Name: Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer de synthese van colloïdaal goud en assemblage van immunochromatografische strips voor snelle detectie van kleine moleculen. Deze methode biedt een betrouwbaar protocol voor diagnostisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Speciale Fondsen voor Fundamenteel Onderzoek fondsen van instellingen voor hoger onderwijs verbonden aan centrale afdelingen. We waarderen de steun van classical prescription basic research team van de Beijing University of Chinese Medicine.

Alle procedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de Ethics Review Committee van de Beijing University of Chinese Medicine (goedkeuringsnummer 2017BZYYL00120).
1. Bereiding en karakterisering van colloïdaal goud
OPMERKING: Voor colloïdaal goudsynthese, aangezien colloïdaal goud gemakkelijk wordt geadsorbeerd aan de binnenwand van het vat en gevoelig is voor neerslag door onzuiverheden, moet het vat voor synthese en opslag van colloïdaal goud grondig worden gereinigd en gedrenkt in zuur (40 ml gedestilleerd water, 360 ml geconcentreerd zwavelzuur, 20 g kaliumdichromaat) of worden onderworpen aan oppervlaktepassiveringsbehandeling. Een citroenzuurreductiemethode werd gebruikt om colloïdaal goud te synthetiseren.
<ol><li>Zet de magneetroerder aan en plaats de kolf (250 ml) op de mixer.</li>
	<li>Bereid respectievelijk 4% goudchloridezuuroplossing en 1% natriumcitraatoplossing.</li>
	<li>Voeg 120 ml gedestilleerd water toe aan een kolf met ronde bodem en verwarm het op een thermostatische magneetroerder tot de kook.</li>
	<li>Blijf koken en voeg snel 0,5 ml 4% chlooraurinezuur en 5 ml 1% natriumcitraat toe.</li>
	<li>Observeer de kleur van de oplossing. De lichtgele chlooraurinezuuroplossing kleurt wijn binnen enkele minuten rood.</li>
	<li>Blijf 10 minuten verwarmen, totdat de oplossing verandert van kleurloos naar transparant wijnrood.</li>
	<li>Schakel de stroom van de thermostatische magneetmenger uit, koel af tot kamertemperatuur en verplaats het mengsel naar een schone fles. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bepaal de grootte en morfologie van de AuNP's door ultraviolette spectroscopie en TEM-beeldvorming. OPMERKING: Verschillende maten colloïde gouddeeltjes voor verschillende toepassingen kunnen worden verkregen door het aandeel citraatnatrium en chlooraurinezuur te veranderen.</li>
</ol>2. Synthese van AuNPs-mAb-conjugaat
OPMERKING: Aangezien antilichamen binden aan colloïdaal goud door elektrostatische adsorptie, hebben ladingen op het oppervlak van eiwitten en colloïdaal goud direct invloed op de bindingsintensiteit; daarom is de pH-waarde van de buffer een belangrijke factor die de stabiliteit van het antilichaam-colloïdaal goudconjugaat beïnvloedt. SSD en anti-SSD mAbs worden als voorbeelden gebruikt in dit protocol.
<ol><li>Evaluatie van de pH van de koppeling<ol>
<li>Voeg 100 μL NaCl-oplossing (10% m/v) toe in acht buisjes.</li>
		<li>Stel de AuNP-oplossingen in bij pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 en 12 met 0,1 M K2CO3.</li>
		<li>Voeg 100 μL colloïdaal goudoplossing (pH aangepast 5-12) toe aan acht buisjes die NaCl bevatten.</li>
		<li>Laat de oplossingen na het mengen enkele minuten staan. Observeer de kleurverandering van elke buisoplossing en noteer de buis die rood blijft.</li>
		<li>Kies de pH-waarde met de minste toevoeging van K2CO3 en stabiele oplossingskleur als de optimale pH-waarde voor het bereiden van AuNP-mAb-conjugaten. OPMERKING: Gebruik geen pH-meter omdat de sonde kan worden vernietigd door AuNPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluatie van de hoeveelheid antilichamen<ol>
<li>Voeg 100 μL NaCl-oplossing (10% m/v) toe aan acht buisjes.</li>
		<li>Voeg 100 μL colloïdaal goudoplossing met optimale pH toe aan elke buis.</li>
		<li>Voeg de monoklonale antilichaamoplossingen (eiwitconcentratie 0,1 mg/ml-3,2 mg/ml) toe aan de bovengenoemde acht buisjes.</li>
		<li>Laat de oplossingen na het mengen enkele minuten staan. Observeer de kleurverandering van elke buisoplossing en noteer de buis die rood blijft.</li>
		<li>Kies de hoeveelheid antilichamen met de laagste concentratie mAb en stabiele oplossingskleur als de optimale hoeveelheid mAb voor het bereiden van AuNP-mAb-conjugaten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de resuspensiebuffer voor: voeg 1 M Tris-HCl (pH 8,8), 1% (w/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween 20 en 1% (v/v) PEG 20000 toe en meng goed.</li>
	<li>Synthese van AuNP-mAb-conjugaat<ol>
<li>Neem 10 ml colloïdaal goudoplossing en gebruik 0,1 M K2CO3 om de oplossing aan te passen aan de optimale pH-waarde.</li>
		<li>Voeg langzaam SSD mAbs toe in de juiste concentraties en schud gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Centrifugeer het mengsel bij 83 x g (1.000 tpm) gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het neerslag, dat onzuiverheden of neergeslagen colloïdaal goud bevat.</li>
