Name: Chemische modificatie van het tryptofaanresidu in een recombinant Ca2 +-ATPase N-domein voor het bestuderen van tryptofaan-ANS FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Leer hoe je tryptofaanresiduen in recombinant Ca²⁺-ATPase N-domeinen chemisch wijzigt met NBS om FRET tussen tryptofaan en ANS te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers eiwitinteracties te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door FAI-UASLP-subsidienummer C19-FAI-05-89.89 en CONACYT-subsidienummer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). De auteurs bedanken de technische assistentie van Julian E. Mata-Morales in video-editie.

1. Bepaling (in silico) van de ANS en SERCA N-domein interactie
<ol><li>Genereer een driedimensionale (3D) structuur van het eiwit (SERCA N-domein) door moleculaire modellering met behulp van de voorkeurs eiwitmodelleringssoftware50.</li>
	<li>Identificeer de aminozuurresiduen die de nucleotide-bindende site vormen met behulp van de voorkeursmoleculaire structuursoftware51en bepaal de aanwezigheid van Arg- en Lys-residuen35; deze zijn nodig voor ANS-binding en om de fluorescentie-intensiteit (quantum yield) te verhogen.</li>
	<li>Voer moleculaire docking uit (met behulp van de voorkeursdockingsoftware)52,53,54 om de interacties van ATP, fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (dat een covalente binding vormt met Lys515 die de nucleotide-bindende site labelt) en ANS met aminozuurresiduen in de nucleotide-bindingsplaats te bepalen ( Figuur1).</li>
	<li>Bereken de moleculaire afstand (Å) tussen Trp-residu en gebonden ANS met behulp van het meetinstrument in de gewenste software.</li>
	<li>Uitvoeren van moleculaire dynamica simulatie van ANS-N-domein complex om de stabiliteit van de interactie te bepalen52,54. Voer vervolgens de in vitro experimenten uit wanneer de stabiliteit van het complex is bevestigd.</li>
</ol>2. Expressie en zuivering van het recombinante N-domein
<ol><li>Synthetiseer het gen dat codeert voor N-domein40.</li>
	<li>Ontwerp en construeer het plasmide dat het synthetische gen bevat dat codeert voor het N-domein40.</li>
	<li>Uitdrukken en zuiveren door affiniteitschromatografie (Ni-NTA), het gemanipuleerde recombinante N-domein. Voer een SDS-PAGE uit van het gezuiverde eiwit om de zuiverheid te bepalen (Figuur 2)40.</li>
	<li>Bepaal de eiwitconcentratie door de absorptie bij λ van 280 nm te bestuderen met de N-domein extinctiecoëfficiënt (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.</li>
</ol>3. Monitor de vorming van het ANS-N-domeincomplex op basis van ANS- en N-domein fluorescentie-intensiteitsveranderingen.
<ol><li>Bereid een ANS-stamoplossing in N,N-dimethylformamide.<ol>
<li>Weeg een kleine hoeveelheid (1-5 mg) ANS af en los deze op in 1 ml van het uiteindelijke volume N, N-dimethylformamide, bijvoorbeeld 3,2 mg (10,69 mM eindconcentratie).</li>
		<li>Bereid een 100 μM ANS-waterige stamoplossing met behulp van de ANS-oplossing in N,N-dimethylformamide, voeg bijvoorbeeld 9,4 μL van de 10,69 mM ANS-oplossing toe aan 990,6 μL van 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 om een eindvolume van 1 ml te verkrijgen.</li>
		<li>Meng de oplossingen door 3 - 5 keer gedurende 15 s te vortexen. OPMERKING: Gebruik in het volgende experiment alleen de ANS-waterige stamoplossing. Bereid de ANS-waterige stamoplossing vers voordat u de experimenten start.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de NBS-stamoplossing in N,N-dimethylformamide.<ol>
<li>Weeg een kleine hoeveelheid (1-5 mg) NBS af en los deze op in 1 ml N,N-dimethylformamide, bijvoorbeeld 5,3 mg in 1 ml (29,78 mM eindconcentratie).</li>
		<li>Bereid een NBS-waterige stamoplossing van 1 mM met behulp van de NBS-oplossing in N,N-dimethylformamide, voeg bijvoorbeeld 3,36 μL van de NBS-oplossing van 29,78 mM toe aan 96,64 μL 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 om een eindvolume van 0,1 ml te verkrijgen.</li>
		<li>Meng de oplossingen door 3 - 5 keer gedurende 15 s te vortexen. OPMERKING: Bereid de NBS-waterige stamoplossing vers voordat u met de experimenten begint.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Titreer het N-domein met ANS en noteer de fluorescentiespectra door excitatie bij λ=295 nm bij 25 °C.<ol>
<li>Verkrijg de basislijn van het fluorescentiespectrum.<ol>
<li>Plaats 1 ml 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 in een fluorescentiekwartscuvette van 1 ml.</li>
			<li>Plaats de cel in de thermo-aangegeven celkamer (25 °C) van de spectrofluorometer en stel de excitatie λ in op 295 nm.</li>
			<li>Registreer het fluorescentiespectrum (305 - 550 nm). OPMERKING: Het fluorescentiespectrum van de 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0, die als blancomonster dient, wordt afgetrokken van alle verkregen fluorescentiespectra.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verkrijg het intrinsieke fluorescentiespectrum van het N-domein.<ol>
<li>Plaats 900 μL 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 in een fluorescentiekwartscuvet.</li>
