Name: In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Leer microtubuli-dynamiek en oriëntatie in vivo visualiseren in Caenorhabditis elegans neuronen met fluorescent gelabelde EBP. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van cytoskeletgedrag tijdens neurale ontwikkeling en regeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken Yishi Jin en Andrew Chisholm voor de eerste ondersteuning en de soort die in de studie is gebruikt. De bacteriestam OP50 werd commercieel gebruikt door Caenorhabditis Genetics Center (CGC) gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). We danken ook Dharmendra Puri voor de standaardisatie van de experimentele procedures. De studie wordt gefinancierd door de kernsubsidie van het National Brain Research Centre (ondersteund door het Department of Biotechnology, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18/1 / 504331) aan S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1 / 500874) aan A.G.-R en een subsidie van Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) naar A.G.-R.

1. Reporter strain: Cultuur en onderhoud
OPMERKING: Om de microtubule-dynamiek en oriëntatie in de PLM-neuronen te meten, gebruikten we de wormstam die EBP-2::GFP tot expressie brengen onder de aanraking neuron specifieke promotor mec-4 (juIs338 allel)18,25,26. We gebruiken standaard wormkweek- en onderhoudsmethoden voor deze stam27.
<ol><li>Bereid het groeimedium van de nematoden (3,0 g/l natriumchloride, 2,5 g/l pepton, 20,0 g/l agar, 10 mg/l cholesterol (verdund uit een stamoplossing van 10 mg/ml)) in water en autoclaaf het mengsel.</li>
	<li>Koel het mengsel kort gedurende 10-15 minuten voordat u het aanvult met 1 mM calciumchloride, 1 mM magnesiumsulfaat en 25,0 mM kaliumfosfaat monobasische pH 6.0.</li>
	<li>Giet ongeveer 9 ml van het mengsel in petrischalen van 60 mm met behulp van een steriele dispenser, gevolgd door opslag bij kamertemperatuur en steriele omstandigheden gedurende een dag en daaropvolgende opslag bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 50 ml B-bouillon (5,0 g /l natriumchloride, 10,0 g / l Bacto-trypton), autoclaaf en koel het af voordat u het inent met een enkele kolonie Escherichia coli (OP50-stam).</li>
	<li>Kweek de bacteriën bij 37 °C gedurende 12 uur. Breng de gekoelde NGM-platen op kamertemperatuur voor zaaien en maak met behulp van een gesteriliseerde glazen spreader een uitstrijkje van OP50-bacteriën op de NGM-plaat.</li>
	<li>Houd de ingeënte NGM-platen gedurende 12 uur op 37 °C, waardoor een bacterieel gazon kan worden gedraaid voor het kweken van C. elegans. Deze platen kunnen tot gebruik in een incubator van 20 °C worden bewaard.</li>
	<li>Kweek de transgene spanning op de gezaaide NGM-platen.</li>
	<li>Steriliseer een platina draadplectrum op vlam en pluk 20-25 gravid volwassen hermafrodieten voor overdracht op een vers gezaaide plaat.</li>
	<li>Eenmaal overgebracht, verschuift u de plaat gedurende 1 uur naar een incubator van 20 °C. Haal vervolgens de volwassenen uit deze platen. Deze platen zullen nu eieren bevatten die op leeftijd zijn afgestemd.</li>
	<li>Verschuif de platen naar de incubator van 20 °C voor opfok totdat ze het ontwikkelingsstadium van belang bereiken, in dit geval het L4-stadium op 43,5 uur na het leggen van eieren. Voor meer wormen, achter meerdere platen om drukte te voorkomen.</li>
	<li>In het gewenste ontwikkelingsstadium kunnen deze wormen worden gemonteerd voor beeldvorming van de EBP-2::GFP-kometen.</li>
</ol>2. Monstervoorbereiding: Montage van wormen voor beeldvorming van EBP-2-kometen
OPMERKING: Om live observatie van de EBP-kometen in de PLM-neuronen mogelijk te maken, monteerden we de wormen op agarose-pads om hun mobiliteit te minimaliseren zonder de fysiologie van het neuron in gevaar te brengen. Onder de verschillende immobilisatiemethoden hebben we gekozen voor een 0,1 μm polystyreenkraaloplossing die in de handel verkrijgbaar is. We hebben de montageprocedure beschreven die specifiek wordt gebruikt voor EBP-2::GFP-observatie.