		<li>Centrifugeer het mengsel bij 8.330 x g (10.000 tpm) gedurende 30 minuten bij 4 °C. Gooi het bovennatuurlijke en het neerslag is het colloïdaal goud-mAb-conjugaat.</li>
		<li>Voeg de resuspensiebuffer toe om de neerslag te dissociëren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montage van de Strip
OPMERKING: Voor latere flow-immunoassays zal de selectie en voorbehandeling van membraanmateriaal rechtstreeks van invloed zijn op de test, die moet worden onderzocht. De immunochromatografische strip bestaat uit een sample pad, een conjugaat pad, een nitrocellulose (NC) membraan, een absorberende pad en een PVC board(Figuur 1). Het membraanmateriaal moet worden gecontroleerd en geëvalueerd door stereomicroscopie om inhomogeniteit te elimineren.
<ol><li>Plak het NC-membraan op een PVC-plaat op 2 cm van de rand van het zuigeinde van het bord.</li>
	<li>Voeg SSD-BSA (2 mg/ml) druppelsgewijs toe aan het NC-membraan (2 cm van de bovenrand) als testlijn (1 mm breed) en voeg geit-antimuis IgG (1,5 mg/ml) druppelsgewijs toe op het NC-membraan (2 cm van de onderrand) als controlelijn (1 mm breed). Controleer de hoeveelheid toegevoegd eiwit.</li>
	<li>Bevestig de absorberende pad aan de PVC-plaat boven het NC-membraan en overlap deze met het NC-membraan met 2 mm.</li>
	<li>Dompel het glasvezelmembraan onder in de AuNPs-mAb-geconjugeerde oplossing. Droog het natte membraan in een incubator bij 37 °C.</li>
	<li>Knip het glasvezelmembraan af tot 5 cm lang en 2 cm breed en gebruik het als een geconjugeerde pad.</li>
	<li>Plak de voorbehandelde geconjugeerde pad onder het NC-membraan. De lengte van overlap met het NC-membraan moet 0,1 cm zijn. OPMERKING: Het glasvezelmembraan heeft een sterk vermogen om eiwitten te binden en vrij te geven.</li>
	<li>Trim het fusion 3 membraan tot 1,8 cm lang en 3,5 cm breed en gebruik het als monsterpad.</li>
	<li>Plak het monsterkussen op het PVC-bord en overlap het met het geconjugeerde pad met 2 mm.</li>
	<li>Snijd de geassembleerde karton met behulp van een snijmachine in stroken van 3,5 mm breed en compact met behulp van een batch-lamineersysteem.</li>
	<li>Plaats ten slotte de teststrips in de schaal, verzegel ze in een aluminiumfoliezak met droogmiddel en bewaar ze uit de buurt van licht. De ICS'en zijn nu geassembleerd. OPMERKING: Het bovenstaande is de laboratoriumprocedure. In de productie worden goudspuitapparatuur en cross-membraaninstrumenten gebruikt om goud te spuiten en de T- en C-lijnen te maken.</li>
</ol>4. Kwantitatieve detectie
<ol><li>Laat 50 μL monsteroplossing op het monstergat vallen om het chromatografieproces te observeren. OPMERKING: Als gevolg van de capillaire werking die door het absorberende pad wordt aangedreven, migreert de monsteroplossing naar het andere uiteinde van de strip. Wanneer de monsteroplossing het geconjugeerde pad bereikt, reageert de SSD (antigeen) in het monster met de AuNPs-mAb die vooraf op de pad is geladen. Wanneer de oplossing migreert en de T-lijn bereikt, kan de AuNPs-mAb zonder SSD selectief worden vastgelegd door SSD-BSA (antigeen-carrier eiwitconjugaat), weergegeven als een rode kleur op de T-lijn. Vervolgens migreert de oplossing naar de C-lijn, waar de AuNPs-mAb worden gevangen door geiten-anti-muis IgG in de regio, waardoor ze als een rode kleur op de C-lijn worden weergegeven.</li>
	<li>Analyseer de strips met een draagbare striplezer. De machine kan de verhouding van de testlijn tot de besturingslijn (T/C) leveren.</li>
	<li>Evalueer de specificiteit, gevoeligheid, herhaalbaarheid en stabiliteit van de ICS-test. OPMERKING: Bij kwalitatieve detectie geeft één rode lijn een positief resultaat aan (controlelijn). Twee rode lijnen geven een negatief resultaat aan (test- en controlelijnen). Als de controlelijn niet aanwezig is, wordt de test als ongeldig beschouwd.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-based+lateral+flow+immunochromatographic+strip+with+nanoparticles+as+reporters+for+detection%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).</li>
<li>Chang, H. -F., Wang, J. -Q., Wang, B., Deng, A. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immune+chromatographic+assay+for+rapid+and+simultaneous+detection+of+levonorgestrel+and+methylprednisolone+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples.</a> Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).</li>
<li>Lai, J. J., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lateral-flow+immunoassay+%28LFIA%29+diagnostics+via+biomarker+enrichment+for+mHealth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth.</a> Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).</li>
