Name: Extractie van cofactor F420 voor analyse van polyglutamaatstaartlengte uit methanogene zuivere culturen en milieumonsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Leer de geoptimaliseerde extractiemethode voor cofactor F420 uit methanogene culturen en milieumonsters. Deze techniek analyseert polyglutamaatstaartlengte via vloeistofchromatografie voor inzicht in prokaryote metabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Prof. Colin Jackson dankbaar voor de steun met gezuiverde cofactor F420. Dit onderzoek werd ondersteund door het Tiroolse wetenschapsfonds (TWF) en de Universität Innsbruck (Publikationsfonds). We erkennen de ondersteuning van GPS, HK, SB, GG en HB enorm.

OPMERKING: Extractie en analyse van cofactor F420 is een proces in drie stappen, inclusief monsterlysis, cofactorvoorzuivering via vastefasextractie (SPE) en cofactordetectie via ion-gepaarde-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) met fluorescentiedetectie. Bereid vóór de aanvang de materialen en reagentia voor zoals vermeld in tabel 1.
1. Monster lysis
<ol><li>Voeg tot 5 g monster toe aan geschikte buizen (bijv. conische buizen van 50 ml).</li>
	<li>Voeg 5 ml van de lysisbuffer (2x stockoplossing, tabel 1) toe aan de monsters.</li>
	<li>Breng tot een eindvolume van 10 ml met gedestilleerd water om een eindconcentratie van 0,5 g·ml-1 te bereiken.</li>
	<li>Vortex de verdunde monsters gedurende 20 s.</li>
	<li>Autoclaaf gedurende 30 min bij 121 °C.</li>
	<li>Breng voor droge monsters zoals bosgrond het verdunde monster na autoclaveren tot een eindvolume van 20 ml met gedestilleerd water en vortex. LET OP: Temperatuurstijging tijdens autoclaveren kan ervoor zorgen dat buizen barsten.</li>
</ol>2. Voorzuivering van de cofactor F 420 via vastefasextractie (SPE)
OPMERKING: Alle stappen van SPE worden uitgevoerd bij kamertemperatuur
<ol><li>Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Centrifugeer de geautoclaveerde monsters gedurende 5 minuten bij 11.000 x g.</li>
	<li>Bereid SPE-kolommen van 5 ml gevuld met 100 mg zwak anion gemengd polymeersorbens.</li>
	<li>Conditioneer de anionenwisselaar met 3 ml methanol (conditieoplossing, tabel 1).</li>
	<li>Breng de anionenwisselaar in evenwicht met 3 ml gedestilleerd water (equilibratieoplossing, tabel 1).</li>
	<li>Laad tot 9,0 ml van het supernatant van het gecentrifugeerde lysaat op de SPE-kolom.</li>
	<li>Spoel onzuiverheden weg met 5 ml ammoniumacetaat van 25 mM (SPE-wasoplossing 1, tabel 1).</li>
	<li>Spoel onzuiverheden weg met 5 ml methanol (SPE-wasoplossing 2, tabel 1).</li>
	<li>Eluteer de cofactor F420 in 1,0 ml elutiebuffer (tabel 1). OPMERKING: Bereid verse elutiebuffer voor. Door het toegepaste vacuüm en de hoge dampdruk van de elutiebuffer kunnen de elutievolumes van monster tot monster verschillen. Om in alle monsters hetzelfde eindvolume te bereiken, wordt aanbevolen de verzamelvaten voor en na de elutie te wegen en het effectieve elutievolume te berekenen. Compenseer de verschillen door de toevoeging van een elutiebuffer.</li>
</ol>3. Detectie van de cofactor F420
<ol><li>Stel de oven in op 40 °C en de fluorescentiedetector op 420 nm extinctiegolflengte en 470 nm emissiegolflengte. Bereik scheiding via gradiëntmodus met behulp van mobiele fasen A en B (tabel 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26% -50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50% -26% B; 27-35 min: 26% B bij een debiet van 0,75 ml min-1. OPMERKING: Garandeer de evenwichtscondities van de kolom voorafgaand aan het injecteren van monsters door de kolom ten minste te spoelen met 3 kolomvolumes van 74% mobiele fase A en 26% mobiele fase B (tabel 1).<ol>
<li>Filtreer de geëlueerde monsters van de SPE in HPLC-injectieflacons met behulp van een PTFE-filter met een poriegrootte van 0,22 μm. OPMERKING: PTFE-filters met een poriegrootte van 0,22 μm worden aanbevolen.</li>
		<li>Injecteer 50 μL van het geëlueerde monster op het HPLC-systeem om de samenstelling en concentratie van de cofactor F420 te analyseren. OPMERKING: Aangezien in dit protocol geen kwantitatieve standaard wordt gebruikt, moeten monsters en varianten worden vergeleken per piekoppervlak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
<li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li>
<li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).</li>
<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor de evaluatie van cofactor F420 uit methanogene zuivere culturen kan een microscopische evaluatie worden uitgevoerd om de groei en activiteit (fluorescentiemicroscopie) van de betrokken micro-organismen te visualiseren (figuur 1). Voor monsters afkomstig uit natuurlijke omgevingen is het gebruik van microscopie om F420 te detecteren of te kwantificeren beperkt vanwege interferenties met andere fluorescerende micro-organismen, organische en anorganische deeltjes. In ...