			<li>Voeg 100 μL N-domein (10 μM) suspensie toe om een eindconcentratie van 1 μM N-domein te verkrijgen in een eindvolume van 1 ml.</li>
			<li>Homogeniseren voorzichtig met behulp van een micropipette 20 keer om de homogeniteit van de oplossing te garanderen. OPMERKING: Het eiwit moet vers worden gezuiverd om hoogwaardige intrinsieke fluorescentiespectra te verkrijgen, bijvoorbeeld het gezuiverde recombinante N-domein mag slechts een week na zuivering worden gebruikt.</li>
			<li>Plaats de cel in de thermo-aangegeven celkamer (25 °C) van de spectrofluorometer en stel de excitatie λ in op 295 nm.</li>
			<li>Registreer het intrinsieke fluorescentiespectrum van het N-domein (305-550 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voeg ANS toe en verkrijg het fluorescentiespectrum door excitatie bij λ=295 nm.<ol>
<li>Voeg een aliquot van 2 μL van 100 μM ANS-waterige stamoplossing toe aan het gesuspendeerde N-domein (1 μM) om een ANS-eindconcentratie van 0,2 μM te verkrijgen.</li>
			<li>Homogeniseren voorzichtig met behulp van een micropipette 20 keer om de homogeniteit van de oplossing te garanderen.</li>
			<li>Plaats de cel in de thermostabiele celkamer (25 °C) van de spectrofluorometer en stel de excitatie λ in op 295 nm.</li>
			<li>Registreer het fluorescentiespectrum (305-550 nm).</li>
			<li>Herhaal de ANS-toevoegingen en fluorescentiespectra-registratie boven 1:1 molaire relatie ANS:N-domein.</li>
			<li>Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van geschikte software.</li>
			<li>Zet alle spectra in één grafiek.</li>
			<li>Bepaal of de spectra een FRET-achtig patroon vormen. De ANS-N-domein fluorescentiespectra vormen een FRET-achtig patroon (Figuur 3A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Intrinsieke fluorescentietitratie van het N-domein door chemische modificatie van Trp met NBS.
<ol><li>Herhaal stap 3.3.1 en 3.3.2.</li>
	<li>Voeg een aliquot van 1 μL van 1 mM NBS-waterige stamoplossing toe aan het gesuspendeerde N-domein (1 μM) om een eindconcentratie van 1 μM NBS te verkrijgen.</li>
	<li>Homogeniseren voorzichtig door 20 keer een micropipette te gebruiken om de homogeniteit van de oplossing te garanderen.</li>
	<li>Plaats de cel in de thermostabiele celkamer (25 °C) van de spectrofluorometer en stel de excitatie λ in op 295 nm.</li>
	<li>Registreer het fluorescentiespectrum (305-550 nm) (figuur 3B).</li>
	<li>Herhaal de NBS-additie en fluorescentiespectraregistratie totdat minimale intrinsieke fluorescentie-uiting van het N-domein wordt waargenomen40. In het N-domein gebeurt dit meestal bij een molaire verhouding van 5-6 NBS/N-domein40. OPMERKING: NBS dooft snel (<5 s) de intrinsieke fluorescentie van het N-domein; een afname van de fluorescentie-intensiteit wordt waargenomen. Ga onmiddellijk door naar de volgende stap, omdat NBS ook kan reageren met andere aminozuurresiduen47.</li>
	<li>Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van geschikte software.</li>
	<li>Zet alle spectra in één grafiek uit (Figuur 3B).</li>
</ol>5. Titreer het NBS-gemodificeerde N-domein met ANS door fluorescentiespectra bij 25 °C te registreren.
<ol><li>Voer stap 3.3.3 uit met het door NBS gewijzigde N-domein dat is gegenereerd in stap 4.</li>
	<li>Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van geschikte software.</li>
	<li>Zet alle spectra in één grafiek uit (Figuur 3C).</li>
	<li>De gegenereerde fluorescentiespectra (figuur 3C) ondersteunen of weerleggen het optreden van FRET, d.w.z. wanneer FRET optreedt, neemt de ANS-fluorescentie niet toe en vice versa.</li>
</ol>6. Bewijs van ANS-binding aan het chemisch gemodificeerde N-domein door excitatie bij λ=370 nm.
<ol><li>Voer stap 3.3.3 uit met behulp van het nbs-gewijzigde N-domein dat is gegenereerd in stap 4, maar wijzig de excitatie λ in 370 nm.</li>
	<li>Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van geschikte software.</li>
	<li>Zet alle spectra in één grafiek uit (Figuur 3D).</li>
	<li>Bevestig de ANS-binding aan het N-domein door de toename van de ANS-fluorescentie-intensiteit te observeren. ANS-binding aan het N-domein toont een fluorescentietoename bij aantname bij λ=370 nm (Figuur 3D). Ter controle werd het fluorescentiespectrum van ANS (alleen) in 50 mM fosfaatbuffer met pH 8,0 opwindend verkregen bij λ van 295 en 370 nm(figuur 4, niet weergegeven in video). OPMERKING: De stoichiometrische relatie van NBS:Trp die nodig is voor chemische modificatie is afhankelijk van de mate van begraven van de Trp-residu(en) in het onderzochte eiwit46,47,55,56. Daarom wordt aanbevolen om vooraf de NBS:eiwit/(Trp) molaire verhouding te bepalen.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Fluorescentiespectra van het ANS-N-domeincomplex vertonen een FRET-achtig patroon wanneer ze worden geëxtteerd bij een λ van 295 nm, terwijl de moleculaire afstand (20 Å) tussen het Trp-residu en ANS het optreden van FRET lijkt te ondersteunen (figuur 1). Trp chemische modificatie door NBS resulteert in een minder fluorescerend N-domein (Figuur 3B, Spectrum f); daarom is energieoverdracht niet mogelijk. De ANS-fluorescentiespectra zijn vergelijkbaar met die van ...