<li>Zhang, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colloidal+gold-based+lateral-flow+immunoassay+for+the+rapid+simultaneous+detection+of+clenbuterol+and+ractopamine+in+swine+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+%26+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine.</a> Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).</li>
<li>Kranthi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colloidal-gold+based+lateral-flow+immunoassay+kit+for+%27quality-control%27+assessment+of+pyrethroid+and+endosulfan+formulations+in+a+novel+single+strip+format%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for 'quality-control' assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format.</a> Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).</li>
<li>Qian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immunochromatographic+strip+for+rapid+detection+of+capsid+protein+antigen+p27+of+avian+leukosis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus.</a> Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).</li>
<li>Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , US20040184954A1 (2003).</li>
<li>Miočević, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Lateral+Flow+Assays+for+Salivary+Biomarker+Assessment%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review.</a> Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).</li>
<li>Lisa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+based+dipstick+immunoassay+for+the+rapid+detection+of+dichlorodiphenyltrichloroethane%3A+an+organochlorine+pesticide%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibody-Europium+Conjugate-Based+Lateral+Flow+Time-Resolved+Fluoroimmunoassay+for+Quantitative+Determination+of+T-2+Toxin+in+Cereals+and+Feed%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed.</a> Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+synthesis+of+high-quality+CuInZnxS2%2Bx+core%2Fshell+nanocrystals+and+their+application+for+detection+of+C-reactive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein.</a> Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).</li>
<li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+double+antibody+sandwich-lateral+flow+immunoassay+for+the+rapid+and+simple+detection+of+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+immunochromatography+test+strip+for+rapid%2C+quantitative+and+sensitive+detection+of+alpha+fetoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein.</a> Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145(2011).</li>
<li>Song, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescent+lateral-flow+immunoassay+for+hepatitis+B+virus+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping.</a> Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+GsRerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Clinical+Application+of+a+Rapid+IgM-IgG+Combined+Antibody+Test+for+SARS-CoV-2+Infection+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis.</a> Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).</li>
<li>Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+application+value+analysis+of+the+2019-coronary+virus+disease+was+analyzed+by+the+whole+blood+Sars-COV+2+specific+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Science+Edition%22%5BJournal%5D)">The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection.</a> Natural Science Edition. 42, (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Monoclonal+Antibodies+Against+Natural+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products.</a> Journal of Visualized Experiments. , e57116(2019).</li>
<li>Sai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+and+Immunoaffinity+Column+Chromatography+for+Saikosaponin+d+Using+an+Anti-Saikosaponin+d+Monoclonal+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody.</a> Planta Medica. 82, 432-439 (2016).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Sensitive+Immunochromatographic+Strip+Test+for+Rapid+and+Quantitative+Detection+of+Saikosaponin+d%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d.</a> Molecules. 23 (2), 338(2018).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Lateral-Flow+Immunoassay+for+the+Quantum+Dot-based+Detection+of+Puerarin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-based+lateral-flow+immunoassay+for+rapid+detection+of+rhein+using+specific+egg+yolk+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Cells%2C+Nanomedicine%2C+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit werk presenteren we een protocol voor de bereiding van mAbs tegen van natuurlijke producten afgeleide kleine moleculen. De essentiële stappen en de zaken die aandacht nodig hebben in de procedure zijn geschetst en we hebben het nut van dit protocol aangetoond met behulp van het kleine molecuul SSD als voorbeeld. Voorbeeldspectra, TEM-beelden, kwantitatieve resultaten en methodologisch onderzoek worden weergegeven in representatieve gegevens. Daarom hebben we aangetoond dat de colloïdaal goudproductie, AuNP-mAb-con...

