Shuttle Box Assay als een associatief leermiddel voor cognitieve beoordeling bij leer- en geheugenstudies met behulp van volwassen zebravissen

De Shuttle Box Assay volgt reproduceerbaar de progressie en het herstel van cognitieve stoornissen na een stomp krachttrauma of een ander type hersenletsel bij zebravissen. De Shuttle Box Assay maakt het mogelijk om relatief eenvoudig, snel en robuust associatief leren in zowel het korte- als langetermijngeheugen bij zebravissen te meten. Bereid om te beginnen de Shuttle Box voor door een gelbox van 30,5 bij 19 bij 7,5 centimeter aan te passen met een stuk plexiglas van 5 bij 19 centimeter dat aan elke kant is toegevoegd in een hoek van 45 graden.

Maak vervolgens een lijn die het halverwege punt van de tank markeert om te beoordelen wanneer vissen het midden van de tank zijn overgestoken. Nadat u 800 milliliter systeemwater aan de Shuttle Box hebt toegevoegd, plaatst u twee tot drie vissen in een vuilwatertank met systeemwater. Laat de tank achter in de donkere kamer waar de Shuttle Box Assay zal worden uitgevoerd.

Plaats vervolgens in de donkere kamer één vis in het midden van de Shuttle Box. Bevestig het deksel en bevestig de elektroden aan een voeding. De vis moet in het donker worden geacclimateerd.

Zet alle lichten uit en acclimateer de vis 15 minuten aan de Shuttle Box. Succesvolle acclimatisatie kan worden overwogen wanneer de vis vrijelijk de tank verkent. Na succesvolle acclimatisatie van de vis, schijnt handmatig een 800 lumen rode lenslantaarn op ongeveer twee centimeter van de gelboxwand aan de kant die door de vis wordt bezet.

Start geen proef als de vis naast de platinadraad rust. Schijn de lichtprikkel direct op de vis en volg handmatig elke zijwaartse beweging van de vis met het licht om een continue visualisatie van de stimulus te garanderen. Blijf de lichtprikkel geven totdat aan een van de volgende voorwaarden voor een succesvolle of mislukte studie is voldaan.

Beschouw de proef als geslaagd als de vis binnen 15 seconden na blootstelling aan licht over het halve punt van de tank steekt. Zodra de vis halverwege het punt is, stop je de lichtprikkel onmiddellijk. Als de proef is mislukt, gebruik dan een elektroforese-voeding om een negatieve schokprikkel van 20 millivolt toe te passen op één ampère, afwisselend twee seconden aan, twee seconden uit gedurende 15 seconden met een maximum van vier schokken of totdat de vis het halve punt van de doos passeert.

Beëindig vervolgens zowel de lichte als de negatieve stimulus. Zorg voorafgaand aan de trainingsperiode voor een succesvolle acclimatisatie aan de Shuttle Box door de vis 15 minuten onder donkere omstandigheden te laten. Scheen vervolgens handmatig een 800 lumen rode lenslantaarn op ongeveer twee centimeter van de gelboxwand aan de kant die door de vis wordt bezet.

Laat de lichtprikkel direct op de vis schijnen en volg elke zijwaartse beweging van de vis met het licht om een continue visualisatie van de stimulus te garanderen. Terwijl het licht op de vis schijnt, past u tegelijkertijd de negatieve schokprikkel van 20 millivolt toe op één ampère, afwisselend twee seconden aan, twee seconden uit gedurende 15 seconden met een maximum van vier schokken of totdat de vis het halve punt van de doos passeert. Zodra dit is bereikt, beëindigt u de lichte en negatieve stimulus.

Herhaal dit gedurende 25 iteraties. Laat de vis na voltooiing nog een acclimatisatieperiode van 15 minuten onder donkere omstandigheden. Voer tijdens de eerste testperiode gedurende 15 minuten een succesvolle acclimatisatie uit in de Shuttle Box, pas vervolgens tot 15 seconden alleen de lichtprikkel toe en noteer de reacties.