Föster resonantie energieoverdracht (FRET) is een standaardtechniek geworden voor het bepalen van de afstand tussen moleculaire structuren na binding of interactie in eiwitstructuur en functiestudies1,2,3,4. In P-type ATPases is FRET gebruikt om de structuur en functie van het sarco-endoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8te onderzoeken, bijvoorbeeld structurele fluctuaties tijdens de katalytische cyclus zijn geanalyseerd in het hele eiwit door FRET7.
FRET-donoren zijn divers en variëren van kleine fluorescerende (extrinsieke) moleculen tot fluorescerende eiwitten9,10. Tryptofaan (Trp) residuen (vanwege hun fluorescentie) zijn nuttig voor het identificeren van structurele veranderingen in eiwit aminozuursequenties11,12. De fluorescentie-intensiteit van Trp hangt sterk af van de polariteit van zijn omgeving13,14. Ligandbinding genereert meestal structurele herschikkingen in eiwitten /enzymen15,16. Indien Trp aanwezig is op of zich dicht bij de eiwitbindende plaats bevindt, hebben structurele fluctuaties vaak invloed op de mate van blootstelling van Trp aan waterige media13,14; de verandering in polariteit resulteert dus in het doven van de Trp-fluorescentie-intensiteit13,14. Daarom is de fluorescerende eigenschap van Trp nuttig voor het uitvoeren van ligandbindende studies voor enzymen. Andere fysische verschijnselen kunnen ook leiden tot Trp-fluorescentie die17,18,19,20dooft, bijvoorbeeld FRET en veranderingen in mediumpolariteit. Energieoverdracht van de aangeslagen toestand van Trp naar een fluorofoor heeft ook potentiële toepassingen, bijvoorbeeld affiniteitsbepaling van kleine liganden in eiwitten21. Trp is inderdaad voornamelijk gebruikt als fluorescentiedonor in FRET-studies in eiwitten22,23,24,bijvoorbeeld in terbium (Tb3+) FRET-studies wordt een Trp-residu vaak gebruikt als antenne voor energieoverdracht naar Tb3+25,26,27. Trp vertoont verschillende voordelen ten opzichte van andere FRET-donoren vanwege het inherente constitutieve karakter in de eiwitstructuur, waardoor de noodzaak voor preparatieve processen die de functie / structuur van het bestudeerde eiwit kunnen beïnvloeden, wordt weggestemd24. De identificatie van stralingsverval (energieoverdracht en veranderingen in de mediumpolariteit die worden geïnduceerd door eiwit structurele herschikkingen) is dus belangrijk voor het trekken van nauwkeurige conclusies met betrekking tot ligandbinding in eiwitconstructiestudies13,14,19,28.
In eiwit structurele studies, een extrinsieke fluorofoor, namelijk, 8-anilino-1-naftaleensulfonaat (ANS), is voornamelijk gebruikt in experimenten met betrekking tot eiwitvouwing / ontvouwen28,29. ANS bindt aan eiwitten/enzymen in de oorspronkelijke toestand, meestal op de bindingsplaatsen van substraten31,32,33; een toename van de ANS-fluorescentie kwantumopbrengst (ΦF) (namelijk een toename van de fluorescentie-intensiteit) wordt geïnduceerd door het eiwit te excitingn bij λ = 370 nm wanneer geschikte interacties van ANS met Arg en zijn residuen in hydrofobe pockets optreden34,35,36,37. In verschillende studies is het voorkomen van FRET (bij opwinding bij λ binnen 280-295 nm) tussen Trp-residuen (donoren) en ANS (acceptor) gemeld, wat gebaseerd is op het volgende: 1) overlap van het fluorescentie-emissiespectrum van Trp en excitatiespectrum van ANS, 2) identificatie van een geschikte afstand tussen een of meer Trp-residu('s) en ANS voor energieoverdracht, 3) hoge ANS-kwantumopbrengst bij gebonden in eiwitzakken, en 4) karakteristiek FRET-patroon in de fluorescentiespectra van het eiwit in aanwezigheid van ANS3,17,27,37,38.
Onlangs is ligandbinding aan het nucleotide-bindende domein (N-domein) in SERCA en andere P-type ATPasen onderzocht met behulp van engineered recombinantN-domeinen 40,41,42,43,44,45,46. Moleculaire engineering van het SERCA N-domein is gebruikt om het enige Trp-residu (Trp552Leu) te verplaatsen naar een meer dynamische structuur (Tyr587Trp) die dicht bij de nucleotide-bindingsplaats ligt, waar fluorescentievariaties (blussen) kunnen worden gebruikt om structurele veranderingen bij ligandbinding te volgen34. Experimentele resultaten hebben aangetoond dat ANS bindt (als ATP) aan de nucleotide-bindingsplaats in het gezuiverde recombinante SERCA N-domein34. Interessant is dat de ANS-fluorescentie toeneemt bij binding aan het N-domein bij excitatie bij een λ van 295 nm, terwijl de intrinsieke fluorescentie van het N-domeinafneemt 34, waardoor een FRET-patroon ontstaat dat de vorming van een Trp-ANS FRET-paar suggereert.