Membraangebaseerde laterale flow immunochromatografische strips (ICS'en) zijn nuttige hulpmiddelen voor goedkope en snelle detectie. Het nitrocellulosemembraan als drager en colloïdaal goud als markers van immuunchromatografie snelle diagnostische reagentia zijn de meest gebruikte POCT-methode (point of care testing) en de testomvang van het project is breder. Van hun oorspronkelijke toepassing bij monitoring tijdens de zwangerschap, is hun gebruik uitgebreid tot het controleren van de bloedstollingstoestand1,2,myocardiale verwonding3,diergeneeskunde4,residuen van bestrijdingsmiddelen5,infectieziekten6 en medicijnconcentraties. Meer soorten monsters kunnen worden beoordeeld, waaronder urine, speeksel, volbloed, serum en andere lichaamsvloeistoffen7,8,9.
In de afgelopen jaren zijn tal van nieuwe assays ontwikkeld voor het detecteren van biomarkers bij de diagnose van aandoeningen, waaronder HPLC, UPLC, LC-MS en ELISA, die gevoelig en nauwkeurig, geloofwaardig en specifiek zijn. Deze methoden vereisen echter geavanceerde instrumentatie, complexe voorbewerking en tijdrovende behandelingen9. Daarom is het ontwikkelen van een snellere en handigere point-of-care diagnostische strategie voor de zelf- en real-time detectie van medicinale actieve verbindingen dringend10,11.
De populariteit van ICS'en, vooral voor veel voorkomende tests, wordt gedreven door hun gebruiksgemak, omdat ze geen professionals of uitgebreide instrumentale opstellingen vereisen12. Met andere woorden, mensen die geen speciale training hebben, kunnen strips of zelftests bedienen13. De resultaten van de test kunnen in 5 minuten worden verkregen, wat betekent dat deze kan worden gebruikt voor inspecties ter plaatse14. Bovendien kunnen volgens onze berekeningen de kosten van strips lager zijn dan 1 RMB15, wat betekent dat de tests goedkoop zijn om16te promoten . Vandaar dat de ICS een relatief nauwkeurig, eenvoudig en goedkoop wegwerpapparaat is. ICS'en op basis van colloïdaal goud17,18 worden ook toegepast bij snelle COVID-19-detectie.
Het principe van ICS is onder te verdelen in sandwich ICS en competitive ICS. Figuur 1A is een schematisch diagram van de sandwich ICS, die voornamelijk wordt gebruikt voor het detecteren van macromoleculaire stoffen zoals eiwitten, waaronder tumormarkers, ontstekingsfactoren en humaan choriongonadotrofine (HCG, antigeen in de vroege zwangerschap). Bij deze methode worden gepaarde antilichamen gericht op verschillende epitopen van het antigeen gebruikt en wordt het vanvangantilichaam als testlijn op het NC-membraan gedroogd. Gelabeld antilichaam wordt gedroogd op het geconjugeerde pad en secundair antilichaam wordt gebruikt als controlelijn.
Figuur 1B is een schematisch diagram van concurrerende ICS, dat voornamelijk wordt gebruikt om stoffen met kleine moleculen te detecteren (MWCO < 2000 Da). Het coatingantigeen wordt als testlijn op het NC-membraan gefixeerd en het gelabelde antilichaam wordt gedroogd op het geconjugeerde pad. Tijdens de detectie stromen het monster en het gelabelde antilichaam onder capillaire werking door de detectielijn en bindt het gecoate antigeen concurrerend vrij antigeen in het monster en ontwikkelt een rode kleur op de detectielijn.