<ol><li>Bereid een oplossing van 10% agarose door 0,2 g agarose te smelten in 2 ml 1x M9 buffer (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) in een glazen reageerbuis van 5 ml boven een vlam. Deze reageerbuis past gemakkelijk in een verwarmingsblok dat de agarose in de gesmolten toestand houdt tot gebruik.</li>
	<li>Gebruik een druppelaar met brede mond en deel een druppel (ongeveer 100 μL) van deze gesmolten agarose af over een schone glasplaat van 35 mm x 25 mm afmetingen.</li>
	<li>Terwijl het zich in de gesmolten toestand bevindt, drukt u op de druppel met een andere glasplaat om een dunne film van de agarose tussen de glasplaten te maken. De agarose stolt als een film van ongeveer 0,5 - 1,0 mm dikte in ongeveer 30 seconden.</li>
	<li>Zodra de agarose stolt, houdt u de onderste dia in de niet-dominante hand en de bovenste dia in de dominante hand. Klap de bovenste dia omhoog terwijl u de onderste dia stabiel houdt, waardoor de agarose-pad aan een van de twee dia's blijft plakken.</li>
	<li>Als de gevormde agarose-pad groter is dan de coverlip-grootte (18 mm x 18 mm), knip dan de randen van de pad bij om de vereiste afmetingen te verkrijgen om de juiste plaatsing van de coverslip te garanderen. Deze agarose pads zijn voor direct gebruik en niet op te slaan.</li>
	<li>Inspecteer de agarose pad visueel voor een glad oppervlak dat vochtig is en geschikt voor montage. Als de agarose pad wordt blootgesteld aan lucht en droog wordt, lijkt het oppervlak van de agarose pad gerimpeld. Bereid in een dergelijk scenario een nieuwe agarose pad zoals vermeld in stap 2-6 van deze sectie.</li>
	<li>Leg op de agarosepad 2 μL 0,1 μm polystyreenkraaloplossing als bevestigingsmedium.</li>
	<li>Kies 3-4 wormen met behulp van een platina draadplectrum en verschuif ze naar een ongeplaatste NGM-plaat. Dit proces zorgt voor de verwijdering van oppervlaktebacteriën die de immobilisatie tijdens de montage belemmeren.</li>
	<li>Zodra de wormen uit hun oppervlaktebacteriën kruipen, pak je ze op voor montage met behulp van een platina draadplectrum en resuspend in de druppel polystyreen kralen op de agarose pad.</li>
	<li>Plaats voorzichtig een afdeklip van 18 mm x 18 mm op de wormen. Om te voorkomen dat de ingewanden van de gemonteerde wormen worden weggedoopt, moet u de afdeklip na plaatsing niet verplaatsen.</li>
	<li>Monteer de voorbereide dia op de microscoop voor beeldvorming.</li>
</ol>3. Imaging setup en acquisitie
OPMERKING: EBP-kometen reizen met een geschatte snelheid van 0,22 μm / s zoals waargenomen in de zoogdier- en PLM-neuronen van C. elegans16,18. Om de gebeurtenissen in een timelapse-acquisitie optimaal te bemonsteren volgens Nyquist-criteria28,zijn ruimtelijke en temporele schalen van respectievelijk 0,09 μm en 0,43 s vereist. Voor het voorkomen van fototoxiciteit of fotobleaching hebben we Spinning Disk acquisitie gebruikt. We hebben onze imaging setup en acquisitie instellingen hieronder beschreven.
<ol><li>Leg de beelden vast met een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een draaiende schijfeenheid en camera. Schakel de installatie in volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Schakel de software in die de installatie regelt.</li>
	<li>Omdat dit een omgekeerde microscoop is, plaatst u de dia met de gemonteerde wormen op het podium met een lage vergrotingsobjector (5x of 10x) met de coverslip naar beneden gericht.</li>
	<li>Stel het lichtpad naar het oog of de zichtbare modus in die verlichting van halogeenlamp gebruikt voor doorlatend licht en kwikbooglamp voor gereflecteerd licht.</li>
	<li>Focus en centreer een worm in het weergaveveld onder het heldere veld.</li>
	<li>Plaats de dompelolie en verander de vergroting naar 63x (1,4NA / olie) en richt de wormstaart opnieuw in het brightfield voor de PLM-neuronen.</li>
	<li>Schakel de fluorescentie van de kwikbooglamp in voor een korte herfocus van de PLM-neuronen. Plaats de juiste set reflector (AF488) in het lichtpad voor de visualisatie van GFP.</li>
