Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht
22 juli 2021
Primaire weefsels verkregen van patiënten na totale knieartroplastiek bieden een experimenteel model voor artroseonderzoek met maximale klinische vertaalbaarheid. Dit protocol beschrijft hoe RNA uit zeven unieke knieweefsels kan worden geïdentificeerd, verwerkt en geïsoleerd om mechanistisch onderzoek bij menselijke artrose te ondersteunen.
Dit protocol moedigt het gebruik van primaire menselijke weefsels aan als een klinisch relevant model voor artroseonderzoek. Het uitvoeren van genexpressie en histologische analyses in deze weefsels kan nieuwe mechanistische inzichten opleveren. Deze techniek standaardiseert methoden voor de identificatie en verwerking van menselijke kniegewrichtcomponenten.
Het maakt de extractie van hoogwaardig RNA mogelijk dat voldoet aan de vereisten voor downstream genexpressie-assays. Het is een uitdaging om RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen uit zieke gewrichtsweefsels, dus het belang van schijnbaar onbeduidende stappen, zoals alles schoon en koel houden, moet niet worden onderschat. Thomas Wilson, een onderzoeksmedewerker en Navdeep Kaur, een postdoctoraal fellow van mijn laboratorium, demonstreren de procedure.
Begin met het identificeren van de harde weefsels, waaronder kraakbeen, bot en meniscus en zachte weefsels, inclusief infrapatellaire vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier van het monster op basis van de verschillen in de grootte, vorm, kleur en textuur. Snijd elk van de weefsels in drie secties. Spoel de weefselsecties af met steriel PBS om eventuele resten of vuil te verwijderen.
Voor RNA-extractie snijdt u elk van de drie weefselsecties in kubussen van ongeveer één tot twee millimeter. Breng de kleinere stukjes over in een cryoflacon van twee milliliter. Nadat u de doppen stevig hebt vastgeklemd, vriest u de injectieflacons in door ze gedurende 30 seconden onder te dompelen in vloeibare stikstof, breng de injectieflacon vervolgens over naar de vriezer van min 80 graden Celsius voor langdurige opslag en herhaal deze procedure voor alle weefsels.
Homogeniseer het harde weefsel met behulp van een vijzel en stamper. Koel vóór de homogenisatie de vijzel, stamper en spatel af met vloeibare stikstof om te voorkomen dat het monster ontdooit. Verwerk slechts één monster tegelijk.
Breng het weefselmonster over in de mortel met behulp van een gekoelde spatel. Giet vloeibare stikstof op het weefsel. Nadat de vloeibare stikstof is verdampt, verplettert u het weefsel met een stamper.
Voeg herhaaldelijk vloeibare stikstof toe tijdens het malen van het weefsel om fijn weefselpoeder te verkrijgen. Breng het fijne weefselpoeder over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, voorgekoeld door gedurende 30 seconden onder te dompelen in vloeibare stikstof. Voeg een milliliter van de ijskoude zure guanidiniumfenoloplossing toe aan elke buis en incubeer de buizen gedurende 20 minuten op ijs.
Voordat u verschillende harde weefsels homogeniseert, reinigt u de vijzel, stamper en spatel grondig met 70% ethanol, vervolgens met RNase-ontsmettingsmiddel, gevolgd door DEPC-behandeld water. Week de vijzel, stamper en spatel in 70% ethanol en veeg vervolgens alle resterende vloeistof af met een schoon, pluisvrij weefsel. Homogeniseer het zachte weefsel met behulp van de weefselhomogenisator.
Voor het desinfecteren van de homogenisator wast u de sonde door buizen van 70% ethanol en RNase-ontsmettingsmiddel gedurende 30 seconden per wasbeurt en vervolgens te wassen met MET DEPC behandeld water, gevolgd door nog eens 70% ethanol, elk gedurende 30 seconden. Veeg alle resterende vloeistof af met een schoon, pluisvrij weefsel. Voeg één milliliter zure guanidiniumfenoloplossing toe aan voorgelabelde, vijf milliliter ronde bodembuizen en breng het weefselmonster over in de buis.
Plaats de buis gedurende de hele procedure op ijs en homogeniseer het weefsel gedurende maximaal vijf 32e pulsen, of totdat het weefsel visueel is opgelost. Incubeer het gehomogeniseerde weefsel op ijs totdat alle weefselmonsters zijn verwerkt. Desinfecteer en reinig de homogenisator voordat u het volgende weefselmonster verwerkt.
Verwijder met behulp van een steriele tang alle weefselbrokken die aanwezig zijn in de tanden van de sonde. Incubeer al het gehomogeniseerde weefsel op het ijs gedurende nog eens 20 minuten en breng het weefselmonster vervolgens over naar een vooraf gelabelde, voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Zeven unieke menselijke kniegewrichtsweefsels verkregen van artrosepatiënten werden binnen vier uur na chirurgische verwijdering verwerkt.
De weefsels werden visueel geïdentificeerd en bevestigd door H& E histologische kleuring. De H & E gekleurde harde weefselsecties, gewrichtskraakbeen, subchondraal bot en meniscus werden gevisualiseerd bij zes keer vergroting en 40 keer vergroting. Evenzo werden de H & E-gekleurde weke delen, infrapatellaire vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier gevisualiseerd bij zes keer vergroting en vervolgens bij 40 keer vergroting.
