Geïsoleerd longperfusiesysteem in het konijnenmodel
15 juli 2021
Het geïsoleerde konijnenlongpreparaat is een gouden standaardinstrument in longonderzoek. Deze publicatie heeft tot doel de techniek te beschrijven zoals ontwikkeld voor de studie van fysiologische en pathologische mechanismen die betrokken zijn bij luchtwegreactiviteit, longbehoud en preklinisch onderzoek bij longtransplantatie en longoedeem.
Deze techniek is nuttig bij de karakterisering van longfysiologie en pathologie door metabole activiteiten en ademhalingsfunctie te meten. Geïsoleerd longperfusiesysteem maakt het mogelijk om te werken met een compleet functioneel orgaan dat de studie van een continue fysiologische functie mogelijk maakt terwijl ventilatie en perfusie worden gerecreëerd. Deze methode zou inzicht kunnen geven in de karakterisering van de niet-respiratoire mogelijkheden van de longweefsels, zoals metabole activiteit en de activiteiten van verschillende componenten zoals alveolaire macrofaag en endotheelweefsel.
Om te beginnen, monteer het werkapparaat en zorg ervoor dat het de belangrijkste stalen kolom bevat die is gemonteerd op een basisplaat die de kunstmatige thorax vasthoudt met de pneumotachometer en gewichtsopnemer boven de kolom en achter de voorverwarmingsspiraal met een bellenvanger. Sluit alle transducers aan op de centrale elektronica-eenheid en bereid het ventilatiesysteem naast het apparaat voor. Na het scheren van de chirurgische plaats van het verdoofde konijn, maakt u een ventrale mediane lijnincisie van drie tot vijf centimeter van het borstbeenmanubrium tot aan de nek.
Gebruik de bedieningsschaar om de voorste 2/3 van de luchtpijp tussen de kraakbeenringen te knippen. Steek een vijf millimeter tracheale canule door het tracheale vezelige membraan en fixeer de canule voorzichtig met een 4-0 zijden hechtdraad. Plaats de tang of pincet onder de luchtpijp om ervoor te zorgen dat de canule niet tegen de luchtpijp buigt.
Sluit de ademhalingspomp aan op de tracheale canule, stel het getijdenvolume in op 10 milliliter per kilogram en start de beademing snel na de tracheotomie en voordat de thorax wordt geopend om de positieve druk in de longen te behouden om longinstorting tijdens de operatie te voorkomen. Om toegang te krijgen tot de thoracale holte, gebruikt u een scalpel of schaar om de thoraxwand te openen en voert u een mediale sternotomie uit tot aan het bovenste derde deel van de thorax. Houd de thoraxhelften open met twee retractors.
Lokaliseer de superieure en inferieure vena cava en tag ze met draden. Vóór de exsanguinatie van het dier, identificeert u de juiste ventrikel en injecteert u 1.000 internationale eenheden per kilogram heparine. Onmiddellijk na de injectie ligaat u de superieure en inferieure vena cava met de voorgeluste draad.
Snijd door het manubrium sterni om de mediale sternotomie uit te breiden naar de tracheale canule, waardoor de luchtpijp aan beide zijden vrijkomt van verbindingsweefsel. Reseceer nu de luchtpijp boven de tracheale canule en trek de canule voorzichtig omhoog in een craniale / caudale as. Na exsanguinatie voor het oogsten van het cardiopulmonale blok, gebruik directe digitale dissectie of lenteschaar om het bindweefsel te scheiden en de longen van de thorax te verwijderen.
Ontleed vervolgens de vasculatuur en de slokdarm. Til de geïsoleerde longen uit de thorax en plaats de longen voorzichtig over een steriel gaasje op een petrischaaltje. Om atelectase te voorkomen, ventileer de longen met behulp van positieve drukventilatie met positieve eind expiratoire druk ingesteld op twee centimeter waterkolom.
Snijd de ventrikels van het hart af ter hoogte van de atrioventriculaire groef. Na het openen van de twee ventrikels, introduceert u de longslagadercanule via de rechter longslagader en de linker atriumcanule via de mitralisklep in het linkeratrium. Fixeer de canule met een 4-0 zijden hechting inclusief de omliggende weefsels in de ligaturen van de longslagader en het linker atrium om structurele uitzetting te voorkomen.
Injecteer 250 milliliter zoutoplossing door de arteriële canule om het resterende bloed uit het vaatbed te spoelen. Voor de perfusie-instelling plaatst u de geïsoleerde longen zorgvuldig in de longkamer. Bevestig de luchtpijp aan de transductor op het kamerdeksel en sluit de gecannuleerde vaten aan op het perfusiesysteem, sluit en bevestig vervolgens de kamer met het roterende slot.