	<li>Stel de microscoop in op de camera-acquisitie door het lichtpad naar de camera te richten. OPMERKING: Het besturen van de bovengenoemde stappen 4-7 via het Thin Film Transistor (TFT) scherm van de microscoop is snel en voorkomt onnodige blootstelling aan de verlichting. U kunt ook de verlichting, reflector via de software regelen.</li>
	<li>Na het scherpstellen van het PLM-neuron in het weergaveveld, selecteert u in de software-interface de verlichting van 488 nm laser met 30% vermogen en 300 ms belichting voor de camera met Electron Multiplying (EM) gain value 70. Afhankelijk van de expressie van de verslaggever, varieert u deze parameters indien nodig. Sla de instellingen op als configuratie voor volgende beeldbewerkingssessies.</li>
	<li>Op het tabblad Kanalen worden de tracks opgeslagen met elk een specifieke verlichtings- en camera-instelling. De gemarkeerde track maakt een live visualisatie mogelijk, terwijl voor het verkrijgen van een afbeelding de track moet worden aangevinkt. Markeer een kanaal met brightfield (DIC) voor live visualisatie van de staart van de worm in de werkruimte. Het voorbeeld is gericht en gecentreerd in het live imaging-venster van de werkruimte.</li>
	<li>Markeer het kanaal met 488 nm laserexcitatie voor een snelle scherpstelling van het PLM-neuron in het live imaging-venster. Eenmaal gefocust, begin je met de timelapse-acquisitie door de tijdreeksparameters in te stellen zoals vermeld in de volgende stap.</li>
	<li>Gebruik 488 nm laserverlichting om een experiment op te zetten met tijdreeksen gedurende 2 minuten en zonder tijdsinterval tussen frames. Om de temporele schalen van beeldacquisitie te behouden, hebben we alleen GFP-fluorescentie verkregen.</li>
	<li>Begin op het tabblad Experiment starten met de acquisitie. Het gebruik van een vergroting van 63x beperkt de ruimtelijke resolutie tot 0,21 μm die door de camera wordt bemonsterd met een pixelgrootte van 0,09 μm. Verkrijg een timelapse van 3,3 frames/s om het evenement optimaal te bemonsteren. De timelapse-afbeelding had 396 tijdframes verkregen over een duur van 2 minuten. Sla na de acquisitie de afbeelding op in het standaardformaat, dat later kan worden geopend door de standaardsoftware of ImageJ.</li>
</ol>4. Observatie en analyse
<ol><li>Bekijk een voorbeeld van de timelapse-acquisitie in de standaardsoftware of open deze in Afbeelding J via de Bioformats-plug-in. OPMERKING: We hebben het proces van beeldanalyse beschreven in afbeelding J.</li>
	<li>Installeer de Bioformats-plug-in in ImageJ.<ol>
<li>U kunt ook het standaardindelingsbestand exporteren naar .tif voor bestandscompatibiliteit in ImageJ. Exportfunctie in ZEN2 resulteert in individuele frames van het beeld als discrete .tif bestanden. We vermijden deze methode om de vorming van een groot aantal bestanden te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Open de afbeelding in '.czi'-formaat rechtstreeks in Afbeelding J via de plug-in 'Bioformats'. De afbeelding wordt geopend als een stapel met meerdere afbeeldingen. Als u de functie 'exporteren' van de standaardsoftware gebruikt, reconstitueert u de afbeeldingen als een stapel met meerdere afbeeldingen met behulp van de volgende workflow in ImageJ: ImageJ-programma > afbeeldingsmenu > submenu Stapels > afbeeldingen om te stapelen.</li>
	<li>Bekijk een voorvertoning van de afbeelding als een film met het pictogram Afspelen in de linkerbenedenhoek van het afbeeldingsvenster. De kometen kunnen worden gezien als heldere mobiele punctae in het cellichaam en processen van het PLM-neuron. Als de kometen duidelijk zichtbaar zijn, gaat u verder met stap 8, anders volgt u de stappen 5-7 van deze sectie.</li>
	<li>Converteer het kleurprofiel van de afbeelding met behulp van de OPZOEKTABEL (LUT) naar een grijswaardenafbeelding: het programma ImageJ > menu Afbeelding > submenu Opzoektabellen > Selecteer grijswaarden.</li>
	<li>Het LUT-profiel van de afbeelding omkeren voor eenvoudige visualisatie: ImageJ-programma > het menu Afbeelding > submenu Opzoektabellen > LUT omkeren.</li>
