Name: Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer de handmatige blot-and-plunge methode voor cryogene elektronenmicroscopie. Dit betrouwbare en kosteneffectieve protocol laat zien hoe je biologische monsters voorbereidt voor transmissie-elektronenmicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de Herzik-lableden voor het kritisch nadenken en het geven van feedback op dit manuscript en de video-inhoud. M.A.H.Jr. wordt ondersteund door NIH R35 GM138206 en als Searle Scholar. H.P.M.N wordt ondersteund door de Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). We willen ook Bill Anderson, Charles Bowman en Dr. Gabriel Lander van het Scripps Research Institute bedanken voor hun hulp bij het ontwerpen, assembleren en testen van de handmatige plunjer die in de video wordt getoond.

We hebben niets te onthullen.

De vitrificatie van biologische monsters voor beeldvorming door cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) blijft een uiterst belangrijke stap voor succesvolle structuurbepaling. De handmatige blot-and-plunge-methode die in dit protocol wordt beschreven, vertegenwoordigt een kosteneffectieve, betrouwbare en robuuste methode voor het snel invriezen van biologische monsters in dunne films van glasachtig ijs voor cryoEM-beeldvorming. Met behulp van de methoden die in het manuscript worden beschreven, kunnen ond...

Cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) is een krachtige structurele techniek die kan worden gebruikt om structuren van dynamische biologische monsters op te lossen tot een bijna atomaire resolutie1,2,3,4. Inderdaad, recente ontwikkelingen in directe elektronendetectortechnologieën4,5,6,7,8,9,10, verbeteringen in elektronenbronnen4,11,12,13,14 en elektromagnetische lensstabiliteit15, gekoppeld aan de voortdurende ontwikkeling van gegevensverzameling 16,17 en analysesoftwarepakketten18,19 hebben onderzoekers in staat gesteld om nu routinematig structuren van goed opgevoede monsters te bepalen tot een resolutie van 3 Å of beter4,11,13,14,20,21,22,23 . Ondanks deze verbeterde beeldvormings- en gegevensverwerkingsmogelijkheden blijft cryoEM-rastervoorbereiding de grootste belemmering voor succesvolle structuurbepaling met hoge resolutie en dient het vaak als een aanzienlijk knelpunt in de EM-workflow24,25,26,27.
CryoEM vertrouwt op de beeldvorming van biologische monsters in waterige oplossingen die worden ingevroren om een dunne film van "glasachtig" ijs te vormen - een proces dat bekend staat als vitrificatie - dat de inheemse biochemische toestand behoudt. Vitrificatie van biologische monsters voor cryoEM dateert van meer dan 40 jaar28,29,30 en veel technieken en apparatuur die voor dit proces zijn ontwikkeld, zijn gebaseerd op de oorspronkelijk gedetailleerde blot-and-plunge-methode31,32,33,34,35 , waarbij een klein volume monster (bijv. 1-5 μL) wordt aangebracht op een gespecialiseerd EM-raster voordat de overtollige oplossing wordt verwijderd met behulp van fysieke interactie van het raster met vloeipapier. De timing van dit proces wordt meestal empirisch bepaald voor elk monster, omdat een cruciaal onderdeel van vriesmonsters de dikte van de glasvochtijsfilm is - als het ijs te dik is, verslechtert de beeldkwaliteit dramatisch als gevolg van verhoogde verstrooiing van de elektronenbundel, terwijl ijs dat te dun is, eiwitoriëntaties kan beperken en / of deeltjes uit het midden van het rasterfoliegaten kan uitsluiten36 . Deze afhankelijkheid van de perfecte ijsdikte voor cryoEM met één deeltje heeft geleid tot een breed scala aan technieken en apparatuur die monsters kunnen bevriezen, waaronder robotica37,38, microfluïdica42 en ultrasone of spuitapparatuur27,39,40,41,42,43,44 . In de afgelopen jaren vertrouwen enkele van de meest populaire monstervoorbereidingsapparaten op het gebruik van robotica voor het automatisch invriezen van monsters met behulp van de blot-and-plunge-techniek45. Hoewel deze apparaten zijn ontworpen om reproduceerbaar de juiste ijsdikte te creëren voor beeldvorming, blijven ze vaak te duur voor individuele laboratoria om te kopen en te bedienen en worden ze over het algemeen gevonden in cryoEM-faciliteiten tegen uurtarieven voor gebruik. In de afgelopen jaren is de oorspronkelijke handmatige blot-and-plunge-techniek weer in gebruik gekomen3,47,48,49,50,51,52. Inderdaad, een handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat kan cryoEM-roosters van hoge kwaliteit bereiken tegen een fractie van de kosten van robotachtige tegenhangers. Bovendien biedt handmatige blotting ook meer controle over blotting, omdat onderzoekers het type blotting (d.w.z. back-blotting van het raster, front-blotting van het raster, enz.) en blottingtijd kunnen aanpassen op basis van elke individuele steekproef en onderzoeksvragen.
In dit artikel geven we details over hoe biologische monsters effectief kunnen worden ingevroren met behulp van een traditioneel handmatig vlek-en-dompel vitrificatie-apparaat in combinatie met een op maat ontworpen dewar-platform53. Best practices, waaronder de voorbereiding van het cryogene, rasterbehandeling, monstertoepassing en blotting, evenals veelvoorkomende valkuilen en aanbevelingen over hoe deze hindernissen kunnen worden overwonnen, worden verstrekt. Advies over het verhogen van de reproduceerbaarheid van de ijsdikte tussen rasterpreparaten en het wijzigen van monstervlekken op basis van het biologische specimentype worden besproken. Gezien de lage kosten die gepaard gaan met de aankoop en bediening van de handmatige plunjer die in dit manuscript wordt beschreven, kunnen laboratoria over de hele wereld biologische monsters op een kosteneffectieve en reproduceerbare manier voorbereiden op cryoEM.

