Micro-elektrode array-opname van de vuursnelheid van de sinoatriale knoop om intrinsieke cardiale pacemakingdefecten bij muizen te identificeren

Het meten van de intrinsieke hartslag is een belangrijke indicator voor de gezondheid van het hart. Deze techniek meet deze snelheid nauwkeurig, terwijl de meeste verstorende invloeden op de sinoatriale knoop worden uitgesloten. MEA-registratie van de intrinsieke hartslag legt nauwkeurige vuursnelheidsgegevens vast die vergelijkbaar zijn met eencellige opnames zonder uitgebreide elektrofysiologische training.

Personen die deze techniek gebruiken, kunnen moeite hebben om gezonde weefselpreparaten te verkrijgen in vroege experimenten, dus oefen de dissectie en optimaliseer de buffers en instellingen voor gegevensverzameling voordat u met de echte gegevensverzameling begint. De procedure wordt gedemonstreerd door artsen Man Si en Praveen Kumar, postdoctorale onderzoekers in mijn laboratorium. Begin met het vasthouden van de huid van de geëuthanaseerde muis met een hemostat en gebruik een chirurgische schaar om een transversale incisie in de huid net onder de onderkant van de ribbenkast te maken van de linker ribbenboog naar de rechter ribbenboog.

Gebruik een chirurgische schaar om het peritoneum open te knippen en de lever zorgvuldig van het middenrif te scheiden zonder de lever te snijden om overmatig bloeden te voorkomen. Insnijden van het diafragma langs de thorax om de thoracale holte bloot te leggen. Gebruik de chirurgische schaar om de zijwanden van de ribbenkast van de randen van de ribbenbogen tot aan de sleutelbeenderen te knippen om het hart bloot te leggen en gebruik vervolgens een 23 gauge spuitnaald om de ribbenkast over de schouder vast te pinnen.

Gebruik een transferpipet om warme heparinized complete Tyrode's oplossing op het hart te laten vallen om het vochtig te houden. Houd de longen vast met een extra fijne Graefe-tang en snijd de luchtpijp door met een chirurgische schaar om de longen te verwijderen. Voor het verwijderen van het hart, houd de top van het hart vast met extra fijne Graefe-tang en knip de aorta en inferieure vena cava met een chirurgische schaar.

Breng het hart over in een petrischaal met uitgehard siliconenelastomeer en gebruik een transferpipet om het hart te baden met twee tot drie milliliter warme gehepariniseerde complete Tyrode's oplossing. Bevestig de top van het hart aan de schaal met een dissectiepen. Houd de inferieure vena cava vast met Dumont 2 laminectomie tang.

Steek een 22 gauge spuitnaald door de inferieure en superieure vena cava om hun positie in het rechteratrium te lokaliseren, die ook de geschatte positie van de sinoatriale knoop identificeert. Houd het rechter atriumaanhangsel vast met Dumont 2 laminectomie tang en plaats een dissectiespeld door het rechter atriumaanhangsel om het op zijn plaats te houden. Herhaal dezelfde procedure voor het linker atriumaanhangsel en verwijder vervolgens de naald van de spuit die de vena cavae overspant.

Gebruik castroviejo schaar om de top van het hart te verwijderen door een transversale incisie over de ventrikels te maken voor het vrijgeven van het bloed uit het hart, en was vervolgens het hart door warme heparinized complete Tyrode's oplossing toe te voegen. Gebruik een Castroviejo-schaar om langs het atrioventriculaire septum te knippen totdat de boezems van de ventrikels zijn gescheiden en houd de incisie dichter bij de ventrikel. Snijd langs het interarteriële septum om het linkeratrium te verwijderen.

Plaats de dissectiepennen in de periferie van het rechter atrium om het plat te laten liggen. Verwijder eventueel achtergebleven vet, vaten of weefsel uit het atrium met behulp van de Castroviejo-schaar en lokalisknoop in het rechteratrium. Voeg de oplossing van Tyrode toe aan het inputoplossingsmodel en schakel de stroom carbogengas in om de oplossing van Tyrode van zuurstof te maken.

Stel de peristaltische pomp in op 25 RPM, wat een debiet van twee milliliter per minuut geeft. Zorg er na het starten van de pomp voor dat de buffer niet uit het systeem lekt en stel de temperatuurregelaar in op 37 graden Celsius. Gebruik Dumont 55-tang om het ontleedde weefsel van de ontleedbare petrischaal over te brengen naar het micro-elektrode-arrayraster.

