Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

De techniek die we vandaag presenteren, maakt de analyse van de activiteit van ruggenmergneuronen mogelijk als gevolg van intrinsieke neuronale factor en de invloed van omringende astrocyten. Deze techniek genereert op betrouwbare wijze zowel menselijke neuronen als menselijke astrocyten die specifiek zijn voor het ruggenmerg en maakt gebruik van een functionele outputmaat die kan worden geschaald voor reproduceerbaarheid. De techniek die we presenteren maakt het mogelijk om spinale neuronen specifieke ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose te onderzoeken, met behulp van neuronen van patiënten met sporadische of genetische ziekte.

Onderzoek om te beginnen de menselijke iPSC-platen op voldoende dichte kolonies, zodat het centrum van de kolonies verspreide witte gebieden vertoont. Om vervolgens te beginnen met het verpakken van de cellen, tekent u rasterlijnen op het onderste buitenoppervlak van de platen met een marker om een nauwkeurige dekking van de hele plaat te vergemakkelijken. Gebruik een fasecontrastmicroscoop van 10x vergroting in een cultuur om gedifferentieerde kolonies los te maken door handmatig te schrapen met een pipetpunt van 200 microliter.

Spoel vervolgens de platen twee keer af met PBS. En voeg vervolgens vijf milliliter weefseldissociatieprotease toe, voorverwarmd bij 37 graden Celsius. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vier tot zeven minuten totdat de randen van de kolonies naar boven beginnen te ronden, voordat je kolonies van de plaat optilt.

Zuig de dissociatieprotease voorzichtig op en spoel de plaat twee keer voorzichtig af met PBS zonder de kolonies te ontwrichten. Voeg vijf milliliter voorverwarmd menselijk iPSC-medium toe aan de kweekplaat. Kras vervolgens de hele plaat met een punt van een pipet van vijf milliliter met behulp van een heen en weer beweging van boven naar beneden en til de kolonies op terwijl ze worden opgesplitst in kleinere celaggregaten.

Voor differentiatie van menselijke iPSC in neurale voorlopercellen. Zodra menselijke iPSC een monolaag vormt en 90% confluent wordt, begint u met differentiatie zoals beschreven in het manuscript. Op de 12e dag, na trypsinebehandeling, als de cellen niet in suspensie zijn, worden cellen mechanisch losgemaakt door neuraal inductiemedium uit een 1000 microliter pipetpunt op de cellen te werpen met een cirkelvormige beweging om het hele oppervlak te bedekken.

Als de neurale voorlopercelculturen bevroren waren, ontdooi ze dan. Na mediumuitwisseling en PBS-spoeling zoals beschreven in het manuscript, verander het medium met een motorneurondifferentiatiemedium dat 0,02 micromolaire cytosine arabinoside bevat en incubeer vervolgens de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide wanneer glial committed voorlopers verschijnen als enkele prolifererende platte cellen onder post-mitotische motorneuronvoorlopercellen, geaggregeerd in celclusters. Later, uitgevoerd medium uitwisseling zoals aangegeven in het manuscript.

Begin op de dag van het plateren of ervoor met het coaten van de 24 MEA-platen door plo eerst in water of PBS te verdunnen. Voeg vervolgens 15 tot 20 microliter PLO toe aan elke put en vorm een druppel in het midden van de put, die het elektrodegebied bedekt en ervoor zorgt dat elektroden niet worden beschadigd met de pipetpunt. Voeg water toe aan de compartimenten rondom putten en zorg voor voldoende vochtigheid.

En incubeer PLO bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Gebruik vervolgens een plastic micropipetpunt om zoveel mogelijk PLO te zuigen zonder de elektroden aan te raken. Was vervolgens de put drie keer met 250 microliter water.

Verwijder met een pipetpunt zoveel mogelijk water en laat het oppervlak drogen met het deksel verwijderd. Voeg vervolgens 15 tot 20 microliter verdund laminine toe om elke elektrode-array te bedekken. Na het toevoegen van water aan de vochtigheidscompartimenten en het vervangen van het deksel, incubeer je bij 37 graden Celsius gedurende minimaal twee uur tot een nacht.

Voeg op de dag van plating, na het eenmaal spoelen van de motorneuronen en astrocytenculturen met PBS, 0,05% trypsine toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer vijf minuten om cellen op te tillen. Verzamel cellen in een conische buis van 15 milliliter die trypsineremmer bevat. En was platen met medium of basis om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld.

Pellet de cellen door middel van centrificatie. En dan met behulp van een pipet van 1000 microliter, resuspend motorneuronen en astrocyten met een co-kweekmedium dat 20 micromolaire ROCK-remmer bevat om één milliliter van een eencellige suspensie te genereren. Tel met behulp van een hemocytometer de motorneuronen en astrocyten.

