Name: Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Ontdek een snelle, betaalbare methode voor celvrije genexpressie met behulp van Escherichia coli lysaat. Dit protocol maakt hoogwaardige lysaatproductie toegankelijk voor onderzoekers met standaard laboratoriumapparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Zachary Sun en Richard Murray (California Institute of Technology) voor het leveren van het plasmide P_araBAD-gamS, en Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) voor het vriendelijk leveren van een snelle koelcentrifuge. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health en van het ARO MURI-programma en werd gedeeltelijk ondersteund door het Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.

1. Bereid media en buffers voor.
<ol><li>Bereid 2xYTPG medium voor.<ol>
<li>Meng 62 g 2xYT poeder, 5,99 g kaliumfosfaat monobasisch, 13,93 g kaliumfosfaat dibasisch en gedeïoniseerd water tot 2 L.</li>
		<li>Autoclaaf op vloeistofcyclus met een belichtingstijd van 30 min14.</li>
		<li>Voeg aan 400 ml 2xYTP-media van 1.1.2 7,2 g D-glucose (dextrose) toe en meng tot het is opgelost.</li>
		<li>Filter-steriliseer door een filter van 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid S30A-buffer voor.<ol>
<li>Meng Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM eindconcentratie), kaliumglutamaat (60 mM finale) en magnesiumglutamaat (14 mM finale).</li>
		<li>Stel de pH in op 7,7 met 10 M KOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oplossing 1 voorbereiden (zie tabel 1).<ol>
<li>Resuspend 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonzuur (HEPES) in 2 ml water.</li>
		<li>Stel de pH in op 8,0 met KOH.</li>
		<li>Voeg alle andere componenten uit tabel 1toe.</li>
		<li>Stel de pH in op 7,6 met 10 M KOH. Filter-steriliseren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid 2,5x premixoplossing (zie tabel 2).<ol>
<li>Meng alle componenten in tabel 2.</li>
		<li>Stel de pH in op 7,5 met KOH.</li>
		<li>Aliquot en invriezen bij -80 °C. OPMERKING: Een reactie van 20 μL gebruikt 8,9 μL premix.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bereid cellen voor.
<ol><li>Strijk de autolysaatcellen op LB-agarplaten met 50 μg/ml ampicilline met behulp van een entingslus en groei bij 37 °C (zie noot 1).</li>
	<li>Kies een enkele kolonie in een startercultuur van LB /ampicillinemedium met behulp van een pipetpunt en kweek 's nachts bij 37 ° C.</li>
	<li>Ent 400 ml 2xYTPG-medium met 50 μg/ml ampicilline met 400 μL startcultuur en kweek bij 37 °C in een Erlenmeyer van 1 L, schuddend bij 300 tpm.</li>
	<li>Meet periodiek de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nm (OD600) met behulp van een spectrofotometer om een optische cuvette met een padlengte van 1 cm af te lezen. Wanneer de OD600 groter is dan 1, begint u de cultuur 5-voudig te verdunnen vóór de metingen om ervoor te zorgen dat de metingen binnen het lineaire bereik van een typische laboratoriumspectrofotometer blijven. Blijf de cellen kweken totdat de 5-voudig verdunde cultuur OD600 van 0,3 bereikt (overeenkomend met een cultuur OD600 van 1,5).</li>
</ol>3. Bereid het lysaat voor.
<ol><li>Bereid S30A-buffer aangevuld met 2 mM dithiothreitol (DTT). Meng 3 ml S30A-buffer met 6 μL DTT-stamoplossing op 1 M. Plaats op ijs voor gebruik in stap 3.7.</li>