<table><tbody><tr><td>4 slot grid storage box</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>14 gauge flat metal dispensing tip</td><td>Amazon</td><td>B07M7YWWLT</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm square glass coverslip</td><td>Sigma</td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>60 mm glass Petri dish to store grids</td><td>Fisher</td><td>08-747A</td><td></td></tr><tr><td>100 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>150 mm glass Petri dish to store Whatman paper</td><td>Fisher</td><td>08-747F</td><td></td></tr><tr><td>250 mL beaker</td><td>Fisher</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Blue styrofoam dewar</td><td>Spear Lab</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>Brass ethane vessel</td><td>Lasco</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>Clamping tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>Delicate task wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Dual-stage regulator with control valve</td><td>Airgas</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>Dewer grid base</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethane platform</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethane propane tank</td><td>Praxair</td><td>ET PR50ZU-G</td><td>ethane (50%) : propane (50%) in een hogedruktank</td></tr><tr><td>Ethane tank</td><td>Praxair</td><td>UN1035</td><td>ethane (100%)</td></tr><tr><td>Flexible arm task light</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr><tr><td>Humidifier</td><td>Target</td><td>719438</td><td></td></tr><tr><td>Hygrometer</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen dewar</td><td>Worthington</td><td>LD4</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen gloves</td><td>Fisher</td><td>19-059-925</td><td></td></tr><tr><td>Manual plunger stand (black stand + foot pedal)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mark 5 (plunging platform)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipette</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-029</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Eppendorf</td><td>E0030124286</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>ibis scientific</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>Ring lamp</td><td>Amazon</td><td>B07HMR4H8G</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Amazon</td><td>Fiskars 01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>Screw driver</td><td>Ironside</td><td>354711</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>Fisher</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer to transfer grid box</td><td>Amazon</td><td>LTS-3</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher</td><td>14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>Whatman blotting paper</td><td>Fisher</td><td>1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