Het gebruik van NBS is voorgesteld om het gehalte aan Trp-residuen in eiwitten47 te bepalen door middel van absorptietest van gemodificeerde eiwitten. NBS wijzigt de sterk absorberende indoolgroep van Trp naar de minder absorberende oxindole47,48. Dit resulteert in het verlies (doven) van de Trp fluorescerende eigenschap40. Daarom kan NBS-gemedieerde chemische modificatie van Trp-residuen worden gebruikt als een test om de rol van Trp (als donor) te definiëren wanneer FRET wordt verondersteld.
Dit protocol beschrijft de chemische modificatie van het enige Trp-residu door NBS in het engineered recombinant N-domein van SERCA als eiwitmodel. Experimentele resultaten tonen aan dat de ANS-fluorescentie-intensiteit nog steeds toeneemt in het chemisch NBS-gemodificeerde N-domein34, dat intrinsieke fluorescentie mist. Daarom is de test nuttig om de afwezigheid van FRET tussen het Trp-residu en ANS aan te tonen wanneer deze gebonden is aan het N-domein34,40,49. Vandaar dat deze test (NBS chemische modificatie van Trp) nuttig is bij het bewijzen van de aanwezigheid van het Trp-ANS FRET-paar in eiwitten.

```html
<table>
<tbody>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610107</td>
<td>SDS-PAGE</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammoniumpersulfaat</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610700</td>
<td>SDS-PAGE</td>
</tr>
<tr>
<td>8-Anilino-1-naftaleensulfonzuur</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A1028</td>
<td>Fluorofoor</td>
</tr>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610125</td>
<td>SDS-PAGE</td>
</tr>
<tr>
<td>N-Bromosuccinimide</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B81255</td>
<td>Chemische modificatie</td>
</tr>
<tr>
<td>N,N-dimethylformamide</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>9213-12</td>
<td>Stockoplossingvoorbereiding</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluoresceïne-isothiocyanaat</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F7250</td>
<td>Chemische fluorescentielabel</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescentiecuvet</td>
<td>Hellma</td>
<td>Z801291</td>
<td>Fluorescentietest</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescentiespectrofluorometer</td>
<td>Shimadzu</td>
<td>RF 5301PC</td>
<td>Fluorescentietest</td>
</tr>
<tr>
<td>HisTrap® FF</td>
<td>GE Healtcare</td>
<td>11-0004-59</td>
<td>Eiwitzuivering</td>
</tr>
<tr>
<td>IPTG, vrij van dioxaan</td>
<td>American Bionalytical</td>
<td>AB00841-00010</td>
<td>Eiwitexpressie</td>
</tr>
<tr>
<td>Imidazool</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5513-25G</td>
<td>Eiwitzuivering</td>
</tr>
<tr>
<td>LB-medium</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>10000713</td>
<td>Celcultuur</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipetman L P10L</td>
<td>Gilson</td>
<td>FA10002M</td>
<td>Fluorescentietest</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipetman L P100L</td>
<td>Gilson</td>
<td>FA10004M</td>
<td>Fluorescentietest</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipetman L P200L</td>
<td>Gilson</td>
<td>FA10005M</td>
<td>Fluorescentietest</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipetman L P1000L</td>
<td>Gilson</td>
<td>FA10006M</td>
<td>Fluorescentietest</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipetman L P5000L</td>
<td>Gilson</td>
<td>FA10007</td>
<td>Fluorescentietest</td>
</tr>
<tr>
<td>Precision plus std</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610374</td>
<td>SDS-PAGE</td>
</tr>
<tr>
<td>Natriumdodecylsulfaat</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610302</td>
<td>SDS-PAGE</td>
</tr>
<tr>
<td>Natriumfosfaat dibasisch</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>3828-19</td>
<td>Buffervoorbereiding</td>
</tr>
<tr>
<td>Natriumfosfaat monobasisch</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>3818-01</td>
<td>Buffervoorbereiding</td>
</tr>
<tr>
<td>Spuitfilter 0,2 µm</td>
<td>Millipore</td>
<td>GVWP04700</td>
<td>Oplossingsfiltratie</td>
</tr>
<tr>
<td>Temed</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610801</td>
<td>SDS-PAGE</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610719</td>
<td>SDS-PAGE</td>
</tr>
</tbody>
</table>
```