	<li>Oogst de cellen door 15 min bij kamertemperatuur te centrifugeren bij 1800 × g.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg door het af te gieten en een pipet te gebruiken om de resterende vloeistof te verwijderen.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 45 ml koude (4-10 °C) S30A buffer met behulp van een vortex mixer.</li>
	<li>Weeg een lege centrifugebuis van 50 ml, breng de cellen erin over en herhaal stap 3.2-3.3 om de cellen te wassen.</li>
	<li>Weeg de pellet en trek het gewicht van een lege buis van 50 ml af. Zorg ervoor dat u het resterende supernatant zorgvuldig opademt om een nauwkeurige meting van het pelletgewicht te garanderen. OPMERKING: Een typische opbrengst is ~ 1,3 g celkorrel uit 400 ml productiecultuur.</li>
	<li>Voeg 2 volumes koude S30A-buffer toe aangevuld met 2 mM dithiothreitol, d.w.z. 2 ml buffer voor elke 1 g celkorrel, en resuspend de cellen door krachtig vortexmenging.</li>
	<li>Vries de cellen in. Plaats de buis van 50 ml met de cellen in een vriezer van -20 °C of -80 °C totdat de pellet goed bevroren is. OPMERKING: De vriesstap is een goed stoppunt voor de dag.</li>
	<li>Ontdooi de cellen in een waterbad op kamertemperatuur.</li>
	<li>Vortex krachtig gedurende 2-3 min.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten met schudden bij 300 tpm.</li>
	<li>Ruim het monster van zwaar celafval door het gedurende 45 minuten bij 45 minuten bij 4 °C in transparante centrifugebuizen bij 30.000 × g te centrifugeren. OPMERKING: Als er geen centrifuge van 30.000 x g beschikbaar is, centrifugeer dan gedurende 45 minuten bij 21.000 × gen wees extra voorzichtig in stap 3.13, omdat de pellet minder compact zal zijn.</li>
	<li>Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe buis met een pipet, zodat de pellet zoveel mogelijk wordt verstoord. Als het overgedragen supernatant verontreinigd is met materiaal uit de pellet, herhaalt u de vorige stap.</li>
	<li>Breng het supernatant over in 1,5 ml centrifugebuizen en centrifugeer nogmaals bij 21.000 × g (of de maximale snelheid van een tafelcentrifuge) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Vul het geklaarde autolysaat in de gewenste volumes, vermijd zorgvuldig resterende pellets en vries in bij -80 °C of gebruik het onmiddellijk. OPMERKING: Een enkele reactie van 20 μL gebruikt 8 μL autolysaat.</li>
</ol>4. Celvrije genexpressie
OPMERKING: Het autolysaat is nu klaar voor elk gewenst eindgebruik. Het volgende is een voorbeeld van een standaardprotocol voor celvrije genexpressie.
<ol><li>Voor een reactie van 20 μL mengt u op ijs 8 μL autolysaat en 8,9 μL premix. Zie OPMERKING aan het einde van het protocolgedeelte met betrekking tot de optimalisatie van magnesiumglutamaat- en PEG 8000-concentraties.</li>
	<li>Voeg DNA (bijv. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 toe aan een eindconcentratie van 8 nM), eventuele andere reagentia en water aan 20 μL.</li>
	<li>Plaats de reactie in een 384-well microplaat en meet het fluorescentietijdverloop en/of eindpunten met behulp van een plaatlezer. Gebruik voor groen fluorescerend eiwit (GFP) een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 520 nm.</li>
</ol>5. Wijzigingen van het protocol
OPMERKING: De volgende wijzigingen van het protocol maken het mogelijk om andere toepassingen te bedienen.
<ol><li>Celvrije genexpressie met behulp van lineaire DNA-sjablonen<ol>
