Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen
17 september 2021
Detectie van gastheer-bacteriële pathogene interacties op basis van fenotypische therapietrouw met behulp van high-throughput fluorescentie labeling beeldvorming samen met geautomatiseerde statistische analysemethoden maakt een snelle evaluatie van potentiële bacteriële interacties met gastheercellen mogelijk.
Deze methode biedt een snelle, high-throughput detectie van bacteriën die zich hechten aan gastheercellen. In vergelijking met de conventionele platingmethoden vermindert het de hands-on tijd die nodig is voor de kwantificering van de aanhangende bacteriën. Deze techniek is geautomatiseerd, tijdbesparend en zeer reproduceerbaar.
Het is ook een veel toegepaste zowel op de meeste van de gastheer cellen. Deze methode, daar is heel eenvoudig. Voor de eerste proef moeten de omstandigheden zoals de veelheid van infectie en ook de co-incubatietijd van de gastheerbacteriën worden geoptimaliseerd.
Oogst eerst de bacterieculturen in een exponentiële fase door centrifugering op 13.000 maal G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Na het wassen van het cellenpallet met één milliliter PBS, resuspend het bacteriële palet in één milliliter PBS. Bepaal de concentraties van bacteriële suspensie door de optische dichtheid op 600 nanometer te meten.
Voeg vervolgens voor het kleuren van de bacteriële suspensie twee microliter van de 500-voudig geconcentreerde bouillon groene of rode kleurstof toe in één milliliter bacteriële suspensie om de kleurstof één keer te verdunnen. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten met zachte rotatie in het donker. Centrifugeer na 30 minuten de gekleurde bacteriën gedurende twee minuten op 13.000 keer G en resuspend de pellet in één milliliter PBS.
Verzamel de gekleurde bacteriële cellen door centrifugering op 13.000 keer G gedurende twee minuten. Resuspend de pellet in één milliliter vers F12 K-medium en meet de optische dichtheid van elke cultuur op 600 nanometer. Verdun de culturen vervolgens tot de gewenste concentraties op basis van de veelheid van infectie en gastheercelconcentratie.
Voor bacteriële hechtingstest, was de eerder gekweekte A549-cel monolagen drie keer door 100 microliter warme PBS aan elke put toe te voegen en pipetteer voorzichtig op en neer. Gooi pbs vervolgens weg. U kunt ook 10 seconden wachten nadat u PBS hebt toegevoegd en PBS vervolgens met vacuüm verwijderen.
Om de kinetiek van bacteriële associatie te bepalen, bedekt u de cellen met 100 microliter gewenste concentraties bacteriële suspensie met verschillende veelheid van infectie. Spin de bacteriën en incubeer de geïnfecteerde A549-cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende nog eens een uur. Verwijder de ongebonden bacteriën door de monolagen vijf keer te wassen met warme PBS zoals aangetoond.
Fixeer vervolgens de cellen door 100 microliter 4% formaldehyde toe te voegen in alle putten van een 96-putplaat op het ijs. Was de plaat na 15 minuten drie keer met PBS om de fixatieoplossing te verwijderen. Beits in de kernen met 50 nanogram per milliliter DAPI-vlek gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Na het wassen van de cellen met PBS, bedek de geïnfecteerde A549-cellen met 100 microliter PBS om droging te voorkomen en bewaar de plaat vervolgens op vier graden Celsius gedurende maximaal twee dagen in het donker of ga verder voor beeldvorming. Om de gegevensintegriteit te behouden, kiest u willekeurig en handmatig vijf locaties van elke put om de afbeeldingen vast te leggen met een vergroting van 20 keer. Leg de fluorescerende beelden van bacteriën vast onder GFP-kanalen, A549-cellen onder DAPI en gebruik voor de bacteriën gekleurd door de rode fluorescerende kleurstof PE Si vijfkanaals.
Stel de parameters van de rollende bal in voor het afvlakken en meet automatisch de puntspreidingsfunctie van beelddeconvolutie op basis van het doel voor het bereiken van een betere resolutie. Meet de fluorescentie-intensiteit van de gastheercellen en bacteriën. Stel de zwakste fluorescentie-intensiteit van gastheercellen en bacteriën in als de drempels voor het aantal cellen en tel alle bacteriën die zich binnen 15 micrometer afstand van een gastheercel bevinden als de hechtingsbacteriën.
Zodra de cellen zijn geteld uit alle geautomatiseerde afbeeldingen, analyseert u kritische uitlezingen, zoals het aantal gastheercellen, celgrootten en -vormen, het totale aantal bacteriën en het gemiddelde bacteriële account per gastheercel, wat de belangrijkste indicator is om bacteriële hechting te bepalen. Na een uur co-incubatie hechtte pseudomonas aeruginosa stam PAO1 zich op dosisafhankelijke wijze aan A549-cellen. Vergelijkbare resultaten werden ook waargenomen bij grampositieve bacteriën listeria monocytogenes en de negatieve controle bacillus subtilis.
Een representatief beeld van gastheertrouw P aeruginosa segmentatie toont het gemak van het tellen van bacteriële cellen met behulp van dit protocol. De resultaten van de geautomatiseerde analyses omvatten bacteriële en gastheerceltellingen, de gemiddelde bacteriële tellingen per gastheercel en gastheercelgroottes en gebieden die de status van de gezondheid van gastheercellen, bacteriële hechtingsniveau en bacteriële cytotoxiciteit vertegenwoordigen. Naast A549-cellen werden ook HUVECs getest op therapietrouwtest.