chemische modificatie van het tryptofaanresidu in een recombinant ca2 +-atpase n-domein voor het bestuderen van tryptofaan-ans fret

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

Het sarco/endoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is een P-type ATPase dat in verschillende conformaties is gekristalliseerd. Gedetailleerde functionele informatie kan niettemin worden verkregen uit geïsoleerde recombinante domeinen. Het engineered (Trp552Leu en Tyr587Trp) recombinant nucleotide-binding domein (N-domein) geeft fluorescentie doven bij ligandbinding weer. Een extrinsieke fluorofoor, namelijk 8-anilino-1-naftaleensulfonaat (ANS), bindt aan de nucleotide-bindingsplaats via elektrostatische en hydrofobe interacties met Arg,His, Ala, Leu en Phe residuen. ANS-binding blijkt uit de toename van de fluorescentie-intensiteit bij aangeslagen bij een golflengte (λ) van 370 nm. Bij een geëxt excitedie bij λ van 295 nm lijkt de toename van de fluorescentie-intensiteit echter gekoppeld te zijn aan het uitdoven van de intrinsieke fluorescentie van het N-domein. Fluorescentiespectra vertonen een Föster resonantie energieoverdracht (FRET)-achtig patroon, wat de aanwezigheid van een Trp-ANS FRET-paar suggereert, dat lijkt te worden ondersteund door de korte afstand (~ 20 Å) tussen Tyr587Trp en ANS. Deze studie beschrijft een analyse van het Trp-ANS FRET-paar door Trp chemische modificatie (en fluorescentie doven) die wordt gemedieerd door N-bromosuccinimide (NBS). In het chemisch gemodificeerde N-domein nam de ANS-fluorescentie toe bij een λ van 295 nm, vergelijkbaar met bij een λ van 370 nm. Daarom kan de NBS-gemedieerde chemische modificatie van het Trp-residu worden gebruikt om de afwezigheid van FRET tussen Trp en ANS te onderzoeken. Bij afwezigheid van Trp-fluorescentie mag men geen toename van ANS-fluorescentie waarnemen. De chemische modificatie van Trp-residuen in eiwitten door NBS kan nuttig zijn voor het onderzoeken van FRET tussen Trp-residuen die dicht bij de gebonden ANS liggen. Deze test zal waarschijnlijk ook nuttig zijn bij het gebruik van andere fluoroforen.

Moleculaire docking toont de binding van ANS aan de nucleotide-bindingsplaats van het N-domein via elektrostatische en hydrofobe interacties (Figuur 1). Moleculaire afstand (20 Å) tussen het Trp-residu en ANS (gebonden aan de nucleotide-bindingsplaats) ondersteunt het optreden van FRET(figuur 1). Het ontworpen (engineered) recombinante N-domein werd bij hoge zuiverheid verkregen door affiniteitschromatografie (figuur 2) en was gesch...

ANS bindt aan het Ca2+-ATPase recombinant N-domein. Fluorescentiespectra vertonen een FRET-achtig patroon bij excitatie bij een golflengte van 295 nm. NBS-gemedieerde chemische modificatie van Trp dooft de fluorescentie van het N-domein, wat leidt tot de afwezigheid van energieoverdracht (FRET) tussen het Trp-residu en ANS.

Chemische modificatie van het tryptofaanresidu in een recombinant Ca2 +-ATPase N-domein voor het bestuderen van tryptofaan-ANS FRET