<li>Voer de stappen in rubriek 4 uit en vul de reactie aan met 2,2 μM gezuiverd GamS-eiwit (uitgedrukt en gezuiverd zoals beschreven12) vóór de toevoeging van het lineaire DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Celvrije genexpressie met eiwitafbraak<ol>
<li>Gebruik in stap 2.1 autolysaatcellen die het plasmide pACYC-FLAG-dN6-His bevatten (zie de tabel met materialen). Neem in alle groeimedia bovendien 34 μg / ml chlooramfenicol op.</li>
		<li>Neem in stap 2.3 40 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) op in het groeimedium om expressie uit het plasmide te induceren.</li>
		<li>Herhaal stap 3.2-3.4 (wassen) nog twee keer (voor een totaal van drie wasbeurten) om de volledige verwijdering van chlooramfenicol, een translatieremmer, te garanderen. Vervang voor de eerste twee wasbeurten (stap 3.4) de S30A-buffer door een fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4).</li>
		<li>Vul in stap 4.2 aan met een extra 3 mM ATP (toegevoegd uit een voorraadoplossing van 100 mM ATP in water, pH 7,2) en 4,5 mM magnesiumglutamaat (met behulp van een 1 M stockoplossing in water) (eindconcentraties) om het hoge ATP-gebruik door ClpXP te compenseren, evenals chelatie van magnesium door de extra ATP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Celvrije genexpressie met behulp van lacZ-gebaseerde uitlezingen (inclusief colorimetrisch)<ol>
<li>Gebruik in stap 2.1 autolysaatcellen die lacz niet native tot expressie brengen (zie de tabel met materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als alternatief kunt u het lysaat rechtstreeks uit gevriesdroogde cellen bereiden.<ol>
<li>Voer alle stappen van 1.1 tot 3.7 uit.</li>
		<li>Meng 8 μL celsuspensie met 8,9 μL premix.</li>
		<li>Voeg plasmide-DNA (indien gewenst), andere aangepaste reagentia en water toe om een eindvolume van 20 μL te bereiken.</li>
		<li>Breng de reactie over op een 384-well microplaat en vries deze te vriesdrogen. OPMERKING: Gevriesdroogde monsters kunnen tot een week en mogelijk langer worden bewaard.</li>
		<li>Om de reactie te beginnen, rehydrateert u het met 18 μL gedeïoniseerd water aangevuld met gewenst DNA of andere reagentia.</li>
		<li>Volg de fluorescentiedynamiek in een plaatlezer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>OPMERKING 1: Autolysaatcellen zijn ontworpen om te lyseren op een vries-dooicyclus, dus het is bijzonder belangrijk om cryoprotectant te gebruiken bij het maken van bevroren voorraden. We bevroren voorraden in 24% wt/vol glycerol en bewaarden ze bij -80 °C.
OPMERKING 2: Magnesiumionen en PEG 8000 zijn van cruciaal belang voor de prestaties van lysaat. Het basis 2,5x premix, gebaseerd op eerder gepubliceerde gegevens, bevat 6 mM magnesiumglutamaat en 4,8% wt/vol PEG 8000, die in de uiteindelijke reactie respectievelijk 2,4 mM en 1,9% worden. Het autolysaat dat hier met het protocol is bereid, presteert meestal het beste met een extra 5 mM Mg-glutamaat en 1,5% PEG 8000 in de uiteindelijke reactie. Dit kan echter worden geoptimaliseerd in het bereik van een extra 0-10 mM Mg glutamaat en een extra 0-3% PEG 8000 (vergeleken met de basis premix). Om het premix te bereiden met de aanbevolen extra 5 mM Mg-glutamaat en 1,5% PEG 8000 (eindconcentraties), mengt u 380 μL premix met 4,75 μL magnesiumglutamaat bij 1 M en 36,1 μL PEG 8000 bij 40% gewicht/volume.