F420 is een wijdverspreide maar vaak verwaarloosde cofactor, die functioneert als een obligate twee-elektron hydride drager in primaire en secundaire metabolische processen van zowel Archaea als Bacteriën1,2. F420 is een 5-deazaflavin en structureel vergelijkbaar met flavinen, waarbij de chemische en biologische eigenschappen meer vergelijkbaar zijn met die van NAD+ of NADP+. Door de vervanging van stikstof door koolstof op positie 5 van de isoalloxazinering is het een sterk reductiemiddel, waardoor het een lage standaard redoxpotentiaal van -340 mV1,3 vertoont. F420 bestaat uit een 5-deazaflavin ring en een 2-fosfo-L-lactaat linker (F420-0). Een oligoglutamaatstaart met n+1 glutamaatmonomeren kan aan het molecuul worden bevestigd (F420-n+1)4.
Lange tijd is de cofactor F420 uitsluitend geassocieerd met Archaea en Actinobacteriën. Dit is grotendeels ongedaan gemaakt. Recente analyses onthulden dat F420 wordt verdeeld over diverse anaerobe en aerobe organismen van de phyla Proteobacteria, Chloroflexi en mogelijk Firmicutes die een groot aantal habitats bewonen, zoals bodems, meren en de menselijke darm1,5. In 2019 toonden Braga et al.6 aan dat de proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica een uniek F420-derivaat produceert, met een 3-fosfoglyceraat in plaats van een 2-fosfosfataalstaart, die wijdverspreid kan zijn in verschillende habitats. Binnen het domein Archaea is F420 gevonden in verschillende afstammingslijnen, waaronder methanogene7, methanotrofe8,9 en sulfaatreducerende orders10, en wordt verondersteld te worden geproduceerd in Thaumarchaeota11. F420 is vooral bekend als een essentieel redoxco-enzym in hydrogenotrofe en methylotrofe methanogenese. De gereduceerde vorm van F420 (F420H2) functioneert als elektronendonor voor de reductie van methyleentetrahydromethanopterine (methyleen-H4MPT, Mer) en methenyl-H4MPT12,13. Het kan ook worden gebruikt als elektronendrager in H2-onafhankelijke elektronentransportroutes van methanogenen die cytochromen bevatten12,14. Bovendien heeft de geoxideerde vorm van F420 een karakteristieke blauwgroene fluorescentie bij excitatie bij excitatie bij 420 nm, wat de detectie van methanogenen microscopisch vergemakkelijkt (figuur 1). Vanwege het lage redoxpotentieel vergemakkelijkt F420 (i) de exogene reductie van een breed spectrum van anderszins recalcitrante of toxische organische verbindingen, (ii) synthese van tetracycline en lincosamide antibiotica of fytotoxinen in streptomyceten (fylum Actinobacteriën), en (iii) resistentie tegen oxidatieve of nitrosatieve stress of andere ongunstige omstandigheden in mycobacteriën (fylum Actinobacteriën)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Bijgevolg zijn F420-afhankelijke oxidoreductasen veelbelovende biokatalysatoren voor industriële en farmaceutische doeleinden en voor bioremediatie van verontreinigde omgevingen1,23. Ondanks deze recente bevindingen zijn de exacte rollen van de cofactor F420 nog steeds marginaal bekend in Actinobacteriën of andere bacteriële phyla.
Er zijn ten minste drie routes voor F420-biosynthese2,6,24. In het begin wordt de biosyntheseroute opgesplitst in een 5-deazaflavin biosynthese en een 2-fosfosfataal metabolisme tak. Het reactieve deel van het F420-molecuul wordt gesynthetiseerd via FO-synthase met behulp van de substraten tyrosine en 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedion. Het resultaat is het riboflavinegehalte chromofoor FO. Binnen de momenteel geaccepteerde lactaatmetabolismetak wordt L-lactaat gefosforyleerd tot 2-fosfo-L-lactaat door een L-lactaatkinase (CofB); 2-fosfo-L-lactaat wordt op zijn beurt ge guanyleerd tot L-lactyl-2-difosfo-5'-guanosine door 2-fosfo-L-lactaat guanylyltransferase (CofC). In de volgende stap wordt L-lactyl-2-difosfo-5'-guanosine gekoppeld aan FO door een 2-fosfo-L-lactaattransferase (CofD) om F420-02 te vormen. Ten slotte ligeert het enzym F420-0:ɣ-glutamylligase (CofE) glutamaatmonomeren tot F420-0 en vormt het de uiteindelijke cofactor6 in verschillende aantallen23,25. Verschillende organismen vertonen verschillende patronen in het aantal aangehechte glutamaatresiduen, met kortere staarten gevonden voor methanogenen dan in mycobacteriën2,25,26. Over het algemeen vertonen methanogenen staartlengtes van twee tot drie, met maximaal vijf in het acetoclastische methanogeen, Methanosarcina sp., terwijl de staartlengtes in Mycobacterium sp. varieerden van vijf tot zeven glutamaatresiduen2,25,26,27. Recente bevindingen toonden echter aan dat F420 met lange keten bindt aan F420-afhankelijke oxidoreductasen met een hogere affiniteit dan F420 met een korte keten; bovendien verhoogt gebonden lange-keten F420 de substraataffiniteit, maar verlaagt de omloopsnelheid van de respectieve enzymen23.
Detectie van cofactor F420 is vaak gebaseerd op de fluorescentie. Daarbij werden de oligoglutamaatderivaten gescheiden met behulp van omgekeerde fase (RP)-HPLC27,28. Onlangs gebruikten Ney et al. tetrabutylammoniumhydroxide als een ion-parend reagens voor de negatief geladen glutamaatstaart om de scheiding op RP-HLPC met succes te verbeteren5. Hier presenteren we een methode voor de bereiding van monsters, daaropvolgende lysis, extractie, zuivering, scheiding en kwantificering van cofactor F420, niet alleen uit zuivere culturen, maar ook uit verschillende milieumonsters (d.w.z. bodems en vergisterslib).

