Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

Dit protocol vult een technische leemte op voor de biochemische studie van C.elegans en breidt hun nut als modelorganisme uit. Deze techniek is zowel eenvoudig als robuust, waardoor een consistente isolatie van functioneel actief C.elegans nucleair extract mogelijk is. Begin met het plaatsen van de gesynchroniseerde L1-dieren op 10 150 millimeter nematodengroeimedia-bevattende platen gezaaid met Escherichia coli OP50, en laat de dieren 48 uur groeien bij 20 graden Celsius totdat ze het L4-stadium bereiken.

Zodra de hypotone en hypertone buffers zijn voorbereid, reinigt u de Balch-homogenisator door de maalkamer te overspoelen met 70% ethanol. Spoel vervolgens de kamer af met gedeïoniseerd water om de overtollige ethanol te verwijderen. Steek de wolfraamcarbidekogel in de maalkamer.

Dek de uiteinden van het vat van de Balch-homogenisator af en zet de doppen vast met de meegeleverde duimschroeven. Bereid vervolgens vijf milliliter van de volledige hypotone en hypertone buffers per monster zoals beschreven in het tekstmanuscript. Vul vervolgens een steriele spuit van twee milliliter met één milliliter volledige hypotone buffer en spoel voorzichtig de maalkamer van de Balch-homogenisator, waardoor ongeveer 500 microliter volledige hypotone buffer in de kamer overblijft.

Bewaar de gespoelde homogenisator op ijs en laat 30 minuten afkoelen. Verzamel de goed gevoede L4-dieren met M9-buffer in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de dieren gedurende drie minuten op 1.000 keer g. Verwijder het supernatant en ga door met het wassen van de dierlijke pellet totdat het supernatant helder is.

Was de dieren vervolgens met drie milliliter koude hypotone buffer en centrifugeer opnieuw zoals aangetoond. Voeg na het verwijderen van de supernatant hypotone buffer één milliliter volledige hypotone buffer toe aan de dierlijke pellet en breng de dierlijke suspensie over naar een nieuwe steriele spuit van twee milliliter. Voor het homogeniseren van de dieren die op ijs worden gehouden, duwt u de dieren voorzichtig door de maalkamer van de Balch-homogenisator geladen met de wolfraambal.

Verzamel vervolgens de dieren terug in de spuit en herhaal deze procedure 30 keer. Na 30 cycli van homogenisatie verzamelt u de maximale dierlijke suspensie van de Balch-homogenisator en bewaart u de spuit met de punt naar beneden geplaatst in een microbuis van 1,7 milliliter. Verwijder de wolfraambal en maak de maalkamer schoon met gedeïoniseerd water.

Droog en breng de bal terug naar de betreffende gelabelde buis. Steek vervolgens de wolfraamkogel met een diameter van 7,9880 millimeter en een opening van 12 micrometer in de slijpkamer en sluit de homogenisator opnieuw. Spoel de maalkamer opnieuw met één milliliter ijskoude complete hypotone buffer.

Maal de ophanging 25 keer zoals aangetoond. Breng de dierlijke suspensie over in een schone microbuis van 1,7 milliliter en bewaar de suspensie op ijs. Pellet de dierenlichamen en het puin door centrifugeren.

Pipetteer 40 microliter van het supernatant naar een buis die is gelabeld als ingangsfractie en bewaar de fractie op ijs. Breng het resterende supernatant over naar een nieuwe buis van 1,7 milliliter zonder de pellet te verstoren en centrifugeer om de kernen te pelleteren. Breng vervolgens het supernatant zonder de gepelleteerde kernen te verstoren over naar een nieuwe buis van 1,7 milliliter die is gelabeld als cytosolische fractie.

Om de kernpellet te wassen, voegt u 500 microliter volledige hypotone buffer toe aan de pellet, suspensie van de pellet en centrifugeert u gedurende vijf minuten bij 4.000 maal g bij vier graden Celsius. Aan het einde van de centrifugatie resuspendeert u de nucleaire pellet in 500 microliter verse volledige hypotone buffer en centrifugeert u het monster opnieuw zoals aangetoond. Los vervolgens de pellet op in 40 microliter volledige hypertone buffer.

Breng de nucleaire suspensie over naar een nieuwe buis van 1,7 milliliter met het label nucleaire fractie en sla deze op ijs op. Bepaal de eiwitconcentratie van drie fracties met behulp van een fluorescerende kwantificeringskit. Aliquot de nucleaire fracties in buizen voor eenmalig gebruik die zes microgram van het nucleaire eiwit bevatten, en snap freeze in droogijs en ethanolbad.

Bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. De representatieve gelafbeelding toont de transcriptieproducten van Caenorhabditis elegans L4 larven nucleair extract met behulp van de CMV promotor DNA-sjabloon. De succesvolle isolatie van actieve nucleaire eiwitten resulteerde in een 132 basenpaarband na een in vitro transcriptie, en mislukte isolatie resulteerde in een zwakke band of de afwezigheid van een band.

Vergeet niet om de volledige buffers duidelijk te labelen. Ongepaste buffers kunnen de functionaliteit van de nucleaire eiwitten schaden. Houd de homogenisator ook ijskoud om denaturering van de eiwitten te voorkomen.

Door deze techniek te ontwikkelen, konden onderzoekers de snelheid van RNA-transcriptie van C.elegans tijdens stressvolle omstandigheden meten, waaruit bleek dat de transcriptiesnelheid van het dier kan veranderen afhankelijk van de omgevingsomstandigheden.