<ol><li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+metabolic+engineering%3A+biomanufacturing+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+without+boundaries%3A+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li>
<li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+applications+in+proteomics+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li>
<li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+%22breadboard%22%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%222019+IEEE+32nd+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28MEMS%29%22%5BJournal%5D)">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li>
<li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li>
<li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).</li>
</ol>

J.H. is mede-oprichter van GenCirq Inc, dat zich richt op kankertherapieën. Hij zit in de Raad van Bestuur en heeft aandelen in GenCirq.

Het hier beschreven protocol levert zeer actief bacterieel lysaat op voor celvrije genexpressie. De sleutel is om cellen te gebruiken die het plasmide pAD-LyseR dragen, dat de lambdafaag endolysine cytosolisch tot expressie brengt. Deze cellen worden gepotentieerd om zichzelf te lyseren bij permeabilisatie van het binnenmembraan, waardoor de endolysine toegang krijgt tot de celwand, wat de methode bereikt door een eenvoudige vries-dooicyclus. Omdat de cellen zichzelf effectief lyseren, wordt het product autolysaat genoem...

Genexpressie in celvrije lysaten heeft verschillende voordelen ten opzichte van het gebruik van levende cellen1,2,3,4. Lysaten kunnen gemakkelijk biochemisch worden gemodificeerd en worden gebruikt in omstandigheden die schadelijk of onmogelijk te bereiken zijn in levende cellen. Genexpressiecircuits hoeven niet te concurreren met biologische processen van de gastheer en het testen van nieuwe genetische circuits is net zo eenvoudig als het toevoegen van DNA. Om deze redenen heeft celvrije genexpressie verschillende toepassingen gevonden, van biosensoren5,6 tot het snel prototypen van synthetische gencircuits7,8 tot het ontwikkelen van kunstmatige cellen9. De meeste celvrije genexpressie maakt gebruik van cellulaire lysaten die sterk zijn verwerkt, wat over het algemeen lange en complexe protocollen, gespecialiseerde apparatuur en / of gevoelige stappen vereist die kunnen leiden tot aanzienlijke variatie tussen gebruikers en batches10,11.
Dit artikel beschrijft een eenvoudige, efficiënte methode voor het produceren van celvrij lysaat dat minimale verwerking en expertise vereist(Figuur 1A)12. De methode is gebaseerd op E. coli-cellen die zijn ontworpen om te lyseren na een eenvoudige vries-dooicyclus. De cellen drukken een endolysine uit faag lambda die de celwand afbreekt. Terwijl de cellen groeien, blijft dit endolysine achter in het cytoplasma, gesekwestreerd uit de celwand. Een eenvoudige vries-dooicyclus verstoort echter het cytoplasmatische membraan, waardoor de endolysine vrijkomt in het periplasma, waar het de celwand afbreekt, wat resulteert in snelle cellysis. Het protocol kan worden voltooid met slechts een paar uur hands-on werk en vereist alleen een vriezer, een centrifuge van 30.000 × g (voor optimale resultaten; lagere snelheden kunnen met meer zorg worden gebruikt om de pellet niet te verstoren), een vortexmixer en een eenvoudige bufferoplossing. Functioneel lysaat kan zelfs worden geproduceerd door de cellen te vriesdrogen en ter plaatse opnieuw te hydrateren. Deze methode produceert echter lysaten met een lagere activiteit, vermoedelijk als gevolg van het resterende celafval.
De lysaten zijn zeer actief voor celvrije genexpressie en ze kunnen op verschillende manieren worden verbeterd, afhankelijk van het eindgebruik. De snelheid van eiwitsynthese kan verder worden verhoogd door het lysaat te concentreren met behulp van standaard spinconcentrators. Lineair DNA kan worden beschermd tegen afbraak door het toevoegen van gezuiverd GamS-eiwit. Eiwitdegradatie, noodzakelijk voor complexere circuitdynamica zoals oscillatie, kan worden bereikt door een ClpX-hexameer in de autolysaatproducerende stamco-expressie te geven 13. Ten slotte worden op LacZ gebaseerde visuele uitlezingen mogelijk gemaakt door gebruik te maken van een autolysaatbelasting zonder lacZ. Over het algemeen produceert deze methode zeer actief celvrij lysaat dat geschikt is voor een breed scala aan toepassingen.

<table><tbody><tr><td>2xYT media</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8877</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 centrifugale filterunit, 3 kDa cut-off</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>optioneel, kan worden gebruikt om lysate te concentreren, selecteer concentratorcapaciteit die geschikt is voor het te concentreren volume</td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>of carbencillin, een stabielere variant</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>CTP</td><td>United States Biosciences</td><td>14121</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>D-glucose (dextrose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) met pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99244</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) &Delta;lacZ met pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr><tr><td>Folinezuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>GTP</td><td>United States Biosciences</td><td>16800</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446075</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>magnesiumglutamaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>kaliumglutamaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1501-100G</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>voor het aanpassen van de pH</td></tr><tr><td>kaliumfosfaat dibasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85558</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>tRNA-mix</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>UTP</td><td>United States Biosciences</td><td>23160</td><td>of gelijkwaardig</td></tr></tbody></table>

snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Celvrije genexpressie biedt de kracht van biologie zonder de complicaties van een levend organisme. Hoewel er veel van dergelijke genexpressiesystemen bestaan, zijn de meeste vrij duur om te kopen en / of vereisen ze speciale apparatuur en fijnmazige expertise om effectief te produceren. Dit protocol beschrijft een methode om bacterieel celvrij lysaat te produceren dat hoge niveaus van genexpressie ondersteunt, waarbij alleen standaard laboratoriumapparatuur wordt gebruikt en minimale verwerking vereist is. De methode maakt gebruik van een Escherichia coli-stam die een endolysine produceert die de groei niet beïnvloedt, maar die een geoogste celkorrel efficiëntlyseert na een eenvoudige vries-dooicyclus. De enige verdere verwerking die nodig is, is een korte incubatie gevolgd door centrifugering om het autolysaat van cellulair puin te verwijderen. Dynamische gencircuits kunnen worden bereikt door heterologe expressie van het ClpX-protease in de cellen vóór het oogsten. Een E. coli-stam zonder het lacZ-gen kan worden gebruikt voor hooggevoelige, celvrije biosensingtoepassingen met behulp van een colorimetrische of fluorescerende uitlezing. Het hele protocol vereist slechts 8-9 uur, met slechts 1-2 uur hands-on arbeid van inenting tot voltooiing. Door de kosten en tijd te verminderen om celvrij lysaat te verkrijgen, moet deze methode de betaalbaarheid van celvrije genexpressie voor verschillende toepassingen vergroten.

