Name: Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer hoe mesenchymale stamcellen de fagocytose van macrofagen reguleren met behulp van pH-gevoelige fluorescente deeltjes. Deze co-cultuurtechniek biedt inzicht in aangeboren immuniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het NSF Major Research Instrument-mechanisme onder subsidienummers 1626093 en 1919583.

<ol><li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Mesenchymal+stem%2Fmultipotent+stromal+cells%3A+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li>
<li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+sensors+and+switchers+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li>
<li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4%28%2B%29+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li>
<li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988(2011).</li>
<li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li>
<li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088(2010).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252(2010).</li>
<li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive%2Fanti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li>
<li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages%3A+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li>
<li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).</li>
<li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1%2FM2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).</li>
<li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li>
<li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).</li>
<li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c%2FEBP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li>
<li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye%2C+pHrodo-SE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Analyse van fagocytose met behulp van biodeeltjes geconjugeerd tot een pH-gevoelige kleurstof is een relatief nieuw hulpmiddel dat voordelig is gebleken ten opzichte van traditionele fluorescerend gelabelde deeltjes12,19,20. Met traditionele fluorescerend gelabelde deeltjes is alleen eindpuntanalyse mogelijk. Detectie wordt uitgevoerd met fluorescerende microscopie en/of spectrofluormetrie na het wassen of blussen van deeltjes d...

Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn voorlopercellen die aanleiding geven tot bindweefselcellen. MSC zijn aanwezig in volwassen zoogdierweefsels en kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg1. Vanwege hun immunomodulerende eigenschappen worden deze cellen op grote schaal bestudeerd2. Vroege studies richtten zich op MSC-regulatie van T-cellen3,4,5,6, maar meer recent heeft hun regulatie van macrofaagcellen (MΦ), een belangrijke cellulaire component van aangeboren immuniteit, meer aandacht gekregen7,8,9,10,11,12,13,14 . Het belang van MSC-MΦ-interactie bij de behandeling van ontstekingsziekten wordt onderstreept door het feit dat uitputting van monocyten / macrofagen de therapeutische effecten van MSC in diermodellenopheft 8. Hier ligt de focus op de celcontactinteractie van de MSC met MΦ. MSC heeft de capaciteit om het fenotype van MΦ te reguleren door de overgang van inflammatoire naar ontstekingsremmende reacties te bevorderen, wat leidt tot weefselherstelactiviteiten8,9,10,11,en er is veel gedaan om deze regulerende mechanismen aan te tonen. Onder andere omstandigheden kan MSC een door MΦ aangedreven ontstekingsreactie12, 13 ondersteunen of verergeren en de fagocytische activiteit van MΦverbeteren 14,15. Er is echter een kritiek gebrek aan bestaande gegevens die de mechanismen identificeren waarbij en de omstandigheden waaronder MSC de fagocytische activiteit van MΦ reguleert.
MΦ hebben families van receptoren die ofwel opsonized (antilichaam of complement gecoat) of niet-opsonized pathogenen herkennen die leiden tot fagocytose16. De activering en activiteit van de laatste is minder goed bestudeerd17. In een niet-inflammatoire in vitro omgeving verbetert MSC MΦ fagocytose van niet-opsonized pathogenen13. Herkenning van niet-opsonized pathogenen door MΦ kan echter worden verminderd na blootstelling aan een inflammatoire omgeving geproduceerd door lymfocyten tijdens een adaptieve immuunrespons. IFN-γ, vrijgegeven door natural killer cellen en effector lymfocyten, heeft een remmend effect op MΦ fagocytose van niet-opsonized deeltjes18. Een co-cultuurmodel werd ontwikkeld om de mechanismen van MSC directe contactregulatie van MΦ fagocytose te bestuderen. Het doel van het hier gepresenteerde experiment is om te bepalen of MSC MΦ fagocytose van niet-opsonized pathogenen reguleert nadat MΦ zijn blootgesteld aan IFN-γ (Figuur 1).