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

Deze testen kunnen helpen om de rol van tryptofaanresiduen in eiwitten te verduidelijken bij het uitvoeren van ANS-bindende studies. De ANS-fluorescentie neemt toe bij binding aan specifieke structurele locaties in eiwitten. Soms lokaliseert ANS-bindingsplaats dicht bij een tryptofaanresidu met een afstand die het bestaan van FRET tussen het tryptofaan en ANS suggereert.NBS bemiddelt chemische modificatie van tryptofaanresiduen in eiwitten, waardoor de fluorescentie wordt geblust. Daarom kunnen deze testen bepalen of tryptofaanresiduen bijdragen aan de toename van ans-fluorescentie-intensiteit door FRET. In dit werk gebruiken we een gemanipuleerd recombinant nucleotide bindingsdomein van SERCA met mutaties, met als doel een tryptofaan dicht bij de nucleotidebindingsplaats te lokaliseren waar ANS ook bindt.Deze test is snel en gemakkelijk uit te voeren, vandaar het belangrijkste voordeel. Bepaling in silico van de ANS en SERCA N-Domein interactie. Genereer een driedimensionale structuur van het eiwit door moleculaire modellering met behulp van de voorkeurs-eiwitmodelleringssoftware.Identificeer de aminozuurresiduen die de nucleotidebindingsplaats vormen met behulp van de gewenste moleculaire structurele software en bepaal de aanwezigheid van arginine- en lysineresiduen. Deze zijn nodig voor ANS-binding en verhogen de fluorescentie-intensiteit. Vanwege de aanwezigheid van arginine- en lysineresiduen in de nucleotidebindingsplaats van SERCA, veronderstellen we de binding van ANS aan het N-domein.In het 3D-model worden de aminozuurresiduen die de ATP-bindingsplaats vormen, geïdentificeerd en oranje gemarkeerd. Evenzo bevindt de tyrosine-naar-tryptofaanmutatie zich en wordt blauw gemarkeerd. Voer moleculaire docking uit met ATP, FITC en ANS.Dockingresultaten laten zien dat ANS goed past op de nucleotidebindingsplaats, vergelijkbaar met ATP en FITC. FITC labelt de nucleotidebindingsplaats. Bereken de moleculaire afstand tussen het tryptofaanresidu en ANS.20 angstroms lijkt een gepaste afstand voor FRET. Voer moleculaire dynamische simulatie uit van het ANS N-Domein complex om de stabiliteit van de interactie te bepalen. Een simulatietijd van 10 nanoseconden toont de stabiliteit van het complex.Ga verder met het uitvoeren van de in vitro experimenten. Expressie en zuivering van het recombinante N-Domein. Druk uit en zuiver, door affiniteitschromatografie, het gemanipuleerde recombinante N-domein.Voer een SDS-PAGE uit van het gezuiverde eiwit om de zuiverheid te bepalen. Bepaal de eiwitconcentratie door absorptie bij een golflengte van 280 nanometer met de N-Domein extinctiecoëfficiënt. Monitor de vorming van het ANS N-Domein complex op basis van ANS en N-Domein fluorescentie intensiteit veranderingen.Bereid een ANS-stamoplossing in N, N-dimethylformamide. Weeg een kleine hoeveelheid ANS, tussen één en vijf milligram. Los ANS op in één ml eindvolume N, N-dimethylformamide.Bereid een 100 micromolaire ANS-stamoplossing met behulp van de ANS-oplossing in N, N-dimethylformamide. Meng de oplossing door drie tot vijf keer te vortexen. Bereid de NBS-stamoplossing in N, N-dimethylformamide.Weeg een kleine hoeveelheid NBS, één tot vijf milligram. Los de NBS op in één ml N, N-dimethylformamide. Bereid een één millimolaire NBS-stamoplossing met behulp van de NBS-oplossing in N, N-dimethylformamide.Meng de oplossing door drie tot vijf keer te vortexen. Titreer het N-domein met ANS en registreer de fluorescentiespectra voor excitatie bij een golflengte van 295 nanometer bij 25 graden. Verkrijg de basislijn van het fluorescentiespectrum.Plaats een ml van 50 millimolar fosfaatbuffer met pH acht in een fluorescentiekwartscuvet van één ml. Plaats de cel in de thermostatische celkamer van de spectrofotometer en stel de excitatiegolflengte in op 295 nanometer. Noteer het fluorescentiespectrum.Het fluorescentiespectrum van de blanco toont de piek van water, die later moet worden afgetrokken. Verkrijg het intrinsieke fluorescentiespectrum van het N-domein. Plaats 900 microliter 50 millimolaire fosfaatbuffer met pH 8 in een fluorescentiekwartscuvet.Voeg 100 microliter N-domein suspensie