.

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor In Vivo Optical Imaging

We presenteren een nieuwe techniek om de laterale diffusie van een oppervlakteactieve soort op het vloeistof-vloeistof grensvlak te meten door een druppel monolaag samen te voegen met een platte monolaag.

Fluorescentie herstel na het samenvoegen van een druppel op de twee-dimensionale Verspreiding van een Phospholipid monolaag Meet

We beschrijven een op fluorescentie gebaseerde assay om fosfolipide-scrambling in grote unilamellaire liposomen gereconstitueerd met opsine te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

De fluorescentielekkagetest is een eenvoudige methode die het onderzoek van peptide / membraaninteracties mogelijk maakt om hun betrokkenheid bij verschillende biologische processen te begrijpen en vooral het vermogen van cel-penetrerende peptiden om fosfolipiden bilayers te verstoren tijdens een direct cellulair translocatieproces.

Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Dit protocol presenteert het gebruik van een gestopte stroommonsteromgeving om snel meerdere vloeibare oplossingen in situ te mengen tijdens een neutronenverstrooiingsmeting met een kleine hoek en om kinetische processen te bestuderen op nanometerlengteschalen en tweede tijdschalen.

Het meten van de tijdsevolutie van materialen op nanoschaal met stop-flow en small-angle neutronenverstrooiing

Lipofagie is een selectieve vorm van autofagie waarbij lipidedruppeltjes worden afgebroken. Disfuncties in dit proces worden in verband gebracht met de ontwikkeling van kanker. De precieze mechanismen zijn echter nog niet volledig begrepen. Dit protocol beschrijft kwantitatieve beeldvormingsbenaderingen om de wisselwerking tussen autofagie, lipidenmetabolisme en kankerprogressie beter te begrijpen.

Onderzoek naar de regulatie van katabolisme van lipidendruppels door middel van lipofagie

We beschrijven een methode voor het gebruik van cyclodextrine om de uitwisseling tussen lipiden van het plasmamembraan met exogene lipiden te bemiddelen. Deze techniek kan worden gecombineerd met experimenten die transmembraaneiwitten bestuderen, die zich anders gedragen in lipidevlotachtige omgevingen dan in niet-vlotachtige omgevingen.

Lipidenuitwisselingstest in levende cellen

Dit protocol beschrijft een in vitro test voor het meten van de cellulaire lipideopname in endotheelcellen na stimulatie met BODIPY-C12 en BODIPY-C16 fluorescerende analogen van verzadigde vetzuren met lange en zeer lange ketens. Deze methode is efficiënt en kan worden aangepast aan andere celtypen en biedt een nuttige benadering voor het bestuderen van het lipidenmetabolisme.

Kwantificering van de opname van endotheliale vetzuren met behulp van fluorescerende vetzuuranalogen

Leer membraanlipidendynamiek meten met de pH-gevoelige fluorescerende sonde ND6 in levende neuronen. Deze methode biedt directe inzichten in exocytose en endocytose tijdens synaptische activiteit.

Membraan Lipid Turnover meten met de pH-gevoelige fluorescerende lipide analoog ND6

Meer video's verkennen