Onlangs beschreven we de procedure van monoklonale antilichaamgeneratie tegen natuurlijke producten19. In dit werk ontwikkelden we een nieuwe laterale flow immunoassay op basis van de voorbereide anti-SSD mA20 voor snelle, on-site detectie. De resultaten geven aan dat de immunochromatografietest een onmisbaar en handig hulpmiddel is voor het detecteren van van natuurlijke producten afgeleide verbindingen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62754/62754fig01.jpg"> Figuur 1 Schematisch diagram van de immunochromatografietest (A) Sandwich immunochromatografische teststrips. B)Indirect concurrerende immuunchromatografische teststrips. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al.,201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62754/62754fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Chloorgouwzuuroplossing (HAuCl4)</td><td>Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory</td><td>JY-SJ102</td><td></td></tr><tr><td>runderen serum albumine</td><td>AMRESCO</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>centrifugebuis 15 mL</td><td>Corning</td><td>430645</td><td></td></tr><tr><td>centrifugebuis 50 mL</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>ELISA platen, 96 putjes</td><td>NUNC</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Sinopharm</td><td>H5072</td><td></td></tr><tr><td>Glasvezelmembranen</td><td>Jieyi</td><td>XQ-Y6</td><td></td></tr><tr><td>geit-anti-muis IgG antilichaam</td><td>applygen</td><td>C1308</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membranen</td><td>Millipore</td><td>millipore 180</td><td></td></tr><tr><td>ovaalbumine</td><td>Beijing BIODEE</td><td>5008-25g</td><td></td></tr><tr><td>PEG20000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RNBC6325</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10mL</td><td>COSTAR</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 25mL</td><td>FALCON</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>semi-stijve PVC platen</td><td>Jieyi</td><td>JY-C104</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Beijing Chemical Works</td><td>C1034</td><td></td></tr><tr><td>natriumperiodaat</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>BW-G0008</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>TipOne tips 1.000 &micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Solarbio</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Membraangebaseerde laterale flow immunochromatografische strips (ICS'en) zijn nuttige hulpmiddelen voor goedkope zelfdiagnose en zijn efficiënt toegepast op toxine-, fysiologische index- en klinische biomarkerdetectie. In dit protocol geven we een gedetailleerde beschrijving van de stappen om een snelle, gevoelige en kwantitatieve laterale-flow immunoassay te ontwikkelen (met AuNPs als marker en mAbs als probe). De procedure beschrijft de bereiding en karakterisering van colloïdaal goud, synthese van het AuNP-mAb-conjugaat, assemblage van de immunochromatografische strip en methodologisch onderzoek van de test. De resultaten toonden aan dat de laatste strips verder kunnen worden gebruikt voor de snelle en gemakkelijke zelfdiagnose van een klein molecuul, wat een alternatief hulpmiddel kan bieden bij de snelle en nauwkeurige analyse van fysiologische en biologische indices.