De kwaliteitsbeoordeling van geëxtraheerd RNA wees op de aanwezigheid van hoogwaardige monsters op basis van integriteit, opbrengst en zuiverheid, evenals monsters van lage kwaliteit, wat suggereert dat ondanks het gebruik van een geoptimaliseerde methode, externe factoren zoals de ernst van de ziekte van invloed kunnen zijn op de RNA-kwaliteit in verschillende weefsels van dezelfde patiënt. Een correcte identificatie van elk weefseltype is noodzakelijk om intra- en interweefselvergelijkingen binnen en tussen patiëntmonsters mogelijk te maken, vooral gezien de aanzienlijke heterogeniteit van primaire ziekteweefsels. Sequencingtechnologieën evolueren snel en isolatie van hoogwaardig RNA is een cruciale voorwaarde voor het gebruik van deze technologieën om onderliggende weefselspecifieke mechanismen bij complexe, chronische ziekten zoals artrose te ontrafelen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de extractie van hoogwaardig RNA uit primaire menselijke kniegeweefsels, verkregen na een totale knieprothese, om onderzoek naar artrose verder te bevorderen. De beschreven methode biedt een gestandaardiseerde aanpak voor het verwerken en isoleren van RNA uit unieke componenten van het kniegewricht, wat mechanistische analyses bij artrose faciliteert.
Belangrijkste studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Onderzoek naar artrose
- Genexpressieanalyse
- Histologisch onderzoek
Achtergrond
- Gebruik van primaire menselijke weefsels als relevant model
- Uitdagingen bij het verkrijgen van kwalitatief RNA uit zieke weefsels
- Belang van methodologische precisie bij RNA-extractie
Gebruikte methoden
- Isolatie van RNA uit hard en zacht knieweefsel
- Humane primaire weefsels van patiënten met artrose
- Histologische kleuring en kwaliteitsbeoordeling van RNA
Belangrijkste resultaten
- RNA-extractie geoptimaliseerd voor diverse kniegeweefsels
- Waargenomen integriteit en zuiverheid van RNA-monsters
- Effectieve identificatie van weefseltypen voor vergelijkende analyse
Conclusies
- Het protocol vergroot het inzicht in de mechanismen van artrose
- Ondersteunt verder onderzoek met behulp van high-throughput sequencing-technologieën
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het isoleren van hoogwaardig RNA uit primaire menselijke osteoarthritische weefsels maakt fysiologisch relevante genexpressiestudies mogelijk die targetvalidatie en mechanistische risicovermindering bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor artrose ondersteunen. Deze aanpak slaat een brug tussen ontdekkingsbiologie en translationeel onderzoek door ziekterelateerde systemen te bieden voor preklinische targetbevestiging en biomarkerexploratie. Gestandaardiseerde weefselverwerking verbetert de reproduceerbaarheid tussen monsters, waardoor de biologische variabiliteit in downstream-assays wordt verminderd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar ziektemechanismen in meerdere gewevesets van gewrichten mogelijk om therapeutische doelwitten te valideren in een fysiologisch relevante context.
- Operationele waarde: Ondersteunt een consistente RNA-opbrengst en -integriteit voor betrouwbare downstream sequencing en qPCR-assays.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt gestandaardiseerde protocollen voor weefselhomogenisatie van harde en zachte weefsels, waardoor vergelijkbare input voor assay-ontwikkeling wordt gegarandeerd.
- Operationele waarde: Vestigt RNase-vrije workflows en weefselspecifieke disruptiemethoden die essentieel zijn voor de standaardisatie van assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt vergelijkingen tussen verschillende weefsels om geconserveerde pathways en weefselspecifieke reacties bij artrose te identificeren.
- Operationele waarde: Maakt biobanking van snel ingevroren weefsels mogelijk voor longitudinale studies en reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode ondersteunt workflows voor vroege ontdekking door hoogwaardig RNA uit primaire menselijke weefsels te genereren, wat bijdraagt aan de selectie van targets en pathway-analyse voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk via genexpressieprofilering van kraakbeen, bot, synovium en andere gewevens van het gewricht om ziektepaden te verduidelijken.
- Screening: Levert gestandaardiseerde RNA-inputs die geschikt zijn voor transcriptomische screening en campagnes voor de ontdekking van biomarkers.
- Analytics: Levert kwantitatieve statistieken voor RNA-integriteit, opbrengst en zuiverheid, waardoor normalisatie tussen monsters en vergelijkbaarheid van gegevens mogelijk worden.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door RNA-extractie mogelijk te maken uit klinisch relevante weefsels verkregen tijdens een totale knieprothese.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een schaalbaar kader voor weefselverwerking dat toepasbaar is op meerdere artrosestudies en crossfunctionele teams.
Operationele & Bedrijfskundige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanische ambiguïteit te verminderen via moleculaire profilering van meerdere weefsels.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde cold-chain handling en weefselspecifieke disruptietechnieken.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mens-relevante gegevens te verschaffen die de risico's bij de selectie van targets verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van concordante expressie in ziekte-relevante weefsels.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in weefseldissectie, RNA-behandeling en RNase-vrije technieken om degradatie te voorkomen.
- Vereist toegang tot vloeibare stikstof, cryogene opslag en weefselhomogenisatoren of een vijzel en stamper voor monsterverwerking.
- Vraagt om standaardisatie van RNA-extractieprotocollen voor zowel harde als zachte weefseltypen om vergelijkbaarheid te garanderen.
- Vereist aanpassing van disruptiemethoden op basis van de dichtheid van de weefselmatrix (bijv. pulverisatie voor kraakbeen, homogenisatie voor synovium).
- Beperkt door inter-patiëntvariabiliteit in RNA-integriteit, wat stratificatie van donoren en drempelwaarden voor kwaliteitscontrole noodzakelijk maakt.