	<li>Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan voor het zien van de kometen: ImageJ-programma > menu Afbeelding > Het submenu aanpassen > Helderheid / contrast.<ol>
<li>Verplaats de schuifregelaars Minimum, Maximum, Helderheid en Contrast voor de gewenste schaling van de intensiteiten in de afbeelding. We kwantificeerden de beelden met kometen die duidelijk zichtbaar waren.</li>
	</ol></li>
	<li>De basisversie van ImageJ heeft opstarttools die worden weergegeven als pictogrammen. Zoek en klik met de rechtermuisknop op het pictogram met een regel om een vervolgkeuzemenu te openen en selecteer de gesegmenteerde regel. Teken de gesegmenteerde lijn op de gebieden van belang (ROI) met zijn oorsprong op of nabij het cellichaam van het neuron.<ol>
<li>Voor latere overwegingen slaat u de roi van de gesegmenteerde regel op via de ROI-manager met behulp van de volgende workflow: ImageJ > Analyseer > tools > ROI-manager > Selecteer de getekende tracering in de afbeelding en klik op Toevoegen in het venster ROI-manager > Meer in het venster ROI-manager > Opslaan.</li>
	</ol></li>
	<li>Voordat u de kymograaf genereert, verwijdert u de schaal, omdat de ruimtelijke en temporele schalen verschillend zijn, de schaal om de metingen in pixels te verkrijgen met behulp van het volgende: AfbeeldingJ > Analyseren > Stel schaal in > Klik om schaal te verwijderen > OK.</li>
	<li>Gebruik de functie Reslice onder het vervolgkeuzemenu Afbeelding > stapels en genereer een kymograaf. De kymograaf is een weergave van de gesegmenteerde ROI in de tijd. De horizontale as vertegenwoordigt de afstand en de verticale as vertegenwoordigt de tijd. De diagonale sporen stellen de bewegende kometen voor. Over het algemeen neemt de kymograaf het kleurprofiel van de afbeelding anders een kleurprofiel toe zoals beschreven in de voorgaande stappen 5-6 voor de visualisatie van de diagonale sporen.</li>
	<li>Teken met de functie Rechte lijn in het vervolgkeuzemenu van het gereedschap Lijn (zie stap 9 van deze sectie) rechte lijnen over elk van de diagonale sporen en voeg deze toe in de ROI-manager.</li>
	<li>Ga op het tabblad Analyseren naar Metingen instellen en selecteer Parameters gemiddelde intensiteit en begrenzelingenrecht voor het meten van de sporen.</li>
	<li>Klik in het venster ROI-beheer op Meten om een resultaatvenster te openen dat de gemiddelde intensiteit van de ROI, de X- en Y-coördinaten van de lijnsporen, breedte, hoogte, hoek en lengte van de lijnsporen oplevert. Dit venster kan worden opgeslagen als een .csv-indeling en later worden geïmporteerd in een gegevensanalyseprogramma.</li>
	<li>In het spreadsheetprogramma wordt het resultatenvenster geopend met de waarden verdeeld in rijen en kolommen. De relevante waarden zijn de breedte, hoogte en hoek van de sporen. De breedte geeft de verplaatsing van het spoor, hoogte geeft de duur en de hoek vertegenwoordigt de vector. Aangezien de breedte- en hoogtewaarden in pixels zijn, vermenigvuldigt u deze met respectievelijk de ruimtelijke en temporele schalen om de standaard meetbare parameters te verkrijgen.</li>
	<li>Omdat de linkerkant van de kymograaf proximaal is aan het cellichaam, classificeren kometen, afhankelijk van de hoek, in plus-end-out of minus-end-out (d.w.z. weg van het cellichaam of naar het cellichaam, respectievelijk). Classificeer hoeken tussen 1° tot -89° en -91° tot -179° als respectievelijk plus-end-out en minus-end-out. Verzamel gegevens uit meerdere kymografen in een spreadsheet voor een onderzoek en geef deze statistisch weer.</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Het begrijpen van de microtubule-dynamiek is door de jaren heen een belangrijk aandachtspunt geweest op het gebied van cytoskeletonderzoek. Microtubuli ondergaan nucleatie en catastrofe samen met een continu proces van dynamische instabiliteit44,45,46,47. Veel van deze informatie is verkregen door in vitro assays zoals lichtverstrooiingsuitlezingen van vrije versus ...