<table><tbody><tr><td>96 Well Black Polystyrene Microplate</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>0.4% trypan blue solution</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)&nbsp;Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7 Imaging System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75&nbsp;cm2, canted neck, with cap, filtered</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Muis MSC Cell Line</td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>FisherScientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>Muis M&Phi; Cell Line</td></tr><tr><td>LADMAC Cell Line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>LADMAC cellen scheiden de groeifactor colony stimulerende factor 1 (CSF-1) uit.</td></tr><tr><td>Live-Cell Imaging solution</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&gamma;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 &micro;m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Sterile syringe filters, 0.2 micrometer</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; kwantificering en beeldvorming

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymale stamcellen (MSC) zijn traditioneel bestudeerd voor hun regeneratieve eigenschappen, maar meer recentelijk hebben hun immunoregulerende kenmerken op de voorgrond gestaan. Ze interageren met en reguleren de activiteit van immuuncellen. De focus van deze studie ligt op de MSC-regulatie van macrofaag fagocytische activiteit. Macrofaag (MΦ) fagocytose is een belangrijk onderdeel van de aangeboren reactie van het immuunsysteem op infectie, en de mechanismen waarmee MSC deze respons moduleert, worden actief onderzocht. Hier wordt een methode gepresenteerd om MΦ-fagocytose van niet-opsonized zymosan-deeltjes geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te bestuderen terwijl ze in co-cultuur met MSC zijn. Naarmate de fagocytische activiteit toeneemt en de gelabelde zymosandeeltjes worden ingesloten in de zure omgeving van het fagolysosoom, neemt de fluorescentie-intensiteit van het pH-gevoelige molecuul toe. Met de juiste excitatie- en emissiegolflengten wordt fagocytische activiteit gemeten met behulp van een fluorescerende spectrofotometer en worden kinetische gegevens gepresenteerd als veranderingen in relatieve fluorescerende eenheden gedurende een periode van 70 minuten. Om deze kwantitatieve gegevens te ondersteunen, wordt de verandering in de fagocytische activiteit gevisualiseerd met behulp van dynamische beeldvorming. Resultaten met behulp van deze methode tonen aan dat MSC in co-cultuur MΦ fagocytose van niet-opsonized zymosan van zowel naïeve als IFN-γ behandelde MΦ verbetert. Deze gegevens dragen bij aan de huidige kennis van MSC-regulatie van het aangeboren immuunsysteem. Deze methode kan worden toegepast in toekomstig onderzoek om de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen volledig af te bakenen.

Na het berekenen van het gemiddelde ± SEM voor elke groep op alle tijdstippen, worden de gegevens gepresenteerd in lijngrafiekformaat met de Y-as als de relatieve fluorescerende intensiteit en de X-as als tijd. Aanvullend bestand 1 biedt een voorbeeld van onbewerkte gegevens uit een kinetische lezing van de 96-well plaat in een spreadsheetformaat.
In deze studie tonen de optimale resultaten in figuur 3Aen tabel 3 aan dat 1) co-cul...

Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.

Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Deze co-kweekmethode zal helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen rond de celcontactmechanismen achter mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose, en daarom de rol van MSC bij het reguleren van aangeboren immuniteit belichten. Deze techniek kan worden toegepast in high-throughput analyses. De biodeeltjes geconjugeerd aan pH-gevoelige kleurstoffen fluoresceren alleen in zure fagolysoomomgevingen.Daarom zijn wassen en blussen noodzakelijk. Deze methode kan ook worden toegepast op een verscheidenheid aan co-cultuurmodellen die neutrofielen en andere fagocyten omvatten. Ethan Chetkof demonstreert de procedure, een student die momenteel in mijn lab zit.Observeer om te beginnen de samenvloeiing van gekweekte mesenchymale stamcellen. Wanneer 70-80% confluentie is bereikt, aspirateer het groeimedium uit de gekweekte cellen in een schaal van 100 millimeter en voeg vijf milliliter PBS toe. Voeg na het aspirateren van de PBS twee milliliter 0,05% trypsine EDTA-oplossing toe en incubeer de cellen gedurende drie minuten.Controleer na drie minuten de celdetachement met behulp van een omgekeerde microscoop. En als de cellen niet zijn losgemaakt, incubeer dan opnieuw gedurende één tot twee minuten. Zodra alle cellen zijn losgemaakt, voegt u vijf milliliter vers groeimedium toe aan de plaat.Gebruik na het spoelen van de plaat met behulp van het trypsinemediummengsel een steriele serologische pipet om cellen te verzamelen in een schone, steriele conische buis van 50 milliliter. Pellet vervolgens de cellen door centrifugeren. Na het opzuigen van het supernatant, resuspend de celkorrel in 10 milliliter vers groeimedium door voorzichtig op en neer te pipetteren.Voeg voor het tellen van cellen 10 microliter celsuspensie toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 30 microliter 0,4% Trypan Blue-oplossing en voeg vervolgens 10 microliter van het mengsel toe onder de dekselslip van een hemocytometertelkamer. Tel onder de omgekeerde of Brightfield-microscoop de onbevlekte levensvatbare cellen met behulp van een 10X objectieflens en vier kamers van één vierkante millimeter en bereken het celnummer zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gebruik de vergelijking C1V1 is gelijk aan C2V2 om het gewenste volume van het verse medium en de celsuspensie te bepalen die nodig zijn om de celsuspensie te bereiden bij een eindconcentratie van één keer 10 tot de vijfde cel per milliliter.Gebruik een meerkanaals micropipetter om 100 microliter van de celsuspensie toe te voegen in de putten van een 96-well plaat volgens het plaatontwerp. Gebruik een micropipette om 530 microliter van de celsuspensie toe te voegen aan elk van de kamerschuif volgens het plaatontwerp en incubateer 's nachts. Bereid 10 milliliter activeringsmedium met interferon gamma in een concentratie van 250 nanogram per milliliter voor het activeren van de macrofaagcellen in één schotel van 100 millimeter.Aspirateer het groeimedium uit de macrofaagcelculturen en spoel de cellen met vijf milliliter van het activeringsmedium zonder interferon gamma. Voeg na het aanzuigen van het spoelmedium in de experimentele schotel 10 milliliter activeringsmedium toe, aangevuld met interferon gamma. En voeg in de controleschaal 10 milliliter activeringsmedium toe zonder interferon gamma en incubeer vervolgens de cellen gedurende 16 tot 24 uur.Aan het einde van de incubatie, voor het bereiden van de co-culturen, verwijdert u het activeringsmedium uit de macrofaagcellen en voegt u vijf milliliter vers groeimedium toe. Gebruik een cellifter om de cellen voorzichtig te schrapen en de cellen in een conische buis van 50 milliliter te verzamelen. Tel vervolgens de cellen met behulp van Trypan Blue-uitsluiting en hemocytometrie, gevolgd door voorbereiding van controle en behandelde macrofaagcelsuspensies in de concentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter zoals eerder aangetoond voor de mesenchymale stamcellen.Adem het medium voorzichtig op uit de experimentele putten met mesenchymale stamcellen. Gebruik een meerkanaals micropipette om 100 microliter van de behandelde en de controle macrofaagcelsuspensies toe te voegen in de juiste experimentele putten volgens het plaatontwerp en incubeer 's nachts zoals aangetoond. Adem het medium voorzichtig op uit de vierwandige kamerplaat met mesenchymale stamcellen.Gebruik een micropipette om 530 microliter van de macrofaagcelsuspensie toe te voegen aan de juiste putten volgens het ontwerp en incubaleer 's nachts. Voeg één milliliter levend celbeeldvormingsmedium toe aan de injectieflacon met één milligram Zymosan-deeltjes en verzamel het mediumdeeltjesmengsel in een glazen kweekbuis. Na het spoelen van de injectieflacon met een extra één milliliter beeldvormingsoplossing, breng het gespoelde beeldvormingsmedium over in de glazen buis en voeg vervolgens drie milliliter extra beeldvormingsoplossing toe om 0,2 milligram per milliliter Zymosan-deeltjessuspensie te bereiken.Vortex de Zymosan-suspensie met behulp van snelle pulsen gedurende 30 tot 60 seconden en gebruik vervolgens een sonde-sonicator om de suspensie te soniceren met 60 snelle pulsen. Spoel na het aanzuigen van het medium de experimentele putten en reagensputten met 100 microliter live cell imaging-oplossing. Aspirateer vervolgens de live cell imaging-oplossing uit de putten en voeg 100 microliter van de Zymosan-suspensie toe.Open de plaatlade van de fluorescerende lezer met behulp van de touchpad-interface. Zet de plaat zonder deksel in het bakje met de A1 goed in de linkerbovenhoek. Sluit de lade met behulp van het touchpad en klik op de groene leesknop in het bovenste menu.Om de fagocytosetest uit te voeren, voegt u na het spoelen van de eerste experimentele put met 750 microliter van het beeldvormingsmedium 400 microliter van de Zymosan-suspensie toe en verlaat u de resterende putten in het groeimedium. Plaats vervolgens de dia op het geïncubeerde stadium van het beeldvormingssysteem. Gebruik de imaging software.Selecteer de brightfield-optie onder het tabblad Zoeken en klik vervolgens op het oculairpictogram. Met het 10X-objectief op zijn plaats, gebruikt u het oculair en de scherpstelknop om op de cellen te focussen. Selecteer het tabblad Acquisitie.Open het vervolgkeuzemenu experiment en selecteer een reeks golflengten met EGFP-filterset voor 509 nanometer excitatie en 533 nanometer emissiegolflengten van de pH-gevoelige kleurstof. Wanneer er nog ongeveer twee minuten op de timer staan, klikt u op het pictogram 20X in het doelmenu om het objectief te wijzigen in 20X, klikt u vervolgens op het menu Kanalen, selecteert u EGFP-filters en stelt u in het belichtingsmenu de belichtingstijd in op 400 milliseconden om de pH-gevoelige groene fluorofoor te detecteren en klikt u vervolgens op live. Nadat u de focus hebt aangepast, klikt u op stoppen om het licht uit te schakelen en vinkt u het vakje aan naast de bovenste experimentele instelling voor time-lapse.Selecteer in het menu focusstrategie voor scherpstellen software en selecteer in het vervolgkeuzemenu slimme en kerninstellingen om de tijd van blootstelling aan licht te verkorten terwijl de autofocus wordt uitgevoerd. Stel in het time-lapse-menu het gewenste aantal acquisities in op 30 tot 60, de intervaltijd op één minuut en klik vervolgens op de knop Experiment starten om de acquisitie te starten. Het effect van interferon gamma op de co-cultuur werd bestudeerd.De representatieve resultaten tonen aan dat de co-kweek van macrofagen met mesenchymale stamcellen de fagocytische activiteit van de macrofaag verbetert. Interferon gamma behandeling vermindert de activiteit van de macrofaag. In aanwezigheid van mesenchymale stamcellen werd de fagocytische activiteit van de macrofaag echter gedeeltelijk gered.De optimale celdichtheden zijn van cruciaal belang in deze studies. En wanneer de macrofaagcellen met een te lage dichtheid werden geplateerd, werden veranderingen in fluorescentie-intensiteit niet gedetecteerd. Wanneer de macrofaagcellen met een hoge dichtheid werden geplateerd, was de fluorescentie-intensiteit in alle groepen snel verhoogd en werden er geen verschillen waargenomen.Een van de belangrijkste dingen tijdens deze procedure is om ervoor te zorgen dat de celdichtheden worden geoptimaliseerd en consistent worden gehouden tussen experimenten.