Karakterisering van colloïdaal goud De bereide colloïdaal goudoplossingen waren claret rood. TEM-analyses werden gebruikt om de morfologie en vorm van AuNPs te bepalen (Figuur 2A-D). Figuur 2A en figuur 2B laten zien dat de deeltjes veelvlakkvormig zijn en gelijkmatig verdeeld. De gemiddelde diameter van AuNP's bleek ongeveer 14 nm te zijn(figuur 2C). Een hoge resolu...

Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

De procedure beschrijft de bereiding van colloïdaal goud en de assemblage van de immunochromatografische strips. Ten eerste werden chlooraurinezuur en natriumcitraat gebruikt voor de synthese van colloïdaal goud. Natriumcitraat werd toegevoegd aan chloroaurinezuuroplossing en gekookt om colloïdaal goud met de juiste deeltjesgrootte te verkrijgen.Synthese, het colloïdaal goud antilichaam conjugaat. Na centrifugering werden colloïdale gouddeeltjes opgelost in de juiste oplossing en vervolgens geresuspendeerd om colloïdale goudoplossing te verkrijgen. Dompel het glasvezelmembraan onder in de conjugatie om het geconjugeerde pad voor te bereiden.Laat kunstmatig antigeen en secundaire antilichamen op het NC-membraan vallen als T-lijn en C-lijn. Bevestig respectievelijk het NC-membraan, het absorberende membraan, het monsterkussen en het glasvezelmembraan in het PVC-bord. Snijd het geassembleerde karton in een strook van 3,5 millimeter breed.Confect vol procent goudchloridezuuroplossing en 1% natriumcitraatoplossing respectievelijk. Zet de magneetroerder aan en plaats de kolf op een mixer. Voeg 120 milliliter gedestilleerd water toe in een kolf met ronde bodem en verwarm het tot de kook op een thermostatische magneetroerder.Blijf koken en voeg snel 0,5 milliliter vol procent chloroaurinezuur en vijf milliliter 1% natriumcitraat toe. Blijf vijf tot 10 minuten verwarmen. Observeer de kleur van de oplossing veranderen van lichtgeel naar wijnrood.Schakel de stroom van de thermostatische magneetmenger uit, koel af tot kamertemperatuur en plaats het mengsel in een schone fles. Bewaren bij vier graden Celsius. De gouden nanodeeltjes laten het Tyndall-effect zien.De grootte en de morfologie van de gouden nanodeeltjes werden bepaald door ultraviolette spectroscopie en de transmissie-elektronenmicroscoop beeldvorming. Voeg 100 microliter natriumchlorideoplossing toe aan acht buisjes. Stel de colloïdaal goudoplossingen in op pH 5 tot 12 met 0,1 mol per liter kaliumcarbonaat.Voeg 100 microliter colloïdaal goudoplossing toe aan acht buisjes die natriumchloride bevatten. Ga enkele minuten na het mengen staan voor post. Observeer de kleurverandering van elke buisoplossing en noteer de buis die rood blijft.Kies de pH-waarde met de laagste hoeveelheid toegevoegd kaliumcarbonaat en een stabiele oplossingskleur als de optimale pH-waarde voor het bereiden van geconjugeerd. Dezelfde aanpak aangepast. Observeerde de kleurverandering en registreer de buis die rood blijft.Kies de hoeveelheid antilichaam met de laagste concentratie mAB en een stabiele oplossingskleur als de optimale hoeveelheid mAB. Neem 10 milliliter colloïdale goudoplossing en gebruik 0,1 mol per liter kaliumcarbonaat om de oplossing aan te passen aan de optimale pH-waarde. Voeg langzaam SSd mABs toe met de juiste concentratie en schud gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Centrifugeer het mengsel bij 2000 RPM gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het neerslag dat onzuiverheden van het neergeslagen colloïdaal goud bevat. Centrifugeer het mengsel bij 10.000 RPM gedurende 40 minuten.Gooi het supernatant weg. Het neerslag is colloïdaal goud mAB-geconjugeerd. Voeg Tris zoutzuur, BSA, Tween 20 en PEG 20, 