<table><tbody><tr><td>Autoclaaf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biocompatibel HPLC-systeem uitgerust met gradiëntmodul, oven en fluorescentiedetector</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>HPLC-systeem</td></tr><tr><td>Centrifuge en rotor voor 50 mL “Falcon” buizen (11.000 rcf) en geschikte buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kolom: Gemini NX C18, 5 µm, 150 x 3 mm</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC-kolom</td></tr><tr><td>PTFE-filter (porengrootte 0,22 µm) om deeltjes te verwijderen vóór HPLC-analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hars voor SPE: Strata-X-AW 33 µm als zwak anionen gemengd-modus polymeer adsorptiemiddel</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>zwak anionen gemengd-modus polymeer adsorptiemiddel</td></tr><tr><td>Vacuüm manifold voor SPE en geschikte verzamelbuizen</td><td></td><td></td><td>SPE-apparatuur</td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

extractie van cofactor f420 voor analyse van polyglutamaatstaartlengte uit methanogene zuivere culturen en milieumonsters

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

De cofactor F420 speelt een centrale rol als hydridedrager in het primaire en secundaire metabolisme van veel bacteriële en archaeale taxa. De cofactor is vooral bekend om zijn rol in de methanogenese, waar het thermodynamisch moeilijke reacties vergemakkelijkt. Omdat de polyglutamaatstaart in lengte varieert tussen verschillende organismen, kunnen lengteprofielanalyses een krachtig hulpmiddel zijn voor het onderscheiden en karakteriseren van verschillende groepen en paden in verschillende habitats. Hier beschrijft het protocol de extractie en optimalisatie van cofactor F420-detectie door het toepassen van vastefase-extractie in combinatie met hoogwaardige vloeistofchromatografie-analyse onafhankelijk van culturele of moleculair biologische benaderingen. De methode werd toegepast om aanvullende informatie te verkrijgen over de expressie van cofactor F420 uit microbiële gemeenschappen in bodems, anaeroob slib en zuivere culturen en werd geëvalueerd door spiking-experimenten. Daarbij slaagde de studie erin om verschillende F420-staartlengteprofielen te genereren voor hydrogenotrofe en acetoclastische methanogenen in gecontroleerde methanogene zuivere culturen en uit milieumonsters zoals anaerobe vergisterslib en bodems.