Plaats het weefsel voorzichtig met een zachte kwast om het sinoatriale knooppuntgebied van het elektroderooster te bedekken. Plaats vervolgens het gaas over het weefsel met behulp van de bot tang of een gebogen tang. Gebruik de bothamer met behulp van de bothamer op het gaas om alles op zijn plaats te houden.

Schik de micro-elektrode array schotel op de connectorplaat. Plaats de perfusiedop voorzichtig op de micro-elektrode-arrayschaal zonder het harpplakanker te verstoren en beveilig de perfusiespleet met tape. Schakel de versterker in en stel een workflow in voor de opname in de software.

Selecteer beat_recording. moflo sjabloon. Open het en stel het aantal sporen, traceerduur, trace-interval, ingangsspanning, bemonsteringsfrequentie en andere opnameparameters in volgens de gewenste opnameomstandigheden.

Klik op de opname- en afspeelknop om de opname te starten en gegevens te verzamelen voor 10 sporen van een minuut met intervallen van twee minuten tussen de sporen. Pauzeer de pomp en schakel de instroomslang van de pomp over van de normale opnameoplossing naar de oplossing van Tyrode met het gewenste geneesmiddel naar keuze. Start de pomp opnieuw op en hervat de opname.

Zodra de met het geneesmiddel geïnfundeerde Tyrode-oplossing het weefsel heeft bereikt, registreert u 10 sporen op dezelfde manier als eerder is gedaan voor de baseline-opnames. Maak een laatste foto van de positionering van het weefsel op de micro-elektrode array. Open het opgeslagen geregistreerde gegevensbestand in de beatfrequentie-analysesjabloon van de analysesoftware.

Klik op het afspelen en laat de hele opname uitvoeren voor gegevensvisualisatie en wijs vervolgens de juiste analyseparameters toe. Selecteer de kanalen die in de analyse moeten worden opgenomen en stel de gewenste amplitudemaxima of amplitude minima-drempelwaarden in voor geautomatiseerde golfvormpiekidentificatie. Klik nogmaals op het afspeelpictogram om de dataset opnieuw uit te voeren en te bevestigen dat de analyseparameters geschikt zijn voor een spike-extractie.

Identificeer voor analyse de drie meest stabiele opeenvolgende sporen die een stabiele slagsnelheid vertonen voor elk spoor over de meeste kanalen tijdens de basislijnperiode van het experiment en nog eens drie opeenvolgende stabiele sporen tijdens de blootstellingsperiode van het geneesmiddel. Klik op het pictogram afspelen en opnemen om de analyse te starten. De gegevens werden verzameld van een 45 dagen oude mannelijke wild-type zwarte Zwitserse muis voor de sinoatriale knoop beat frequentiemeting.

De golfvormen met verschillende vormen en amplitudes werden waargenomen in verschillende kanalen en alle kanalen vertoonden identieke interspike-intervallen en vuurfrequenties. De mate van weefselcontact met de elektrode kan echter ook van invloed zijn op de golfvormkarakteristieken zoals amplitude. Uit de 10 geregistreerde sporen werden de drie opeenvolgende kanalen met stabiele slagfrequentie en interspike-interval gekozen voor verdere analyse.

De slechte geëxtraheerde spikepatronen zouden afwezig moeten zijn, maar indien aanwezig zijn, worden ze beïnvloed door ruis of onstabiel. De golfvormen die overeenkomen met individuele hartslagen weerspiegelen intrinsieke pacemaking-activiteit. Het micro-elektrode-arraysysteem maakt eenvoudige toepassing van geneesmiddelen mogelijk om de farmacologische effecten te analyseren.

De intrinsieke vuursnelheid van geselecteerde drie sporen over alle 64 kanalen bleek ongeveer 320 slagen per minuut te zijn in de bemonsteringsgegevens. De introductie van 4-aminopyrimidine verhoogde de interspike-intervallen zoals verwacht, waardoor de slagfrequentie daalde van 320 naar 210 slagen per minuut. Om betrouwbare gegevens voor analyse te verzamelen, is het belangrijk om te bevestigen dat weefsel gezond is tijdens de registratie door te verifiëren dat sporen stabiel zijn en voldoen aan de standaardcriteria.

MEAs kunnen worden gebruikt om cardiale activiteit in andere regio's van het hart te registreren, waardoor gedetailleerde regiospecifieke karakterisering mogelijk is die geschikt is om de effecten van genetische en farmacologische manipulatie te bestuderen.