Neuronen hebben een uitgebreide architectuur met gespecialiseerde compartimenten zoals dendrieten, cellichamen, axonen en synapsen. Het neuronale cytoskelet bestaat uit de microtubuli, microfilamenten en neurofilamenten en hun afzonderlijke organisatie ondersteunt de neuronale compartimenten structureel en functioneel1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . In de loop der jaren is microtubule-organisatie geïdentificeerd als een belangrijke determinant van neuronale polariteit en functie. Terwijl neuronen structurele remodellering ondergaan tijdens ontwikkeling of regeneratie, bepalen de microtubule-dynamiek en oriëntatie de identiteit, gepolariseerd transport, groei en ontwikkeling van verschillende neuronalecompartimenten 7. Het is daarom noodzakelijk om de microtubulidynamica en oriëntatie in vivo te beoordelen om te correleren met het neuronale remodelleringsproces.
Microtubuli zijn samengesteld uit protofilamenten van α en β Tubuline heterodimeren met dynamische plus uiteinden en relatief stabiele min uiteinden11,12. De ontdekking van het plus tip-complex en bijbehorende eindbindende eiwitten hebben een platform in staat gesteld om de microtubule-organisatie te beoordelen13. Eindbindende eiwitten (EBP) associëren zich tijdelijk met de groeiende pluspunten van de microtubuli en hun associatiedynamiek is gecorreleerd met de groei van de microtubuli protofilamenten14,15. Vanwege frequente associatie en dissociatie van pluspuntcomplex met de microtubule, verschijnt de puntspreidingsfunctie van GFP-gelabelde EBP als een "komeet" in een timelapse-film15,16. Sinds de baanbrekende observatie in zoogdierneuronen16, zijn eindbindende eiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten gebruikt om de dynamiek van microtubuli te bepalen in verschillende modelsystemen en neurontypen17,18,19,20,21,22,23.
Vanwege zijn eenvoudige zenuwstelsel en transparante lichaam heeft C. elegans bewezen een uitstekend modelsysteem te zijn om neuronale remodellering tijdens ontwikkeling en regeneratie in vivo te bestuderen. Hier beschrijven we methoden om de microtubule-dynamiek en -groei te labelen, in beeld te brengen en te analyseren tijdens de ontwikkeling en regeneratie van aanraakneuronen in C. elegans. Met behulp van genetisch gecodeerde EBP-2::GFP hebben we de microtubuli in het PLM-neuron in beeld gesteld, waardoor we de polariteit van de microtubuli in twee verschillende neurieten van dit neuron konden bepalen24. Deze methode maakt observatie en kwantificering van de EBP-kometen mogelijk als een maat voor microtubule-dynamiek in verschillende cellulaire contexten, bijvoorbeeld de lokale veranderingen in microtubulegedrag die axonregeneratie na axotomie initiëren, kunnen worden beoordeeld met behulp van ons protocol. Deze test kan worden aangepast om de regulatie van microtubule-dynamica in verschillende cellulaire processen in verschillende celtypen en genetische achtergronden te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>CZ18975 worm strain</td><td>Yishi Jin lab</td><td>CZ18975</td><td>Gemaakt door Anindya Ghosh-Roy</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Monteren wormen</td></tr><tr><td>Dekglas (18 mm x 18 mm)</td><td>Zeiss</td><td>474030-9010-000</td><td>Monteren wormen</td></tr><tr><td>Droge bad met verwarmingsblok</td><td>Neolab</td><td></td><td>Monteren wormen</td></tr><tr><td>Glazen platen (35 mm x 25 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td>Monteren wormen</td></tr><tr><td>Polystyreenkralenoplossing (4,55 x 10^13 deeltjes/ml in waterig medium met minimale oppervlakteactieve stof)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876</td><td>Monteren wormen</td></tr><tr><td>Testbuisjes</td><td></td><td></td><td>Monteren wormen</td></tr><tr><td>OP50 bacteriestam</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td>Aanpakken wormen</td></tr><tr><td>60mm petrischalen</td><td>Praveen Scientific</td><td>20440</td><td>Aanpakken wormen</td></tr><tr><td>Aspirator/Capillair</td><td>VWR</td><td>53432-921</td><td>Aanpakken wormen</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR554E</td><td>Aanpakken wormen</td></tr><tr><td>Platinedraad</td><td></td><td></td><td>Aanpakken wormen</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop met fluorescentie-aansluiting</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td>Aanpakken wormen</td></tr><tr><td>0,3% natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>Nematode groeimedium</td></tr><tr><td>0,25% Pepton</td><td>T M Media</td><td>1506</td><td>Nematode groeimedium</td></tr><tr><td>10mg/mL Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Nematode groeimedium</td></tr><tr><td>1mM Calciumchloride dihydraat</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td>Nematode groeimedium</td></tr><tr><td>1mM Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>Nematode groeimedium</td></tr><tr><td>2% Agar</td><td>T M Media</td><td>1202</td><td>Nematode groeimedium</td></tr><tr><td>25mM Monobasisch Kaliumdihydrogeenfosfaat</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>Nematode groeimedium</td></tr><tr><td>0,1M Monobasisch Kaliumdihydrogeenfosfaat</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>1X M9 buffer</td></tr><tr><td>0,04M Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>1X M9 buffer</td></tr><tr><td>0,1M Ammoniumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>21405</td><td>1X M9 buffer</td></tr><tr><td>0,2M Dibaasisch Ddinatriumwaterstoffosfaat heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>1X M9 buffer</td></tr><tr><td>Glazen flessen</td><td>Borosil</td><td></td><td>Buffer opslag</td></tr><tr><td>488 nm laser</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>5X objectief</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>63X objectief</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Photometrics</td><td>Evolve 512 Delta</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Computersysteem voor Spinning Disk unit</td><td>HP</td><td>Intel &reg; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Epifluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Observer.Z1</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Halogeenlamp</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Kwikbooglamp</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Spinning Disk Unit</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>ZEN2 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Image J (Fiji-versie)</td><td></td><td></td><td>Beeldanalyse en -verwerking</td></tr><tr><td>Adobe Creative Cloud</td><td>Adobe</td><td></td><td>Beeldanalyse en -verwerking</td></tr><tr><td>Computersysteem voor beeldanalyse</td><td>Dell</td><td>Intel &reg; Core &trade; i7-9700 CPU 3.00GHz</td><td>Beeldverwerking/representatie</td></tr></tbody></table>

