Het meten van de pH, redoxchemie en degradatieve capaciteit van macropinosomen met behulp van dual-fluorofoor ratiometrische microscopie

Dit protocol maakt de real-time beoordeling van verschillende processen en biochemische parameters binnen het lumen van individuele macropinosomen mogelijk. Deze methoden kunnen worden gebruikt om geneesmiddelen te ontdekken in de celbiologie van macropinocytose. Dit protocol biedt het voordeel van het onthullen van heterogeniteit op zowel cellulair als organelniveau.

Een dag voor het testzaad Raw264.7 cellen met een dichtheid van vijf keer 10 tot de kracht van de cellen in 100 microliter per put, in een glazen bodem 96-well plaat met zwarte zijkanten. Controleer op de dag van de test of de putten voor minstens 70% confluent zijn. Was vervolgens alle putten met 100 microliter HBSS, voorgewarmd op 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 100 microliter HBSS toe met 0,025 milligram per milliliter TMR met het label 70 kilodalton dextran en 0,025 milligram per milliliter fluoresceïne met het label 70 kilodalton dextran in elke put en incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Nadat de incubatie is voltooid, verwijdert u de plaat uit de incubator en wast u de cellen zes keer met 100 microliter HBSS. Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliter voorverwarmd HBSS toe aan de cellen en plaats de plaat op een microscoop met een verwarmde trap en kamer.

Na het aanpassen van de excitatie- en emissieparameters voor TMR en fluoresceïne indien nodig, verkrijgt u een beeld van elke put afwisselend tussen de twee fluoroforen tussen elke put. Controleer na de eerste acquisitie of alle putten over de hele plaat scherp bleven en verkrijg vervolgens beelden van elke put met intervallen van één tot 15 minuten gedurende de gewenste tijdsduur. Pas tijdens de beeldacquisitie de pH van een aliquot van 50 milliliter van een kaliumrijke oplossing gebufferd met 25 millimolar HEPES aan op 7,5 met behulp van 10 molair zoutzuur of 10 molaire kaliumhydroxide indien nodig.

Pas vervolgens de pH van 350 milliliter aliquots van de kaliumrijke oplossing gebufferd met 25 millimol MES aan tot pH 6,5, pH 5,5 en pH 5,0. Zodra de beeldacquisitie is voltooid, verwijdert u de HBSS uit de 96-putplaat met de cellen en voegt u de kaliumrijke oplossing toe bij pH 7,5. Voeg vervolgens Nigericine toe in een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter.

Plaats de plaat terug op de microscoop en verkrijg beelden van elke put met behulp van dezelfde acquisitie-instellingen als eerder gedemonstreerd. Om oxidatieve gebeurtenissen in macropinosomen te meten, zaai RAW264.7-cellen in een 96-well plaat een dag voor de test zoals eerder aangetoond. Daarna op de dag van de test alle putten wassen met 100 microliter HBSS voorgewarmd tot 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 100 microliter HBSS toe met 0,025 milligram per milliliter TMR met het label 70 kilodalton dextran en 0,025 milligram per milliliter H2DCFDA met het label 70 kilodalton dextran aan elke put en incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Na het verwijderen van de plaat uit de couveuse wast u de cellen zes keer met 100 microliter HBSS. Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliter HBSS toe aan elke put en leg de plaat op de microscoop.

Na het aanpassen van de excitatie- en emissieparameters voor TMR en H2DCFDA indien nodig, verkrijgt u beelden van elke put met intervallen van één tot 15 minuten zoals eerder aangetoond. Om de eiwitvertering binnen macropinosomen te meten, zaait u RAW264.7-cellen een dag voor de test, zoals eerder aangetoond. Was vervolgens op de dag van de test alle putten met 100 microliter HBSS voorgewarmd op 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 100 microliter HBSS met 0,025 milligram per milliliter TMR met het label 70 kilodalton dextran in 0,2 milligram per milliliter BODIPY gelabeld ovalbumine toe aan elke put. Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Nadat u de cellen uit de incubator hebt verwijderd, wast u ze zes keer met 100 microliter HBSS.

Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliter HBSS toe aan elke put en plaats de plaat op de microscoop. Nadat u de excitatie- en emissieparameters voor TMR en BODIPY indien nodig hebt aangepast, kunt u beelden van elke put verkrijgen met intervallen van één tot 15 minuten zoals eerder gedemonstreerd. Bij het meten van de pH, oxidatieve gebeurtenissen of eiwitafbraak in macropinosomen kan de dynamiek van verzuring niet worden gemeten gedurende een bepaalde periode die overeenkomt met de dextran-belastingsfase, die varieert afhankelijk van het gebruikte celtype.

Bij het meten van de macropinosoom pH zal de fluoresceïne/TMR-verhouding geleidelijk kleiner worden en binnen de 15 minuten na acquisitie afvlakken. Dit plateau komt overeen met een pH van ongeveer vijf, wat ongeveer overeenkomt met de pH van lysosomen. Aan het einde van elke acquisitie wordt een In situ kalibratie uitgevoerd.

De verhouding tussen fluoresceïne en TMR moet het grootst zijn binnen de kalibratiebuffer bij pH 7,5 en geleidelijk kleiner worden naarmate de kalibratiebuffers zuurder worden. Dit maakt het mogelijk om een kalibratiecurve te genereren. Bij het meten van oxidatieve gebeurtenissen binnen macropinosomen zal de verhouding van H2DCFDA tot TMR geleidelijk groter worden en waarschijnlijk binnen de eerste 20 tot 30 minuten in een geactiveerd RAW264.7-cellen plateau.

Bij het meten van de vertering van macropinosomale eiwitten komt een progressief sterk fluoresceïnesignaal vrij als het ovalbumine wordt verteerd. In RAW264.7-cellen zal de toename van fluorescentie die vrijkomt van het verteerde BODIPY-gelabelde ovalbumine, binnen de eerste 30 minuten plateauren. Met deze opkomende rol in homeostase en de nieuw ontdekte relevantie voor kankerpathologie, is momenteel een renaissance macropinocytose-onderzoek aan de gang.

Deze methoden leverden een gereedschapskist op voor het verkennen van de bijdrage van macropinocytose aan deze vakgebieden.