toe om een eindconcentratie van één micromolair N-domein te krijgen. Homogeniseren voorzichtig met behulp van een micropipette om de homogeniteit van de oplossing te garanderen. Plaats de cel in de thermostaatkamer van de spectrofotometer.Stel de excitatiegolflengte in op 295 nanometer. Registreer het intrinsieke fluorescentiespectrum van het N-domein. Voeg ANS toe en verkrijg het fluorescentiespectrum door excitatie bij een golflengte van 295 nanometer.Voeg een aliquot van twee microliter van 100 micromolaire ANS-voorraadoplossing toe aan het gesuspendeerde N-domein om een eindconcentratie van 0,2 micromolaire ANS te verkrijgen. Homogeniseren voorzichtig, met behulp van een micropipette om de homogeniteit van deze oplossing te garanderen. Noteer het fluorescentiespectrum.Herhaal de ANS-toevoegingen en fluorescentiespectrale registratie zoals hierboven beschreven voor een 1:1 ANS N-Domein molaire relatie. Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van software. Zet alle spectra in één grafiek uit Bepaal of er een FRET-achtig patroon wordt gevormd door het spectrum.De ANS N-Domein fluorescentiespectra vormen een FRET-achtig patroon. N-Domein intrinsieke florescence titratie door tryptofaan chemische modificatie met NBS. Verkrijg opnieuw het intrinsieke fluorescentiespectrum van het N-Domein.Voeg een aliquot van één microliter van één millimolaire NBS-stamoplossing toe aan het gesuspendeerde N-domein om een uiteindelijke concentratie van één micromolaire NBS te verkrijgen. Homogeniseren voorzichtig met behulp van een micropipette om de homogeniteit van de oplossing te garanderen. Noteer het fluorescentiespectrum.Herhaal de NBS-additie en fluorescentie spectrale registratie totdat minimale N-Domein intrinsieke fluorescentie doven wordt waargenomen. Homogeniseren voorzichtig met behulp van een micropipette om de homogeniteit van de oplossing te garanderen. Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van software.Zet alle spectra in één grafiek. Titreer het NBS gemodificeerde N-domein met ANS door fluorescentiespectra bij 25 graden te registreren. Voeg ANS toe en verkrijg het fluorescentiespectrum door excitatie bij een golflengte van 295 nanometer.Homogeniseren voorzichtig met behulp van een micropipette om de homogeniteit van de oplossing te garanderen. Noteer het fluorescentiespectrum. Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van software.Zet alle spectra in één grafiek. De gegenereerde fluorescentiespectra ondersteunen of weerleggen het optreden van FRET. Namelijk wanneer FRET optreedt, neemt de ANS-fluorescentie niet toe en vice versa.Bewijs van ANS binding aan het chemisch gemodificeerde N-domein door excitatie bij een golflengte van 370 nanometer. Voeg ANS toe aan het NBS gemodificeerde N-Domein en noteer het N-Domein intrinsieke fluorescentiespectrum door excitatie op een golflengte van 370 nanometer. Trek het lege spectrum van elk spectrum af met behulp van software.Zet alle spectra in één grafiek. Bevestig de ANS-binding aan het N-domein door de toenemende ANS-fluorescentie-intensiteit. ANS-binding aan het N-domein vertoont een fluorescentietoename bij aantname bij een golflengte van 370 nanometer.Resultaten overzicht. Panel A.ANS N-Domain complex vertoont een FRET-achtig patroon bij spannendheid bij een golflengte van 295 nanometer. Panel B.NBS dooft de intrinsieke fluorescentie van het N-domein door het enige tryptofaanresidu in het chemisch gemodificeerde N-domein chemisch te modificeren.Paneel C.De ANS-fluorescentie neemt toe bij spanning bij een golflengte van 295 nanometer. Paneel D.De ANS-fluorescentie neemt ook toe bij een golflengte van 370 nanometer. Daarom is directe excitatie van ANS bij een golflengte van 295 nanometer de belangrijkste bron van ANS-fluorescentie wanneer deze gebonden is aan de ATP-bindingsplaats. Conclusies.Deze testen kunnen worden gebruikt om het bestaan van FRET tussen tryptofaanresiduen en ANS in eiwitten te bepalen. De verduidelijking van FRET, bevestiging of niet, tussen tryptofaan en ANS zal het mogelijk maken om betere conclusies te trekken in eiwit structurele studies. De test kan ook nuttig zijn bij het gebruik van andere fluoroforen.