mesenchymal-stem-cell-regulation-macrophage-phagocytosis-quantitation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

This video demonstrates an assay to study mesenchymal stem cell (MSC) regulation of macrophage phagocytosis in a co-culture. Upon co-culturing MSC with macrophages, non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorophore are added to be phagocytosed by the macrophages. With the increase in phagocytosis, the fluorescence intensity rises, allowing the determination of MSC-mediated regulation of phagocytic activity.

An Assay to Study the Regulation of Macrophage Phagocytosis by Mesenchymal Stem Cells

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk...

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

We presenteren de methoden voor de beoordeling van de fagocytische capaciteit van primaire lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van fluorescently geëtiketteerde myeline puin en intracellulaire lipide druppel kleuring.

In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

Hier presenteren we een protocol om de Chemotactische activiteit van bloed monocyten in muizen modellen te kwantificeren, om de effecten van nutritionele, farmacologische en genetische interventies op bloed monocyten te beoordelen en om de in het bloed geafgeleide macrofagen te karakteriseren in Muismodellen met behulp van monocyte-chemoaantretant proteïne-1 (MCP-1)-geladen in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers.

Kwantificering van monocyten Chemotactische activiteit in vivo en karakterisering van bloed monocyten afgeleide macrofagen

Macrofaag fagocytische activiteit tegen kankercellen, in het bijzonder 4T1 muis borstklier carcinoom cellen, werd afgebeeld in deze studie. Het cocultuurmodel van de levende cellen werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. Deze beoordeling is gemaakt met behulp van imaging software om multipoint time-lapse-video te ontwikkelen.

Time-lapse 2D-beeldvorming van fagocytische activiteit in M1 macrophage-4T1 muis borstkanker cellen in co-culturen

Dit protocol beschrijft de robuuste generatie van macrofagen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en methoden voor hun latere karakterisering. Celoppervlaktemarkerexpressie, genexpressie en functionele tests worden gebruikt om het fenotype en de functie van deze iPSC-afgeleide macrofagen te beoordelen.

Productie en karakterisering van menselijke macrofagen uit pluripotente stamcellen

Dit protocol biedt een methode om hele ogen te verteren tot een suspensie met één cel met het oog op cytometrische analyse van de multiparameterstroom om specifieke oculaire mononucleaire fagocytische populaties te identificeren, waaronder monocyten, microglia, macrofagen en dendritische cellen.

Vertering van hele muisogen voor multiparameterstroomcytometrische analyse van mononucleaire fagocyten

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Leer hoe mesenchymale stamcellen de fagocytose van macrofagen reguleren met behulp van pH-gevoelige fluorescente deeltjes. Deze co-cultuurtechniek biedt inzicht in aangeboren immuniteit.

Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming

Meer video's verkennen