in vivo beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in caenorhabditis elegans neuronen

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neuronen is microtubule-oriëntatie een belangrijke beoordelaar geweest om axonen te identificeren die plus-end microtubuli en dendrieten hebben die over het algemeen een gemengde oriëntatie hebben. Hier beschrijven we methoden om de microtubule-dynamiek en -groei te labelen, in beeld te brengen en te analyseren tijdens de ontwikkeling en regeneratie van aanraakneuronen in C. elegans. Met behulp van genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggevers van microtubule-tips hebben we de axonale microtubuli in beeld. De lokale veranderingen in microtubulegedrag die axonregeneratie na axotomie initiëren, kunnen met behulp van dit protocol worden gekwantificeerd. Deze test is aanpasbaar aan andere neuronen en genetische achtergronden om de regulatie van microtubulidynamica in verschillende cellulaire processen te onderzoeken.

Als representatief voorbeeld hebben we in vivo observatie van de EBP-kometen in de steady-state en regenererende axonen van de PLM-neuronen beschreven. PLM-neuronen bevinden zich in het staartgebied van de worm met een lang voorste proces dat een synaps en een kort posterieur proces vormt. PLM-neuronen groeien in de voorste-achterste richting dicht bij de opperhuid en zijn verantwoordelijk voor het zachte aanrakingsgevoel in de wormen. Vanwege hun vereenvoudigde structuur en vatbaarheid voor beeldvorming en microchirurgi...

