Optimalisatie van de instellingen en voorwaarden voor ex vivo elektroretinogram om de retinafunctie in kleine en grote ogen te bestuderen
27 juni 2022
Modificatie van bestaande multi-elektrode array of patch clamp apparatuur maakt het ex vivo elektroretinogram breder toegankelijk. Verbeterde methoden om ex vivo lichtresponsen te registreren en te onderhouden vergemakkelijken de studie van fotoreceptor en ON-bipolaire celfunctie in het gezonde netvlies, diermodellen van oogziekten en menselijke donorvliezen.
Dit protocol toont de omstandigheden aan die nodig zijn om de retinale functie in ex vivo ERG te behouden, met name de extreem gevoelige B-golf geproduceerd door ON-bipolaire cellen. Met ex vivo ERG kunnen we de functie van verschillende soorten retinale neuronen met een hoge signaal-ruisverhouding meten, terwijl we de gemakkelijke introductie van farmacologische middelen mogelijk maken. Deze methode is bijzonder vatbaar voor het kwantificeren van de werkzaamheid van farmacologische middelen op de retinale functie en ziekte.
Om te beginnen, converteer een multi-elektrode array setup door de ex vivo ERG monsterhouder aan te sluiten op een differentiële versterker via een headstage. De versterker moet worden aangesloten op de analoge ingang van de interfacekaart van het multi-elektrode arraysysteem. Gebruik de opnamesoftware voor de multi-elektrode array om de invoergegevens van de ex vivo ERG op te nemen en op te slaan.
Stel de versterking van de differentiële versterker in op 100 en voeg een extra 10X spanningsversterking toe, afhankelijk van de digitizerspecificaties. Stel het laagdoorlaatfilter in op 100 hertz. Als alternatief, om een patchklemopstelling om te zetten, sluit u de ex vivo ERG-monsterhouder via een headstage aan op een differentiële versterker, die moet worden aangesloten op de headstage van de patchklemversterker.
Gebruik de patchklemsysteemsoftware en de digitizer om de invoergegevens van de ex vivo ERG op te nemen en op te slaan. Stel de parameters in zoals eerder weergegeven. Sluit LED's met de juiste golflengten aan op de microscoop.
Om lichtprikkels te regelen, gebruikt u een LED-driver die wordt bestuurd door analoge uitgangen van een digitizer. Bedien de LED's met opnamesoftware die het activeren van lichtprikkels mogelijk maakt. Kalibreer vervolgens de lichtopbrengst van de LED's op de positie van het netvlies in de monsterhouder met behulp van een fotodiode.
Plaats indien nodig filters met neutrale dichtheid om de lichtintensiteit in het lichtpad te dimmen. Om de elektrode voor te bereiden, plaatst u een zilverchloride pelletelektrode in een draadgeleider. Vul de binnenkant van de kunstaasconnector met hete lijm en steek een socket van twee millimeter in de hete lijm vanaf de niet-schroefdraadzijde.
Soldeer een zilveren draad van de EP-1 elektrode aan de twee millimeter aansluiting. Schroef de afgewerkte elektrode met een O-ring op de schroefdraad in de elektrodepoorten van de ex vivo ERG-monsterhouder. Voor grote ogen, inclusief menselijke donorogen, reinigt u de bol van het resterende bindweefsel en verwijdert u het voorste segment en de lens.
Gebruik een scalpel om een snee te maken op ongeveer drie millimeter van de limbus. Steek een gebogen dissectieschaar in de incisie en knip langs de limbus om het voorste deel van het oog met de lens te verwijderen. Verkrijg retinale monsters voor ex vivo elektroretinografie met een wegwerpbiopsiepunch van drie tot zes millimeter.
Om het weefsel op de monsterhouder te monteren, plaatst u de onderste helft van de monsterhouder in een grote petrischaal en vult u deze met zuurstofrijk Ames'medium, zodat de koepel van de monsterhouder gewoon wordt ondergedompeld. Pak de rand van het netvlies voorzichtig vast met een fijne tang en breng het netvlies over op de koepel van de ex vivo monsterhouder, fotoreceptorzijde naar boven gericht. Til de monsterhouder uit de Ames'-oplossing en zorg ervoor dat het netvlies op zijn plaats blijft.
Droog de plaat van de monsterhouder volledig om ruis, elektrische overspraak en signaal rangeren te minimaliseren. Monteer vervolgens beide helften van de monsterhouder met vier schroeven en sluit de perfusielijn aan. Drijf de elektrode aan in de onderste helft van de monsterhouder en sluit de anodekabel aan op de binnenste retinale kant en de kathodekabel op de fotoreceptorzijde.
Perfuseer de monsterhouder met ten minste één milliliter per minuut zuurstofrijk Ames'medium gedurende 10 tot 20 minuten om de lichtrespons te laten stabiliseren. Ex vivo ERG maakte de opname van fotoreceptor- en ON-bipolaire cellichtreacties van het netvlies van de muis mogelijk. Registratie van fotoreceptorreacties van menselijke donorvliezen was mogelijk met tot vijf uur postmortale vertraging van enucleatie en minder dan 20 minuten vertraging voor ON-bipolaire celresponsen.
Onder ideale omstandigheden waren responsamplitudes en kinetiek in beide celtypen relatief stabiel in de loop van de tijd, maar vertoonden een langzame afname 40 tot 45 minuten nadat netvliezen op de monsterhouder waren gemonteerd. Verminderde temperatuur in de monsterhouder vertraagde de kinetiek van zowel fotoreceptoren als ON-bipolaire cellen aanzienlijk. Het verminderde echter de amplitude van de B-golf, maar niet de A-golf.