handmatige blot-and-plunge freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Het in beeld brengen van biologische monsters met elektronen voor structuurbepaling met hoge resolutie door cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) vereist een dunne laag glasachtig ijs met de biomoleculen van belang. Ondanks tal van technologische ontwikkelingen in de afgelopen jaren die cryoEM met één deeltje naar de voorhoede van de structurele biologie hebben gedreven, blijven de methoden waarmee monsters worden verglaasd voor beeldvorming met hoge resolutie vaak de snelheidsbeperkende stap. Hoewel tal van recente inspanningen middelen hebben geboden om hindernissen te overwinnen die vaak worden ondervonden tijdens het verglaasen van monsters, waaronder de ontwikkeling van nieuwe monstersteunen en innovatieve vitrificatie-instrumenten, blijft de traditionele handmatig bediende plunjer een hoofdbestanddeel in de cryoEM-gemeenschap vanwege de lage aanschafkosten en het bedieningsgemak. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het gebruik van een standaard, guillotine-achtig handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat voor de vitrificatie van biologische monsters voor beeldvorming met hoge resolutie door cryoEM met één deeltje. Daarnaast worden ook veelvoorkomende problemen en aanbevelingen voor het oplossen van problemen beschreven voor wanneer een standaardpreparaat geen geschikt monster oplevert.

Succesvolle uitvoering van het hier beschreven blot-and-plunge-protocol zal resulteren in een dunne, uniforme laag glasachtig ijs die vrij is van hexagonaal ijs, verontreinigingen en grote gradiënten van onbruikbaar ijs die onder de elektronenmicroscoop kunnen worden waargenomen (figuur 3). Inconsistent contact van het vloeipapier met het rasteroppervlak, voortijdig verwijderen van het vloeipapier of het verplaatsen van het vloeipapier tijdens rastercontact kan de kwaliteit van het glasvocht...