Bevestig vervolgens het kamerdeksel en schakel over de stopkraan om van positieve naar negatieve drukventilatie te schakelen. Perfundeer de longen met 200 milliliter kunstmatig bloedvrij perfusaat, beginnend met de stroom bij drie milliliter per minuut per kilogram, en voer vervolgens langzaam de stroom op gedurende vijf minuten tot vijf milliliter per minuut per kilogram. En laat de stroom de volgende vijf minuten acht milliliter per minuut per kilogram bereiken, gevolgd door een maximale flux van 10 milliliter per minuut per kilogram gedurende vijf minuten.
Ventileer de longen met bevochtigde lucht met een frequentie van 30 slagen per minuut, een getijdenvolume van 10 milliliter per kilogram en een einddruk van twee centimeter waterkolom. Om zone drie-omstandigheden te bereiken, wacht u 10 tot 15 minuten om een evenwicht te verkrijgen dat wordt gekenmerkt door een ISO gravimetrische toestand, zodat de veneuze druk stabiel is in het hele register. Zorg ervoor dat het gewicht van de long constant blijft en de arteriële en linker atriale druk stabiel is om zone drie-omstandigheden te bereiken om een maximaal aantal longvaten te openen en de microvasculaire bedinhoud tijdens het experiment te behouden.
Zorg er voor de elektronische besturing en signaalverwerking voor dat onder andere de ademhalingsstroom, gewichtsveranderingen, microvasculaire druk, getijdenvolume, vasculaire weerstand worden geregistreerd op een meervoudige centrale elektronica-eenheid die signalen van de transducers integreert en weergeeft op het evaluatiesysteem. De concentratie van 5-HT en monoamineoxidase die betrokken zijn bij het longmetabolisme en de vasculaire permeabiliteit werden beoordeeld. De concentratie van 5-HT en monoamineoxidase piekte na 15 minuten conservering en daalde vervolgens gedurende de volgende zes uur.
Daarna vertoonden de perfusieniveaus een niet-statistisch significante toename tot 24 uur. De afgiftesnelheden van 5-HT en monoamineoxidase gaven aan dat tijdens het eerste uur van de conservering de 5-HT-niveaus hoger stegen dan monoamineoxidase en binnen zes uur na herovering door endotheelcellen en bloedplaatjes afnamen, evenals monoamineoxidase-gemedieerd katabolisme. De neutrale endopeptidase-activiteit nam toe na negen uur en nam vervolgens af en bleef stabiel gedurende 12 tot 24 uur.
Angiotensine-converterende enzymactiviteit nam na vier uur af, nam vervolgens toe en bleef stabiel gedurende de tijd tot 24 uur. Het effect van longconservering in capillaire permeabiliteit werd gedurende 24 uur beoordeeld, wat aangeeft dat de geperfuseerde long een progressieve toename van de capillaire filtratiecoëfficiënt leed. Het effect van verschillende additieven in de capillaire permeabiliteit van het geïsoleerde longperfusiesysteem onder verschillende omstandigheden werd gecontroleerd en een maximale toename van de permeabiliteit werd waargenomen met atropine.
De belangrijkste manoeuvre is om de longen correct in een longkamer te plaatsen en de gecannuleerde bloedvaten aan te sluiten op het perfusiesysteem. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot interacties tussen circulerende stoffen en de effecten van geïnhaleerde of geperfuseerde stoffen zoals bij het testen van geneesmiddelen en verschillende longpathologieën.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De geïsoleerde longpreparatie van konijnen is een cruciaal instrument in het pulmonaal onderzoek, waarmee fysiologische en pathologische mechanismen bestudeerd kunnen worden. Deze techniek faciliteert de karakterisering van de pulmonale fysiologie en pathologie door middel van de meting van metabole activiteiten en de respiratoire functie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Longonderzoek
- Fysiologie
- Pathologie
Achtergrond
- Het systeem voor geïsoleerde longperfusie maakt de studie van een volledig functioneel orgaan mogelijk.
- Deze methode bootst ventilatie en perfusie na voor een continue analyse van de fysiologische functie.
- Het biedt inzicht in de niet-respiratoire vermogens van longweefsels.
- Belangrijke componenten omvatten de activiteiten van alveolaire macrofagen en endotheliaal weefsel.
Doel van de studie
- Om de techniek voor het isoleren van longpreparaten van konijnen te beschrijven.
- Om de reactiviteit van de luchtwegen en de conservering van de longen te onderzoeken.
- Om preklinisch onderzoek naar longtransplantatie en longoedeem te ondersteunen.
Gebruikte methoden
- Het samenstellen van de werkapparatuur met de essentiële componenten.