Representatieve resultaten kunnen worden waargenomen door autolysaat te gebruiken om GFP uit te drukken uit een constitutief tot expressie brengend plasmide, hier pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, en een tijdsverloop van GFP-fluorescentie in een plaatlezer te registreren (Figuur 1B). Een verdunningsreeks van plasmide-DNA vond sterke expressie, zelfs bij 1 nM DNA. In vergelijking met een in de handel verkrijgbaar lysaat kan het autolysaat een grotere totale opbrengst produceren en een grotere...

Dit protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om bacterieel lysaat te produceren voor celvrije genexpressie, met behulp van een gemanipuleerde stam van Escherichia coli en waarvoor alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig is.

Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Met behulp van dit protocol kunnen hoogwaardige bacteriële cellysaten worden geproduceerd met behulp van alleen algemeen beschikbare gangbare laboratoriumapparatuur, waardoor celvrije genexpressie gemakkelijk toegankelijk is voor de meeste onderzoekers. Het combineren van cellulaire autolyse met een vries-dooi of vriesdroogcyclus maakt het mogelijk om een praktische, arbeids- en kosteneffectieve aanpak te creëren voor snelle productie van bacteriële lysaten voor celvrije genexpressie. Begin met het gebruik van een inentingslus om de cellen van een autolyse E.coli-stam op LB-agarplaten met 50 microgram per milliliter ampicilline te strepen en incubaleer de platen vervolgens 's nachts bij 37 graden Celsius.Pluk de volgende dag met behulp van een pipetpunt een enkele kolonie uit de agarplaat en voeg deze toe aan een kweekbuis met LB-medium met ampicilline. Kweek deze startercultuur 's nachts bij 37 graden Celsius. Voeg de volgende dag 400 microliter van de startercultuur toe aan een Erlenmeyer van één liter met 400 milliliter 2xYTPG-medium aangevuld met 50 microgram per milliliter ampicilline.Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius met schudden bij 300 RPM. Meet met behulp van een spectrofotometer en een optische cuvette met een padlengte van één centimeter periodiek de optische dichtheid van de cultuur op 600 nanometer. Wanneer de optische dichtheid groter is dan één, begin dan met het verwateren van de cultuur vijfvoudig voordat de metingen worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de metingen binnen het lineaire bereik van een typische laboratoriumspectrofotometer blijven.Zodra de optische dichtheid van de vijfvoudig verdunde cultuur 0,3 bereikt, haalt u de kolf uit de incubator en gaat u verder met het bereiden van het lysaat. Om het lysaat te bereiden, oogst u de cellen door centrifugeren op 1, 800 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant eraf en verwijder de resterende vloeistof met een pipet.Voeg 45 milliliter koude S30A-buffer toe aan de pellet en resuspend de pellet door vortexing. Weeg vervolgens een lege centrifugebuis van 50 milliliter af voordat u de cellen in de buis overbrengt. Centrifugeer de cellen opnieuw en gooi het supernatant weg.Aspiraleer het resterende supernatant met een pipet. Weeg de buis opnieuw en trek het gewicht van de lege buis af van het weergegeven gewicht om het gewicht van de pellet te verkrijgen. Voeg voor elke milligram celkorrel twee microliter koude S30A-buffer toe, aangevuld met twee millimolaire dithiothreitol.Resuspend de cellen vervolgens door krachtige vortexing. Vries vervolgens de cellen in door ze in een negatieve vriezer van 20 of negatieve 80 graden Celsius te plaatsen totdat de pellet grondig is bevroren, ontdooi vervolgens de cellen in een waterbad op kamertemperatuur en vortex krachtig gedurende twee tot drie minuten. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 45 minuten met schudden bij 300 RPM en verwijder vervolgens het monster van zwaar cellulair vuil door te centrifugeren in transparante centrifugebuizen bij 30.000 x g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius.Breng het supernatant voorzichtig over naar een nieuwe buis met een pipet en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Als het overgedragen supernatant verontreinigd is met materiaal uit de pellet, herhaalt u de centrifugering. Breng het supernatant over in 1,5 milliliter centrifugebuizen.En centrifugeer nogmaals op 21.000 x g of de maximale snelheid van een tafelcentrifuge gedurende vijf minuten. Aliquot de geklaarde autolysaat in de gewenste volumes en bewaar bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Voor celvrije genexpressie met behulp van het autolysaat, meng acht microliter autolysaat en 8,9 microliter pre-mix op ijs.Voeg DNA toe aan een eindconcentratie van acht nanomol, eventuele andere noodzakelijke reagentia en water om een eindvolume van 20 microliter te verkrijgen. Voeg de reactie toe aan een 384-well microplaat en gebruik een plaatlezer om het fluorescentietijdverloop en de eindpunten te meten. GFP-expressie met behulp van het autolysaat met een verdunningsreeks van plasma-DNA resulteert in sterke expressie, zelfs met één nanomolair DNA.Bij het vergelijken van de GFP-expressie tussen een in de handel verkrijgbaar lysaat en het autolysaat, produceerde het autolysaat vergelijkbare niveaus van GFP. Variabiliteit tussen partijen lysaat geproduceerd in twee verschillende laboratoria door verschillende onderzoekers was ongeveer tweeledig. De drie meest kritische variabelen zijn de verhouding tussen celpellet en buffer, het overbrengen van puinvrij supernatant en het gebruik van een optimale PEG- en magnesiumconcentratie in de uiteindelijke reactie.Zodra het extract is voorbereid, kan een groot arsenaal aan bestaande protocollen worden gebruikt die zijn ontwikkeld voor E.coli-celvrije expressiesystemen, zoals ClpXP-gemedieerde degradatie of AHL-gemedieerde quorumdetectie.

