Een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat voor zebravisembryo's

De techniek maakt het mogelijk om de functie en het bereik van signaalmoleculen tijdens embryogenese te bestuderen door ectopische signaalbronnen te transplanteren. Het vergemakkelijkt ook de efficiënte generatie van kiembaanmutanten. Het protocol kan worden toegepast op blastulastadium zebravissen en medaka embryo's, en waarschijnlijk ook op andere embryonale stadia en TDO-soorten.

Om het transplantatieapparaat te monteren, sluit u een kunstaaspunt 25 microliter gasdichte spuit aan op een micropipethouder met behulp van de kunstaasvergrendeling. Monteer het apparaat vervolgens rechtstreeks op een handmatige micromanipulator. Om het transplantatieapparaat te gebruiken, plaatst u de micromanipulator met het geassembleerde apparaat naast een stereomicroscoop.

Verwijder vervolgens de zuiger en breng de transplantatienaald in. Laat de naald in een schaal gevuld met Ringer's oplossing in een hoek van 45 graden zakken totdat de punt van de naald is ondergedompeld. Plaats de zuiger ongeveer halverwege om de oplossingen van de Ringer weg te spoelen, waardoor er slechts een klein volume water overblijft in het dunne taps toelopende deel van de naald.

Wanneer u voor de eerste keer een transplantatienaald gebruikt, bedekt u de binnenkant van de naald door het juk van een geofferd embryo op te trekken en het jukmateriaal volledig te verdrijven. Plaats vervolgens met behulp van een transplantatienaald voorzichtig het donorsembryo, plaats vervolgens de naald die orthogonaal opent naar het embryooppervlak en trek voorzichtig aan de zuiger om de cellen in de naald te trekken. Zodra het gewenste aantal cellen is binnengetrokken, stopt u de zuiging door de zuiger voorzichtig naar beneden te duwen en verwijdert u de naald uit het embryo door de naald in een korte en snelle beweging naar de zijkant te rukken.

Laat wat Ringer-oplossing aan weerszijden van de celkolom staan door de cellen te beperken tot het taps toelopende uiteinde van de naald. Verwijder eventuele resterende dooier of celresten door de zuiger langzaam op en neer te bewegen en de cellen te wassen met de oplossing van Ringer. Verplaats vervolgens de transplantatieschaal met de niet-dominante hand om de naald orthogonaal op het oppervlak van het gastheerembryo te plaatsen.

Oefen lichte druk uit op het embryo door het voorzichtig tegen de wanden te knijpen. Doorboort vervolgens met een snelle scherpe beweging de omhullende laag van het gastheerembryo en zorg ervoor dat u de dooier niet met de naald krabt. Zodra de naald binnen is, duwt u voorzichtig op de zuiger om de kolom cellen in het embryo te extruderen en trekt u de naald tegelijkertijd langzaam terug.

Voor transplantatie van geslachtscellen vult u een transplantatieschaal met de oplossing van Ringer, brengt u vervolgens de gedupeerde bol over naar embryo's in het koepelstadium in de transplantatieschaal en plaatst u de gastheer- en donorembryo's in afwisselende kolommen om de cellen van één donorembryo naar zes verschillende gastheerembryo's te transplanteren. Om de transplantatie uit te voeren, richt u de embryo's met de marge naar de transplantatienaald. Neem voor kiembaantransplantatie de broncellen uit de marge en deponeer ze op dezelfde locatie in het gastheerembryo.

Zodra de transplantatie is voltooid, laat u het embryo gedurende 30 minuten tot een uur herstellen in de oplossing van Ringer. Onderzoek vervolgens met behulp van een fluorescentie-stereomicroscoop de getransplanteerde cellen. Breng vervolgens de embryo's over in een 24-put Agarose-gecoate plaat met embryomedium die alle gastheerembryo's groepeert die cellen van dezelfde donor in dezelfde put hebben ontvangen.

Incubeer vervolgens de embryo's bij 28 graden Celsius tot de volgende dag. Breng indien nodig de donorembryo's over in gelabelde PCR-strips voor genotypering. Screen 30 uur na de bevruchting de gastheerembryo's op succesvolle kiembaantransplantaties onder een fluorescentie-stereomicroscoop.

De geslachtscellen moeten aanwezig zijn bij de groef boven de dooierverlenging. Kweek de succesvol getransplanteerde larve naar volwassen kap volgens standaard houderijomstandigheden. Bij succesvolle transplantaties ziet het embryo er normaal uit en lijkt het qua vorm en dooierhelderheid op onverharde embryo's zonder grote scheuren in het blastoderm.

Als een embryo daarentegen zichtbaar beschadigd is tijdens de transplantatie, zal het zich niet normaal ontwikkelen. Hoewel het transplantatieapparaat voornamelijk is gebruikt op zebravisembryo's in blastulastadia, kunnen de transplantatie en celuitroeiing ook worden uitgevoerd in dechorionated blastula-stadiumembryo's van de Japanse rijstvis medaka. In het specifieke geval van kiembaantransplantatie resulteert een goede transplantatie in een embryo met een lange horizontale kolom cellen direct boven de dooiermarge.

Het succes van de procedure kan echter pas na 24 tot 30 uur bevruchting worden beoordeeld wanneer de geslachtscellen in hun fluorescentie verschillen van somatische cellen. De primordiale geslachtscellen verschijnen als kleine fluorescerende bolletjes in de groef direct boven de dooierverlenging. De aanwezigheid van deze geslachtscellen op de juiste locatie duidt op een succesvolle kiembaantransplantatie.

Voorbeelden van mislukte transplantaties worden hier getoond. In het eerste voorbeeld, hoewel de geslachtscellen het gonadale mesoderm hebben bereikt, omdat het gastheerembryo ernstig misvormd is, zal het zich niet normaal ontwikkelen. In het tweede voorbeeld worden fluorescerende cellen alleen buiten de groef gedetecteerd.

Deze cellen zijn ofwel somatische cellen of geslachtscellen die niet correct kunnen migreren. En beide celtypen zullen niet bijdragen aan de kiembaan van het embryo. Het is van cruciaal belang om schade aan de getransplanteerde cellen en het gastheerembryo te voorkomen.

Cellen moeten langzaam worden opgetrokken, worden ontdaan van eventuele resterende dooier en voorzichtig worden ingebracht. Deze methode biedt een eenvoudige manier om cellen in zebravisembryo's te transplanteren en zal nuttig zijn voor het genereren van buitenbaarmoederlijke bronnen en kiembaanmutanten. Het belangrijkste voordeel van dit apparaat, het is goedkoop en is veel en gebruikt.