- Het aansluiten van de transducers op de centrale elektronische unit.
- Het voorbereiden van het ventilatiesysteem.
- Het uitvoeren van chirurgische procedures op het geanestheseerde konijn.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt een gedetailleerde meting van de ademhalingsfunctie mogelijk.
- Het vergroot het inzicht in de metabole activiteiten in longweefsels.
- Het vergemakkelijkt de studie van diverse pulmonale componenten.
- Het biedt een betrouwbaar model voor preklinisch onderzoek.
Conclusies
- De geïsoleerde preparatie van de konijnenlong is een waardevol onderzoeksinstrument.
- Het draagt aanzienlijk bij aan het begrip van de pulmonale fysiologie en pathologie.
- Deze methode is essentieel voor het bevorderen van onderzoek naar longgerelateerde ziekten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het systeem voor geïsoleerde longperfusie maakt een directe beoordeling mogelijk van pulmonale reacties op farmacologische verbindingen in een fysiologisch relevant ex vivo model. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie en mechanistische risicoreductie door metabole activiteiten, vasculaire permeabiliteit en respiratoire functie te meten in een compleet orgaansysteem. Het biedt voorspellende betrouwbaarheid voor lead-identificatie bij de ontwikkeling van respiratoire geneesmiddelen door longfysiologie die relevant is voor mensen te simuleren zonder de variabiliteit van het gehele dier.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar target-interactie in de longen mogelijk door de metabole activiteit van alveolaire macrofagen en endotheelweefsel te beoordelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van pulmonale targets via real-time meting van de respiratoire mechanica en vasculaire responsen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door kwantificering van de capillaire filtratiecoëfficiënt (Kfc) om oedeemvorming en barrièreintegriteit te evalueren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, tijdsonderzochte gegevens over pulmonale metabole enzymen, zoals de afgiftekinetiek van 5-HT en monoamine-oxidase.
- Operationele waarde: Standaardiseert perfusie- en ventilatieparameters (bijv. tidal volume 10 mL/kg, PEEP 2 cm H₂O) voor reproduceerbare tests van verbindingen.
- Klaarheid voor assay: Maakt evaluatie mogelijk van geïnhaleerde of geperfundeerde stoffen op de pulmonale fysiologie onder gecontroleerde zone-drie-condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Modelleert de perfusiedynamiek van de menselijke long om de preklinische evaluatie van pulmonale geneesmiddelkandidaten te ondersteunen.
- Afstemming van biomarkers: Volgt verschuivingen in enzymatische activiteit (bijv. angiotensine-converterend enzym, neutraal endopeptidase) als translationele biomarkers voor longpreservatie.
- Risicogebaseerde besluitvorming: Maakt longitudinale beoordeling van de longviabiliteit mogelijk (venster van 5–8 h) om go/no-go-criteria bij de ontwikkeling van pulmonale therapieën te onderbouwen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Het systeem voor geïsoleerde longperfusie past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische beoordeling, waardoor iteratieve verfijning van pulmonale drugkandidaten mogelijk wordt op basis van functionele read-outs op orgaanniveau.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van pulmonale targets via real-time monitoring van metabole en respiratoire outputs.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve perfusie- en ventilatiedata die essentieel zijn voor de reproduceerbaarheid van assays en de rangschikking van verbindingen.
- Analytics: Genereert meetbare eindpunten, waaronder de capillaire filtratiecoëfficiënt (Kfc), vasculaire weerstand, tidal volume en enzymatische afgiftesnelheden voor comparatieve analyse.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt vroege discovery met preklinische continuïteit door het modelleren van mens-relevante longpreservatie en de progressie van letsel.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratieve toetsing van meerdere verbindingen of condities binnen een gedefinieerd viabiliteitsvenster.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in de pulmonale drugrespons te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde protocollen voor canulatie, perfusie en ventilatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van pulmonale risico's mogelijk te maken, waardoor uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van pulmonale veiligheid en functionele resultaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in chirurgische technieken voor knaagdieren, vasculaire canulatie en het oogsten van cardiopulmonale blokken.
- Afhankelijk van precisie-instrumentatie, waaronder een pneumotachometer, gewichtstransducer en een centrale elektronische eenheid voor signaalintegratie.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor perfusiedebieten (3–10 mL/min/kg) en ventilatieparameters (30 bpm, 10 mL/kg tidal volume).
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende soorten of ziektemodellen vanwege soortspecifieke vasculaire en metabole reacties.
- Beperkt door de progressieve toename van de capillaire filtratiecoëfficiënt in de loop van de tijd, waardoor de experimentele duur wordt beperkt tot 5–8 uur voordat er aanzienlijk oedeem ontstaat.