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

De hier beschreven handmatige plunging-methode is een kosteneffectieve, betrouwbare methode voor het voorbereiden van monsters voor transmissie-elektronenmicroscopie. In deze video laten we zien hoe u de handmatige zuiger instelt, cryogene producten voorbereidt en handmatig vloeien en storten van EM-roosters uitvoert. Bereid de handmatige plunging-omgeving voor.Deze procedure moet worden uitgevoerd in een koelcel die op 40 graden Celsius wordt gehouden met een luchtvochtigheid van meer dan 95%We raden aan de hier getoonde materialen te gebruiken en zoals beschreven in het online protocol voor handmatig schillen en storten. Bereid de cryogene Dewar en Manual Plunger voor. Om het cryogene Dewar te monteren, installeert u eerst de platformbasis aan de onderkant van de blauwe piepschuim Dewar, zodat deze vlak en vlak is.Plaats vervolgens de ethaanvathouder bovenop de platformbasis en plaats het messing ethaanvat. Plaats ten slotte het opslagplatform voor het draaiende raster. Lokaliseer vervolgens de instortende Dewar naar de basis van de handmatige zuiger.Centreer het ethaanvat onder de duikarm en zet de onderduikende Dewar vast aan de basis. Om de handmatige storthoogte in te stellen, bevestigt u eerst verse tape aan de basis van de stortarm. Maak vervolgens een pincet vast door de tape stevig om de stortarm en de pincetbasis te wikkelen.Zorg ervoor dat het pincet stevig is bevestigd door er licht op te tikken. Houd de instortende arm vast en laat het pincet langzaam in het koperen ethaanvat zakken door het voetpedaal in te drukken. Pas de locatie van de instortende Dewar aan, zodat het pincet zich in het midden van het messing ethaanvat bevindt.De uiteinden van het pincet mogen geen contact maken met de grootte of onderkant van het messing ethaanvat om schade aan het pincet en de handmatige zuiger te voorkomen. Zodra de positie is ingesteld, reset u de handmatige stortarm. Bereid het cryogene voor.Cryogene bereiding moet worden uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen moeten te allen tijde worden gedragen. Om te beginnen, slechte vloeibare stikstof rechtstreeks in de kelderende Dewar, stoppen wanneer het vloeibare stikstofniveau de bovenkant van het messing ethaanvat bereikt. Het systeem moet koud genoeg zijn om door te gaan nadat de vloeibare stikstof stopt met hevig borrelen.Dit duurt ongeveer vijf minuten. Ethaan komt als een gecomprimeerd gas en moet worden gecondenseerd. Om de gasstroom in te stellen voor optimale ethaancondensatie, plaatst u de punt van de ethaangasleiding in een beker van 250 mil water en observeert u het borrelen.De gasstroom moet een gestage stroom bellen produceren die het wateroppervlak niet gewelddadig verstoort. Om te beginnen met het condenseren van ethaan, plaatst u de punt van de ethaangasleiding op de bodem van het messing ethaanvat. Roer langzaam de metalen punt en begin met het vloeibaar maken van het ethaan.Zodra het ethaan begint af te koelen, maakt het een hoorbaar geluid. Vul het messing ethaanvat tot driekwart vol vloeibaar ethaan. Vul de instortende Dewar af met vloeibare stikstof en zorg ervoor dat deze het koperen ethaanvat raakt maar er niet in morst.De toevoeging van vloeibare stikstof is noodzakelijk voor een uniforme ethaanbevriezing. Plaats het schuimdeksel op de blauw plunging Dewar en laat het ethaan volledig stollen. Start de ethaangasstroom opnieuw op en plaats voorzichtig de punt van de gasleiding in het vaste ethaan.Het is belangrijk om de punt verticaal in het vat te plaatsen en ethaan aan de onderkant af te geven. Roer langzaam de metalen punt om het ethaan te smelten en breng het niveau van vloeibaar ethaan naar de bovenkant van het vat. Sluit het deksel ongeveer een minuut en laat het ethaan stollen rond de randen van het messing vat totdat twee tot drie millimeter vast ethaan zichtbaar is.Het ethaan is nu op een temperatuur die ideaal is voor het invriezen van biologische monsters. Bevestig de plunging Dewar voorzichtig aan de basis van de handmatige zuiger. Bevestig een pincet door de tape stevig om de stortarm en de pincetbasis te wikkelen.Houd de inklaparm vast en laat het pincet langzaam in het vloeibare ethaan zakken door het voetpedaal in te drukken. Pas de locatie van de instortende Dewar aan zodat het pincet zich in het midden van het vloeibare ethaan bevindt, waardoor contact met de vaste ethaanring wordt vermeden. Bereid plunging materialen en accessoires voor.Bereid het vloeipapier voor door elk cirkelvormig filtreerpapier in ongeveer een centimeter brede stroken te snijden. Raak het midden van het vloeipapier niet aan en gooi de kleinere stukjes uiteinde weg. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de stroken vloeipapier droog, schoon en vrij van verontreinigingen zijn.Plaats voordat u gaat storten de rasterdozen in de instortende Dewar in de juiste sleuven. Zorg ervoor dat het rooster onze vrij te draaien afdekt. Bereid CryoEM-monsters voor door onderkoeling.Vanwege de diversiteit van raster- en netvoorbereidingen, volg de aanbevolen protocollen voor het hydrofiel maken van de netten. Om de roosters goed te hanteren, gebruikt u een schoon, droog klempincet om de hydrofiele roosters aan de buitenste ring op te pakken. Schuif de plastic klem om het rooster vast te zetten en tik zachtjes op het pincet om ervoor te zorgen dat het rooster goed wordt vastgeklemd.Breng drie microliter monster aan op de voorkant van het rooster dat in het klempincet wordt vastgehouden. Bevestig het pincet stevig aan de handmatige inklaparm door de tape om de pincetvoet te wikkelen. Het monster is nu klaar om te worden uitgeveegd en bevroren te worden gedompeld.Houd elk uiteinde van een schone strook vloeipapier tussen je wijsvingers en duimen. Laat je handen rusten op de rand van de neerstortende Dewar om een stabiele positie in te nemen. Het vloeipapier moet zich ongeveer een centimeter van het oppervlak van het rooster bevinden.Buig het vloeipapier totdat het midden in contact komt met het rooster. Het is belangrijk dat het vloeipapier evenwijdig aan het rasteroppervlak ligt om gelijkmatig contact mogelijk te maken en schade aan het net te voorkomen. Wanneer het mobiele vloeistoffront stopt met verspreiden, begint u met tellen.Dep het rooster gedurende vijf seconden. Knip je vingers uit elkaar, druk het vloeipapier en verwijder het snel van het oppervlak van het rooster. Druk tegelijkertijd op het voetpedaal om de handmatige duikarm los te laten en het pincet dat het rooster vasthoudt in het vloeibare ethaan te storten.Houd het vers bevroren rooster in het vloeibare ethaan en maak het pincet voorzichtig los van de handmatige stortarm. Klem het pincet voorzichtig los zodat het rooster afneembaar is. Verplaats het rooster in het vloeibare stikstofreservoir onder het messing ethaanvat met één snelle beweging van het ethaan naar de vloeibare stikstof.Plaats het raster in het rastervak. Representatieve resultaten. Uit deze video zouden onderzoekers cryoem-rasters moeten kunnen voorbereiden, zoals deze, met veel vierkanten die dunne films glasachtig ijs bevatten voor beeldvorming met hoge resolutie.De monsterconcentratie en de despoettijd kunnen worden aangepast om de deeltjesdichtheid te optimaliseren. Hier zullen we de volledige workflow demonstreren voor het invriezen van CryoEM-monsters met behulp van de blot- en plunge-methode. Gebruik een schoon klempincet om een nieuw rooster op te pakken en het rooster op zijn plaats te houden.Breng drie microliter monster aan op de hydrofiele kant van het rooster en bevestig een pincet op de handmatige stortarm door de tape om de pincetgreep te wikkelen. Plaats het vloeipapier parallel aan het rasteroppervlak en buig het vloeipapier voorzichtig naar het rooster om het dempen te initiëren. Beweeg na de gewenste hoeveelheid tijd het vloeipapier in een knakkende beweging weg van het rasteroppervlak terwijl u het voetpedaal indrukt om de plunging-arm los te laten, waardoor het rooster in het vloeibare ethaan wordt gedompeld.Wikkel de tape voorzichtig af van rond het pincet en de handmatige stortarm. Breng met één snelle beweging het rooster snel over van het ethaanvat naar het reservoir met vloeibare stikstof. Plaats het rooster in de roosteropslagdoos en wikkel het pincet in een Kim Wipe om te drogen; herhaal.