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Het doel van deze procedure is om de organisatie en dynamiek van de microtubuli in vivo te beoordelen. Neuronen zijn gepolariseerde cellen met verschillende axonale, dendritische en synaptische compartimenten, onderhouden door hun onderliggende cytoskelet. Microtubuli vormen de meerderheid van het neuronale cytoskelet en de dynamiek en oriëntatie bepalen belangrijke gebeurtenissen tijdens neuronale ontwikkeling en rijping.Microtubuli bestaan uit alfa- en bèta-tubuline-heterodimeren en zijn inherent gepolariseerd met zeer dynamische plus-uiteinden en stabiele min-uiteinden. Tijdens polymerisatie aan de plus-uiteinden associeert een multimoleculaire complex van eindbindende eiwitten zich tijdelijk met de protofilamenten en bevordert de assemblage van tubulinedimeren. Deze techniek zal ons helpen om neurale microtubuli in vivo te visualiseren.Met behulp van deze techniek kan men de oriëntatie en andere parameters van dynamische microtubuli bepalen tijdens de ontwikkeling en regeneratie van C.elegans neuron. We gebruiken deze reporter meestal om microtubulidynamica in sensorische neuronen te visualiseren. Men kan deze reporter echter uitdrukken in andere celtypen zoals spieren en huid

in-vivo-assessment-microtubule-dynamics-orientation-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Doser, R., et al. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates in vivo imaging of subcellular calcium flux in the ventral nerve cord neurons of transgenic Caenorhabditis elegans strains. Two distinct calcium indicators are employed: a cytoplasmic indicator in one strain and a mitochondrial indicator in another. Neurons are observed under a fluorescence microscope to monitor real-time changes in fluorescence intensity within the...

Imaging Subcellular Calcium Dynamics in Neurons of Caenorhabditis elegans

Met zijn kleine transparante lichaam, goed gedocumenteerde neuroanatomie en een groot aantal vatbaar genetische technieken en...

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model te bestuderen van axonale en intracellulair transport. Hier beschrijf ik een protocol voor in vivo opname en analyse van axonale en intraflagellair vervoer in C. elegans.

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Hier presenteren we een combinatie benadering met behulp van hoge-resolutie microscopie, computationele tools, en single-cell etikettering in levende C. de embryo's van de neurologische om de enige cel dynamiek te begrijpen.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.

Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans

In dit artikel laten we zien hoe we een zevenpuntenscoresysteem kunnen gebruiken om veranderingen in dopaminerge neuron dendrietmorfologie in C. elegansconsequent te kwantificeren . Dit systeem is bedoeld voor analyses van dopaminerge neurodegeneratie-assays met behulp van genetische, chemische en op leeftijd gebaseerde modellen van neurodegeneratieve aandoeningen.

Kwantificering van dopaminerge neuron morfologische verandering en degeneratie in Caenorhabditis elegans

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Het artikel beschrijft de optimalisatie van de acquisitieparameters van fluorescentiemicroscopie om het axonale transport van endogene gelabelde ladingen met een resolutie van één neuron in een levende nematode te visualiseren.

Optimalisatie van visualisatie van axonaal transport van endogene lading door fluorescentiemicroscopie in levende Caenorhabditis elegans

Leer microtubuli-dynamiek en oriëntatie in vivo visualiseren in Caenorhabditis elegans neuronen met fluorescent gelabelde EBP. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van cytoskeletgedrag tijdens neurale ontwikkeling en regeneratie.

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Meer video's verkennen