En tijdens het tellen, hield de cel suspensies en plaats ze in een piepschuimen rek op vier graden Celsius. Centrifugeer één milliliter van beide celsuspensies bij 300 maal G gedurende vijf minuten. Bereken het gewenste volume en resuspendeer de pellets.

Combineer het vereiste volume neuron- en astrocytensuspensies in gelijke verhoudingen en meng voorzichtig door twee keer te pipetteren om grondig te combineren. Verwijder vervolgens laminine uit elke put van de plaat en breng 10 microliter van de uiteindelijke gecombineerde celsuspensie over naar elke put, waarbij een kleine druppel wordt gevormd die de elektrode-array bedekt. Incubeer de platen met een ongestoorde celdruppel bij 37 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om de eerste bevestigingen op de platen te vormen.

Pipetteer vervolgens 250 microliter warme co-kweekmedia met ROCK-remmer op de wand van elke put en pipetteer hetzelfde volume op de tegenoverliggende wand van elke put en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 24 tot 36 uur. De volgende dag onderzoekt u de platen op puin of dode cellen. En vervang indien nodig het medium door een vers co-kweekmedium dat ROCK-remmer bevat.

Voer anders twee keer per week halve mediumuitwisselingen uit met behulp van een co-kweekmedium zonder een ROCK-remmer vanaf co-kweekdag twee. Om de opname uit te voeren, begint u zo snel mogelijk na co-kweekdag één door de temperatuur in te stellen op 37 graden Celsius en koolstofdioxide op 5%Breng vervolgens platen over naar het opnameapparaat en balanceer gedurende ten minste vijf minuten voordat u opneemt. Registreer de basislijnactiviteit om de andere dag of wekelijks gedurende één tot 15 minuten, afhankelijk van het experimentele ontwerp.

Om de voorbijgaande elektrofysiologische effecten van verbindingen gericht op neuronen of astrocyten te onderzoeken, verwijdert u het plaatdeksel, maar houdt u het machinedeksel gesloten en registreert u de basisactiviteit gedurende minimaal één minuut. Open het deksel van de machine handmatig zonder de elektrofysiologische opname te stoppen en wissel 25 microliter medium uit met het juiste geneesmiddelvoertuig. Sluit vervolgens het deksel handmatig en neem indien nodig extra minuten op.

Test op dezelfde manier het medicijn van belang. In dit protocol werden hiPSC's gehandhaafd en doorgegeven als niet-confluente kolonies. Neurogenese werd geïnitieerd door dubbele SMAD-remming door BMP- en TGF-bètaroutes te inactiveren.

De resulterende neuro-epitheelstamcellen deelden en genereerden een meerlagig epitheel. De vroege blootstelling aan neuronale groeifactoren en een gliogene ciliaire neurotrofe factor genereerde een gemengde populatie van voorlopercellen. Neuronen ontstonden spontaan uit deze gemengde populatie.

De gliogene schakelaar induceerde astrocytendifferentiatie door activering van de JAK-STAT-route. De ruggenmergidentiteit van met notchremmers behandelde en gedifferentieerde motorneuroncellen werd ondersteund door hoge choline-acetyltransferase-expressieniveaus. Op de 90e dag na de in vitro kweek vertoonden menselijke iPSC-astrocyten een rijpend fenotype zoals aangegeven door S100-bèta en GFAP-expressie, terwijl hun regionale identiteit van het ruggenmerg eerder werd ondersteund door expressie van haviken.

Co-gekweekte cellen herschikten spontaan met astrocyten die een voedingslaag aan de onderkant creëerden en neuronen die netwerken aan de bovenkant verbinden. Neuronen geaggregeerd in grote celclusters wanneer ze alleen worden gekweekt, terwijl de co-cultuur van menselijke iPSC-motorneuronen met menselijke iPSC-astrocyten resulteerde in gelijkmatig verdeelde monolagen. Menselijke iPSC-astrocyten verbeterden de elektrofysiologische rijping van menselijke iPSC-motorneuronen, zoals blijkt uit hogere graden van spiking en bursting-activiteit in de co-culturen.

Onze ervaring is dat de stamcelkweek en vroege NPC-differentiatie het moeilijkst en gevoeligst zijn voor technische fouten. In dit stadium mogen de technieken niet worden uitgevoerd met consistentie en nauwkeurigheid met weinig marge voor het oplossen van problemen. De hier beschreven co-kweektechnieken kunnen ook in andere celtypespecifieke modellen worden gebruikt.