000 toe en meng vervolgens goed om de resuspensiebuffer te bereiden.Voeg de resuspensiebuffer toe en dissociëer het neerslag. Het membraanmateriaal stript, inclusief glascellulosemembraan, polyester cellulosemembraan en het PVC-bord. Het membraanmateriaal moet volgen en evalueren met een steriele microscoop om zich te ontdoen van de inhomogeniteit.Plaats eerst het NC-membraan op het PVC-bord op twee centimeter van de rand van het sectie-uiteinde van het bord. Ten tweede, laat twee milligram per milliliter SSd-BSA op het NC-membraan vallen op twee centimeter van de bovenrand als testlijn en laat 1,5 milligram per milliliter gouden anti-muis IgG op het NC-membraan vallen op twee centimeter van de onderrand als controlelijn. Bevestig de absorberende pad aan de PVC-plaat boven het NC-membraan en overlap met het NC-membraan met twee millimeter.Trim het glasvezelmembraan tot vijf centimeter lang en twee centimeter breed en gebruik het als een geconjugeerde pad. Dompel het glasvezelmembraan onder in de gouden nanodeeltjes mAB-conjugaatoplossing. Laat een tijdje weken om de gouden nanodeeltjes mAB-absorptie te maken.Droog het brede membraan in de couveuse op 37 graden. Plak de voorbehandelde geconjugeerde pad onder het NC-membraan en de overlappende lengte met het NC-membraan moet 0,1 centimeter zijn. Trim het Fusion3-membraan in 1,8 centimeter lang en 3,5 centimeter breed en gebruik als monsterpad.Plaats vervolgens het monsterkussen op het PVC-bord en overlap het geconjugeerde pad met twee millimeter. Knip, monteer de karton in 3,5 millimeter brede stroken met behulp van een snijmachine en compact met behulp van een batch-lamineersysteem. Plaats ten slotte de teststrips in de schaal.Verzegel ze in een aluminiumfoliezak met droogmiddel en bewaar ze uit de buurt van licht. Het ICS is nu geassembleerd. Laat 50 microliter monsteroplossing op het monstergat vallen om het chromatografieproces te observeren.Analyseer vervolgens de strips met behulp van een draagbare striplezer. De machine kan de verhouding van de testlijn tot de besturingslijn leveren. Evalueer de specificiteit, gevoeligheid, herhaalbaarheid en stabiliteit van de ICS-test.De bereide colloïdaal goudoplossingen werden gelezen. Transmissie-elektronenmicroscoopanalyses onthulden dat de deeltjes polyhedraal van vorm waren en uniform waren verdeeld met een gemiddelde diameter van 14 nanometer. Hoge resolutie transmissie elektronenmicroscoop beelden toonden een continu randpatroon met een afstand van 0,117 nanometer gouden nanodeeltjes.Ultraviolet zichtbare absorptie gaf aan dat verschillende maten colloïdale gouddeeltjes kunnen worden verkregen door het aandeel citraatnatrium en chlooraurinezuur te veranderen. In het kwantitatieve experiment werden de strips met de testresultaten van saikosaponine D gescand met behulp van een draagbare ICS-lezer. We berekenden een standaardcurve door niet-concentraties van saikosaponine D te relateren aan de overeenkomstige absorptie bij elke concentratie.Na methodologisch onderzoek kan de methode worden toegepast voor kwantitatieve en semi-kwalitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen. Deze procedure omvat de bereiding van colloïdaal goud, synthese van gouden nanodeeltjes mAB-conjugaat, assemblage van de strip en methodologisch onderzoek. Dit werk biedt een gedetailleerd protocol voor de ontwikkeling van immunochromatografische strip voor gebruik bij snelle en kwantitatieve detectie van kleine moleculen.Na het bekijken van deze video hoop ik dat je een goed begrip hebt voor de voorbereiding van de immunochromatografische strip. Bedankt voor het kijken en veel succes voor je experimenten.