Beschouw de proef als geslaagd als de vis binnen 15 seconden na het starten van de lichtprikkel over het halverwege punt van de Shuttle Box gaat en de lichtprikkel onmiddellijk stopt wanneer de vis halverwege het punt passeert. Beschouw de proef als mislukt als de vis 15 seconden na het starten van de lichtprikkel niet over het halve punt van de Shuttle Box gaat en de lichtprikkel na 15 seconden stopt. Pas tijdens de eerste test geen negatieve stimulus toe na een mislukte poging.

Voer kortetermijngeheugentests uit onmiddellijk na de eerste testperiode. Induceer dramatisch hersenletsel en wacht een periode van vier uur voordat u gaat testen. Acclimeer de vis vervolgens 15 minuten in de Shuttle Box.

Beoordeel het kortetermijngeheugen door gedurende maximaal 15 seconden alleen de lichtprikkel toe te passen en registreer of de vis het halve punt van de doos oversteekt voordat het licht wordt uitgeschakeld, als geslaagde proef wordt beschouwd of niet binnen de 15 seconden die als mislukte proef worden beschouwd, het halverwege punt passeert. Herhaal de bovenstaande stap 25 keer met een rustperiode van 30 seconden tussen elke proef en noteer het aantal succesvolle en mislukte proeven. Voer langetermijngeheugentests uit vier dagen na de eerste test.

Induceer traumatisch hersenletsel en wacht een periode van vier uur voor het testen, en acclimateer de vis vervolgens gedurende 15 minuten in de Shuttle Box. Beoordeel het langetermijngeheugen door gedurende maximaal 15 seconden alleen de lichtprikkel toe te passen en registreer of de vis het halve punt van de doos oversteekt voordat het licht wordt uitgeschakeld, als geslaagde proef wordt beschouwd of niet binnen de 15 seconden die als mislukte proef worden beschouwd, het halverwege punt passeert. Herhaal het bovenstaande 25 keer met een rustperiode van 30 seconden tussen elke proef en noteer het aantal succesvolle en mislukte proeven.

Het instructief overzicht van de leer- en geheugenparadigma's voor cognitieve beoordeling wordt hier getoond. De onbeschadigde vis na acht maanden, jongvolwassen, 18 maanden, volwassene van middelbare leeftijd en 24 maanden, oudere volwassene, vereiste een vergelijkbaar aantal proeven om het gedrag van het vermijden van het rode licht te leren. Na het gebruik van het ernstige stompe kracht traumatisch hersenletselmodel, of STBI, hadden de vissen op verschillende leeftijden een vergelijkbaar aantal proeven nodig om de test gedurende één tot vijf dagen na het letsel onder de knie te krijgen.

Op de eerste dag na STBI hadden vissen van alle leeftijden een vergelijkbaar aantal proeven nodig om het gedrag te leren, dat aanzienlijk groter was dan de onbeschadigde controles. De onbeschadigde vissen beheersten de Shuttle Box snel en bereikten vijf opeenvolgende positieve proeven in ongeveer 17 proeven, terwijl een dag na een mild hersenletsel of een milde TBI, vissen een aanzienlijke toename van het aantal proeven vertonen om het gedrag te leren. Dit tekort nam toe na twee milde TBI en was verder verhoogd na drie milde TBI-blessures.

Onbeschadigde vissen vertonen een lichte toename van het procentuele verschil van succesvolle proeven in het onmiddellijke geheugen en vertraagd geheugen ten opzichte van de initiële testperiode. Na een enkele milde TBI vertoonden vissen aanzienlijke en onmiddellijke geheugentekorten in vergelijking met onbeschadigde vissen. Deze trend zette zich voort met herhaalde letsels met toenemende tekorten na zowel twee milde TBI als drie milde TBI.

De timing van toegepaste negatieve stimuli is van cruciaal belang. Het koppelen van de ongunstige stimuli aan het licht en hun gelijktijdige verwijdering verstevigt hun associatie en is cruciaal voor het paradigma. De test maakt een snelle beoordeling of complex associatief leren mogelijk dat kan worden gebruikt om ontwikkelings-, verouderings- en milieueffecten op cognitieve stoornissen te onderzoeken.