Serratia rubidaea en streptococcus agalactiae waren wel aanhangend aan HUVEC, maar niet aan A549-cellen, en dat toont de effectieve detectie en geschiktheid van meerdere gastheren aan om de interacties van de gastheerbacteriën met behulp van deze methode te bestuderen. Gastheercellen moeten ongeveer 90 tot 100% samenvloeiing bereiken om de ongewenste bacteriehechting aan de bodem van de putten te minimaliseren. Met deze techniek kunnen onderzoekers de nieuwe mechanismen verkennen, de interacties tussen gastheer en plaag.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze methode maakt een snelle, high-throughput detectie mogelijk van bacteriële adhesie aan gastheercellen. In vergelijking met conventionele plaatmethoden vermindert het de benodigde handmatige tijd voor de kwantificering van adherente bacteriën.
Belangrijkste componenten van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Interacties tussen pathogeen en gastheer
Achtergrond
- Traditionele methoden voor het detecteren van bacteriële adhesie zijn tijdrovend.
- High-throughput technieken kunnen de efficiëntie in onderzoek verhogen.
- Geautomatiseerde methoden kunnen de reproduceerbaarheid van resultaten verbeteren.
- Optimalisatie van experimentele condities is cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
Doel van de studie
- Om een snelle methode te ontwikkelen voor het detecteren van bacteriële adhesie.
- Om de tijd en arbeid die gepaard gaan met traditionele methoden te verminderen.
- Om een reproduceerbare techniek te bieden die toepasbaar is op diverse gastheercellen.
Gebruikte methoden
- High-throughput fluorescence labeling imaging.
- Geautomatiseerde statistische analysemethoden.
- Optimalisatie van de multipliciteit van infectie.
- Co-incubatie van gastheercellen en bacteriën.
Belangrijkste resultaten
- De methode vermindert de actieve werktijd aanzienlijk.
- Deze is toepasbaar op een breed scala aan gastheercellen.
- Resultaten zijn reproduceerbaar over verschillende proeven.
- Optimalisatie is noodzakelijk voor de eerste proeven.
Conclusies
- Deze techniek biedt een gestroomlijnde aanpak voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en bacteriën.
- Het kan leiden tot snellere onderzoeksresultaten in de microbiologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse bacteriële soorten en gastheertypes.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Geautomatiseerde high-throughput detectie van bacteriële adhesie aan gastheercellen pakt een kritiek knelpunt aan in vroegtijdig onderzoek naar infectieziekten en dreigingsbeoordelingen. Door snelle, kwantitatieve en reproduceerbare meting van bacteriële-gastheerinteracties mogelijk te maken, vergroot deze methode het voorspellend vertrouwen bij target-validatie en ondersteunt zij een efficiënte triage van discovery-portfolio's voor anti-infectiva. De aanpak verkort de experimentele tijdlijnen en de operationele last, wat een directe impact heeft op de wendbaarheid van de pipeline en de toewijzing van middelen.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt robuuste analyse mogelijk van bacteriële adhesiemechanismen die relevant zijn voor de initiatie van infecties.
- Ondersteunt functionele validatie van doelwitten voor gastheer-pathogeeninteracties voor anti-infectieuze strategieën.
- Faciliteert mechanistische risicovermindering door het leveren van kwantitatieve adhesiemetrieken over verschillende bacteriële soorten en gastheerceltypen heen.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het verder ontwikkelen van kandidaat-doelwitten in pipelines voor infectieziekten.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, kwantitatieve adhesie-assays voor die geschikt zijn voor high-throughput compound screening.
- Standaardiseert assay-condities en readouts, wat de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen laboratoria ondersteunt.
- Maakt snelle, geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse mogelijk voor schaalbare screening-workflows.
- Levert kwantitatieve outputs, zoals het gemiddelde bacteriële aantal per gastheercel, ter ondersteuning van een betrouwbare evaluatie van compounds.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro adhesiedata uit met ziekte-relevante gastcelmodellen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door de gezondheid van gastcellen en cytotoxiciteit samen met de adhesie te kwantificeren.
- Biedt een platform voor vergelijkende analyse van pathogeen-gastheerinteracties over meerdere celtypen heen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze geautomatiseerde beeldvormings- en analysemethode integreert in het vroege continuüm van discovery-to-lead identificatie voor anti-infectieve R&D en ondersteunt zowel de fasen van target-validatie als assay-ontwikkeling.
- Discovery Biology: Kwantitatieve meting van adhesie maakt hypothesetoetsing en biologische risicoreductie van infectiemechanismen mogelijk.
- Screening: Geautomatiseerde, reproduceerbare readouts vergemakkelijken de assay-gereedheid en de schaalbaarheid van high-throughput screening.
- Analytics: Levert gestandaardiseerde outputs, waaronder gastcelcounts, bacteriële counts en adhesieratio's voor een robuuste gegevensvergelijking.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming met ziekte-relevante gastmodellen en informeert de selectie van preklinische kandidaten.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, aanpasbaar platform voor diverse bacteriële en gastcelsystemen in onderzoek naar infectieziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar gastheer-pathogeeninteracties.
- Operationele waarde: Biedt automatisering, standaardisatie en aanzienlijke verminderingen in handmatige tijd en experimentele variabiliteit.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk en verbetert de kapitaalefficiëntie in anti-infectieve ontdekkingsprogramma's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van targets en kandidaten voor infectieziekten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse voor een optimale configuratie en probleemoplossing.
- Afhankelijk van toegang tot geautomatiseerde imagingplatforms en compatibele analysesoftware voor high-throughput verwerking.
- Standaardisatie van infectieparameters (bijv. multiplicity of infection, incubatietijd) is essentieel voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan verschillende gastceltypen en bacteriële soorten na een initiële optimalisatie.
- De confluentie van de gastcellen en de opzet van de assay moeten worden gecontroleerd om achtergrondruis te minimaliseren en de integriteit van de gegevens te waarborgen.