development-lateral-flow-immunochromatographic-strip-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

Een geïntegreerde microfluïdische thermoplastische chip is ontwikkeld voor gebruik als een moleculaire diagnostische. De chip voert nucleïnezuur extractie, reverse transcriptase, en PCR. Werkwijzen voor het vervaardigen en gebruiken van een chip worden beschreven.

Microfluïdische chip fabricage en methode om Influenza Detect

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van twee IgG-klasse monoklonale antilichamen (mAbs) die sterk reageren op myoglobine van cetacean. Deze mAbs worden toegepast op een colloïdaal goud immunochromatografische teststrip op basis van het sandwich-formaat om het Mb van cetacean te onderscheiden van zeehond en andere dieren.

Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

Om eenvoudige fabricagebenaderingen voor meerdere assaybehoeften te onderzoeken, hebben we een vloeistofabsorberend kanaalsysteem gemaakt van katoenmateriaal. Dit apparaat werd gebruikt om een platform voor meerdere detecties te vestigen en besmettingsproblemen op te lossen die vaak laterale flow-gebaseerde biomedische apparaten beïnvloeden, voor klinische urinalyse van nitriet, totaal eiwit en urobilinogeen.

Fabriceren Cotton Analytical Devices

Een microfluidic biosensor platform is ontworpen en vervaardigd met behulp van goedkope droge film fotoresist technologie voor snelle en gevoelige kwantificering van verschillende analyten. Deze eenmalig gebruik-systeem zorgt voor de elektrochemische uitlezing van enzyme-linked tests aan-chip-geïmmobiliseerd door middel van de techniek van de stop-flow.

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

Microfluïdica is een krachtig hulpmiddel voor de ontwikkeling van diagnostische tests. Dure apparatuur en materialen, evenals bewerkelijke fabricage- en handlingtechnieken, zijn echter vaak vereist. Hier beschrijven we het fabricageprotocol van een acryl microfluïdisch apparaat voor magnetische micro- en nanodeeltjesgebaseerde immunoassays in een goedkope en eenvoudig te gebruiken omgeving.

Computer numerieke controle Micromilling van een microfluïdisch acrylapparaat met een gespreide beperking voor magnetische immunoassays op basis van nanodeeltjes

Om tegemoet te komen aan dringende behoeften op het gebied van dengue-diagnostiek, introduceren we hier een in de smartphone-app geïntegreerd Dengue NS1 Paper-based Analytical Device (DEN-NS1-PAD) voor het kwantificeren van de Dengue NS1-antigeenconcentratie in klinische serum-/bloedmonsters. Deze innovatie verbetert de behandeling van dengue door te helpen bij de klinische besluitvorming in verschillende zorgomgevingen, zelfs in omgevingen met beperkte middelen.

Draagbare op papier gebaseerde immunoassay gecombineerd met smartphone-applicatie voor colorimetrische en kwantitatieve detectie van dengue NS1-antigeen

Dit protocol beschrijft een CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine biomarker test die point-of-care kankerdiagnostiek mogelijk maakt door middel van de ex vivo analyse van tumor-geassocieerde protease-activiteiten.

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van quantum dot nanobeads (QDNB) en de detectie van ziektebiomarkers met behulp van QDNB-gebaseerde lateral flow immunoassay strips. De testresultaten kunnen binnen 15 minuten kwalitatief worden beoordeeld onder UV-lichtverlichting en kwantitatief worden gemeten met behulp van een fluorescerende striplezer.

Fluorescerende laterale flow-immunoassay op basis van Quantum Dots nanobeads

Leer de synthese van colloïdaal goud en assemblage van immunochromatografische strips voor snelle detectie van kleine moleculen. Deze methode biedt een betrouwbaar protocol voor diagnostisch onderzoek.

Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen

Meer video's verkennen