Zuivere culturen van Methanosarcina thermophila en Methanoculleus thermophilus, beide thermofiele methanogene Archaea, werden gekweekt in geschikte media zoals eerder beschreven29,30. Voor Methanosarcina thermophila werd methanol gebruikt als energiebron, terwijl Methanoculleus thermophilus werd gekweekt op H2/CO2. De groei werd gecontroleerd door microscopische evaluatie, terwijl de activiteit we...

Een methode voor de extractie van cofactor F420 uit zuivere culturen werd geoptimaliseerd voor de vloeistofchromatografische scheiding en analyse van F420-staartlengte in zuivere cultuur- en omgevingsmonsters.

Extractie van cofactor F420 voor analyse van polyglutamaatstaartlengte uit methanogene zuivere culturen en milieumonsters

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

De cofactor F420 speelt een belangrijke rol in het primaire en secundaire metabolisme van veel prokaryoten. Het meten van dit molecuul in omgevingsmonsters maakt een dieper inzicht in de prevalentie en functie ervan mogelijk. Deze techniek maakt de analyse van de cofactor in moeilijke monstermaterialen zoals slib en bodem mogelijk.Daarbij staan de lysis van het materiaal en de voorzuivering voor analyse centraal. Het protocol bevat verschillende stappen tijdens de monstervoorbereiding. Deze stappen moeten zeer goed worden gepland en voorbereid voordat met de monsterverwerking wordt begonnen.Zo is het klaarmaken van verse buffers belangrijk. Om de lysis van het monster te beginnen, plaatst u vijf gram van het monster in een conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens vijf milliliter 2X lysisbuffer toe aan de monsters en breng het volume op 10 milliliter met gedestilleerd water om een uiteindelijke concentratie van 0,5 gram per milliliter te bereiken.Vortex de verdunde monsters gedurende 20 seconden gevolgd door autoclaveren gedurende 30 minuten bij 121 graden Celsius. Breng voor droge monsters zoals bosgrond na het autoclaveren tot een eindvolume van 20 milliliter met gedestilleerd water en vortex het verdunde monster opnieuw gedurende 20 seconden zoals aangetoond. Zodra de monsters zijn afgekoeld, centrifugeert u het monster gedurende vijf minuten bij 11.000 x g en verzamelt u het supernatant.Bereid een vijf milliliter vastefase-extractie of SPE-kolom gevuld met 100 milligram zwak anion gemengd polymeersorberend conditionering van de anionenwisselaar met drie milliliter methanol. Breng vervolgens de anionenwisselaar in evenwicht met drie milliliter gedestilleerd water. Laad tot negen milliliter van het supernatant van het gecentrifugeerde lysaat op de SPE-kolom.Was de onzuiverheden achtereenvolgens uit de kolom met vijf milliliter 25 millimolair ammoniakacetaat en vijf milliliter methanol. Eluteer na het wassen de cofactor F420 met één milliliter elutiebuffer. Stel de oven in op 40 graden Celsius en stel de fluorescentiedetector in op 420 nanometer extinctiegolflengte en 470 nanometer emissiegolflengte.Filter vervolgens het geëlueerde monster van de SPE in HPLC-injectieflacons met behulp van een PTFE-filter met een poriegrootte van 0,22 micron. Injecteer 50 microliter van het gefilterde monster in het HPLC-systeem en scheid cofactor F420 via gradiëntmodus met behulp van een combinatie van mobiele fasen zoals beschreven in het manuscript. Analyseer de samenstelling en concentratie van de cofactor F420.De groei van zuivere culturen van methanogenen werd geverifieerd door microscopie. In fasecontrastmicroscopie zijn agglomeraten van methanogenen zichtbaar, die een blauwachtig licht uitzenden wanneer cofactor F420 wordt geëxciteerd met ultraviolet licht. Het piekgebied van de teruggevonden cofactor F420 na SPE met verschillende volumes van de Methanoculleus thermophilus culturen werd geanalyseerd.De autoclaverende desintegratiestrategie bereikte het hoogste piekgebied en concludeerde maximale extractie-efficiëntie met behulp van een druk-temperatuurbehandeling. Analyse van de staartlengteverdeling bracht de verschillen aan het licht in de totale concentratie van cofactor F420 en de verdeling van de F420-staartlengte van de zuivere methanogene culturen in milieumonsters. Houd er bij het toepassen van deze procedure rekening mee dat u het totale volume van de elutiebuffer volledig kunt verzamelen of het exacte volume van de doorstroom moet registreren.Deze techniek maakt de weg vrij voor de exploratie van cofactor F420 in complexere monsters zoals bodems en slib en maakt dieper inzicht in de ecologische impact van dit molecuul mogelijk.

extraction-cofactor-f420-for-analysis-polyglutamate-tail-length-from

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Beschrijven we een eenvoudig protocol om de hersenen eiwitten die zich binden aan de volledige lengte C-terminus van de ATP-gated P2X2 receptoren te identificeren. De uitbreiding en systematische toepassing van deze aanpak op alle P2X receptoren zal naar verwachting leiden tot een beter begrip van P2X receptor signalering.

Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

Eiwitextractie voor proteomische analyses in schimmelsoorten vereist een hoge mate van standaardisatie te worden bereikt op basis van de minimale informatie over een proteomics experiment (MIAPE) richtlijnen. We presenteren een video-protocol, dat een procedure voor het minimaliseren van experimentele vooringenomenheid tijdens toxine inductie en eiwit-extractie uit...

Toxine Inductie en eiwitextractie uit Fusarium Spp. Cultures for Proteoom Studies

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Fosfolipide vetzuren geven informatie over de structuur van de bodem microbiële gemeenschappen. We presenteren extractiemethoden uit grondmonsters met een eenfasige chloroformmengsel, fractionering van geëxtraheerde lipiden die vaste fase extractie kolommen en methanolyse tot vetzuurmethylesters, die met behulp van capillaire gaschromatografie produceren.

Extractie en analyse van Microbiële Phospholipid vetzuren in de bodem

Het artikel beschrijft een methode die de doorvoer vergroot, terwijl de inspanningen en nauwkeurigheid voor de extractie van lipiden uit de celmembranen van micro-organismen worden gecompenseerd voor gebruik bij het karakteriseren van beide totale lipiden en de relatieve overvloed aan indicatorlipiden om de microbiële structuur van de bodem te bepalen in studies met veel monsters.

Een methode voor de extractie en analyse van lipiden voor het karakteriseren van bodemmicrobollen in experimenten met veel monsters

Een protocol wordt gepresenteerd voor gelijktijdig metabolieten, eiwitten en lipiden extraheren uit een één bodemmonster, waardoor deelmonster bereidingstijden en multi-dienst spectrometrische analyse van monsters met een beperkte hoeveelheden inschakelen.

Het MPLEx-Protocol voor Multi-dienst Analyses van bodemmonsters

Dit protocol beschrijft een interne doorvoer voor aanvullende analytische en omics technieken, culminerend in een volledig gekoppeld karakterisering van natuurlijke organische stof en microbiële proteomics in verschillende ecosystemen. Deze aanpak maakt robuuste vergelijkingen voor het identificeren van de metabolische banen en het transformaties die belangrijk zijn voor het beschrijven van de gasproductie van broeikasgassen en het voorspellen van reacties op veranderingen in het milieu.

Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Expressie en zuivering van fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten wordt beschreven met voorbeelden (expressie in E. coli, FPLC). De gezuiverde proteïnen worden gebruikt voor kristallisatie en antilichamenproductie en in dienst genomen voor enzym analyses. De geselecteerde fotometrische analyses worden voorgesteld om de multi-functionaliteit van FAHD1 als Oxaloacetaat decarboxylase en acylpyruvate hydrolase te tonen.

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Het huidige protocol beschrijft de extractie van niet-eiwitaminozuren uit biologische matrices via trichloorazijnzuur (TCA) eiwitprecipitatie en zure hydrolyse vóór analyse met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Extractie van niet-eiwit aminozuren uit cyanobacteriën voor vloeistofchromatografie- tandem massaspectrometrieanalyse

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de afgifte van O-glycanen uit mucines en de daaropvolgende ontzouting, permethylering en analyse met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie.

Profilering van gepermethyleerde mucine O-glycanen met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft een tweefasige zuur-oplosmiddelextractiemethode om korteketenvetzuren uit laag-invoer muisuitwerpselmonsters te isoleren zonder derivatisatie.

Extractie van kortketenvetzuren uit muizenuitwerpselen met behulp van een tweefasige zuur–oplosmiddelmethode

Leer de geoptimaliseerde extractiemethode voor cofactor F420 uit methanogene culturen en milieumonsters. Deze techniek analyseert polyglutamaatstaartlengte via vloeistofchromatografie voor inzicht in prokaryote metabolisme.

Extractie van cofactor _F420 voor analyse van polyglutamaatstaartlengte uit methanogene zuivere culturen en milieumonsters

Meer video's verkennen