manual-blot-plunge-freezing-biological-specimens-for-single-particle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto's van dezelfde sectie.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Cryo elektronenmicroscopen, ofwel Scanning (SEM) of Transmission (TEM), worden op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van biologische monsters of andere materialen met een hoog watergehalte 1. Een SEM / focused ion beam (FIB) wordt gebruikt om kenmerken van belang in monsters identificeren en extract een dun, elektron-transparante lamellen overbrenging op een cryo-TEM.

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Hier laten we zien hoe het sandwich-vriesapparaat kan worden gebruikt voor het snel invriezen van biologische monsters, waaronder bacteriën, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde cellen, dierlijke en menselijke weefsels en virussen. We laten ook zien hoe u monsters kunt voorbereiden op ultradunne secties na snelvriezen.

Snelvriezen met behulp van sandwichbevriezingsapparaat voor goed ultrastructureel behoud van biologische monsters in elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.

De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

Hier beschrijven we een protocol voor het aanbrengen van een enkele monolaag grafeen op elektronenmicroscopieroosters en hoe deze voor te bereiden op gebruik bij cryoEM-structuurbepaling.

Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie

Leer de handmatige blot-and-plunge methode voor cryogene elektronenmicroscopie. Dit betrouwbare en kosteneffectieve protocol laat zien hoe je biologische monsters voorbereidt voor transmissie-elektronenmicroscopie.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Meer video's verkennen