Omgekeerd verminderde het vertragen van de perfusiesnelheid de amplitudes van zowel fotoreceptor- als ON-bipolaire celresponsen, maar had geen invloed op de impliciete tijd van de A- of de B-golf. Stopzetting van de perfusie gedurende 10 minuten gevolgd door reperfusie resulteerde in een volledig verlies van ON-bipolaire celfunctie met geconserveerde fotoreceptorresponsen. Voldoende perfusiesnelheid en fysiologische temperatuur zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van stabiele responsen, met name van ON-bipolaire cellen in de ex vivo ERG.
Dit protocol maakt het mogelijk om de verschillen in fotoreceptorfunctie in de menselijke macula en periferie diepgaand te onderzoeken en vragen te beantwoorden die voorheen alleen bij niet-menselijke primaten konden worden uitgevoerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het verbeteren van ex vivo elektroretinogram (ERG) opnamemethoden om retinale neuronfunctie te bestuderen. De aanpak richt zich op ON-bipolare cellen en fotoreceptorfunctionaliteit met behulp van verschillende setups, wat inzichten biedt in farmacologische effecten op het netvlies in gezonde en zieke toestanden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschap
- Retinaal biologisch onderzoek
Achtergrond
- Uitdagingen bij het effectief opnemen van retinale functie in ex vivo-instellingen.
- Belang van ON-bipolare cellen en fotoreceptoren in retinale gezondheid en ziekte.
- Behoefte aan betrouwbare methoden om farmacologische interventies te kwantificeren.
- Bestaande technieken missen vaak toegankelijkheid en precisie.
Doel van het onderzoek
- Het verbeteren van de opname van retinale lichtreacties met behulp van aangepaste apparatuur.
- Het faciliteren van de analyse van fotoreceptor en ON-bipolare celfunctionaliteiten.
- Het evalueren van farmacologische reacties in retinale cellen.
Gebruikte methoden
- Het protocol gebruikt ex vivo ERG met multi-elektrode arrays of patch clamp-systemen.
- Muisretina en menselijke donorretina's worden gebruikt als biologische modellen.
- Elke setup omvat cruciale parameters voor versterking en filtering om nauwkeurige opnamen te garanderen.
- De belangrijkheid van het handhaven van temperatuur en perfusiesnelheden tijdens het experiment wordt benadrukt.
- Calibratie van lichtoutputs met behulp van fotodioden is cruciaal voor gecontroleerde stimulatie.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde methoden maken stabiele opnamen mogelijk van zowel fotoreceptoren als ON-bipolare cellen.
- Reacties blijven consistent, met lichte afnames waargenomen na lange montagetijden.
- Temperatuur en perfusiesnelheid hebben een significant effect op de amplitude van reacties, met name de B-golf.
- De bevindingen verduidelijken de verschillen in fotoreceptorfunctie over verschillende menselijke retinagebieden.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een betrouwbare methode voor het onderzoeken van retinale neuronfuncties.
- Verbeterde toegankelijkheid maakt geavanceerde farmacologische studies mogelijk die relevant zijn voor retinale gezondheid.
- De bevindingen verhogen het begrip van neuronale mechanismen en mogelijke interventies voor retinale ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Optimizing ex vivo ERG conditions enables stable, high-fidelity recording of retinal neuronal responses, particularly from ON-bipolar cells and photoreceptors, supporting mechanistic de-risking in retinal target validation. The method allows quantitative assessment of pharmacological interventions in isolated tissue, reducing systemic variability and improving predictive confidence in preclinical models. This positions the technique as a translational bridge for evaluating retinal therapeutics across species, including human donor tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal neuronal cell-type-specific contributions to light responses, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates pharmacological agent introduction to quantify efficacy on retinal function, improving target de-risking.
- Predictive Value: Stabilized ON-bipolar cell B-wave recordings allow assessment of compound effects over time, supporting lead identification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Optimized perfusion speed and physiological temperature maximize response amplitude and stability, enabling reliable compound screening.
- Quantitative Output: Provides high signal-to-noise measurements of photoreceptor and ON-bipolar cell responses, supporting dose-response and kinetic analyses.
- Scalability: Adaptable to retina samples from small and large eyes, including human donor tissue, supporting cross-species assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables comparison of photoreceptor function between human macular and peripheral retina, supporting biomarker alignment.
- Disease-Relevant System: Maintains retinal function ex vivo for up to five hours postmortem, allowing evaluation of pathological changes and therapeutic interventions.
- Mechanistic De-risking: Isolates tissue-intrinsic retinal responses, minimizing confounding systemic influences in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The optimized ex vivo ERG method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, supporting data-driven go/no-go decisions in retinal therapeutic development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of retinal neuronal mechanisms and pathway-specific contributions to visual function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative light response readouts enabling reliable compound evaluation in retinal assays.
- Analytics: Generates kinetic and amplitude data (A and B waves) that allow comparison of treatment effects across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects findings from model systems to human donor retina, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for retinal functional assessment across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on retinal cell-type-specific responses, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardized perfusion and temperature controls improve reproducibility and reduce variability in retinal function measurements.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by improving predictive confidence in retinal target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by de-risking mechanistic uncertainty in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal tissue dissection, electrophysiology, and pharmacological agent handling.
- Dependent on specialized equipment including differential amplifiers, LED drivers, photodiodes, and perfusion systems.
- Necessitates standardized protocols for tissue mounting, perfusion speed (at least 1 mL/min), and physiological temperature maintenance.
- Adaptation across model systems requires optimization of biopsy punch size and dissection techniques for varying eye dimensions.
- Practical limitations include gradual decline in response stability after 40–45 minutes post-mounting, necessitating timely experimental execution.