rapid-affordable-uncomplicated-production-bacterial-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

Source: Wiegand, D. J., et al. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a bacterial cell-free protein expression system based on Vibrio natriegens crude lysate to perform coupled in vitro transcription and translation. It highlights the preparation of a master mix with essential components and the step-by-step synthesis of functional proteins from a DNA template.

Cell-Free Protein Expression Using a Bacterial Crude Cell Extract

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Cel-vrije expressiesystemen zijn krachtige en kosten-efficiënte hulpmiddelen voor de synthese van hoog-productie en de screening van belangrijke eiwitten. Hier beschrijven we de voorbereiding van cel-vrije eiwit expressie systeem met behulp van Vibrio natriegens voor de productie van de snelle eiwitten met behulp van de plasmide DNA, lineaire DNA en mRNA sjabloon.

Cel-vrije eiwit expressie met behulp van de snel groeiende bacterie Vibrio natriegens

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

We presenteren een snelle en kosteneffectieve methode om het recombinante PURE celvrije TX-TL-systeem te produceren met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.

OnePot PURE Celvrij Systeem

De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

Dit werk beschrijft de bereiding van celextract van Escherichia coli (E. coli) gevolgd door celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in minder dan 24 uur. Uitleg van het celvrije auto-inductie (CFAI) protocol beschrijft verbeteringen die zijn aangebracht om het toezicht van onderzoekers te verminderen en de verkregen hoeveelheden celextract te verhogen.

Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow

Leishmania Translational Extract (LTE) is een eukaryotisch celvrij eiwitexpressiesysteem dat is afgeleid van de eencellige parasiet Leishmania tarentolae. Dit geoptimaliseerde protocol maakt LTE eenvoudig en kosteneffectief te produceren. Het is geschikt voor verschillende toepassingen die gericht zijn op de multiparallelle expressie en studie van complexe eukaryote eiwitten en hun interacties.

Productie en optimalisatie van LTE, een van Leishmania tarentolae-afgeleid celvrij eiwitexpressiesysteem voor recombinante eiwitproductie

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

We presenteren een geactualiseerd protocol voor de productie van het OnePot 'Protein synthesis Using Recombinant Elements' (PURE)-systeem en ruwe ribosomen voor celvrije eiwitsynthese, met de nadruk op het beheersen van celgroei om batch-tot-batchvariaties te minimaliseren.

Verfijning van de productie van OnePot PURE en ruwe ribosomen voor reproduceerbare celvrije eiwitsynthese

Ontdek een snelle, betaalbare methode voor celvrije genexpressie met behulp van Escherichia coli lysaat. Dit protocol maakt hoogwaardige lysaatproductie toegankelijk voor onderzoekers met standaard laboratoriumapparatuur.

Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat

Meer video's verkennen