chemical-modification-tryptophan-residue-recombinant-ca2-atpase-n

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Een gebruiksvriendelijk, celvrij expressieprotocol voor de residurespecifieke incorporatie van niet-canonieke aminozuuranalogen in eiwitten, inclusief downstream-analyse, wordt gepresenteerd voor medisch, farmaceutisch, structureel en functioneel onderzoek.

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transcriptie-vertaalsysteem

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Biochemische en structurele analyses van geglycosyleerde eiwitten vereist relatief grote hoeveelheden van homogene monsters. Hier presenteren we een efficiënte chemische methode voor site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten gezuiverd van bacteriën door zich te richten van reactieve Cys thiolen.

Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Synthetische biologie waardoor de engineering van eiwitten met ongekende eigenschappen met behulp van het co-translational inbrengen van niet-canonieke aminozuren. Hier, presenteerden we hoe een spectraal rood-verschoven variant van een GFP-type fluorophore met roman fluorescentie spectroscopische eigenschappen, genoemd "goud" fluorescent proteïne (GdFP), wordt geproduceerd in E. coli via selectieve druk opneming (SPI).

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Dit artikel presenteert een reeks opeenvolgende methoden voor de expressie en zuivering van Salmonella typhimurium tryptofaan synthase comp dit protocol een snel systeem om het eiwitcomplex in een dag te zuiveren. Behandelde methoden zijn site-gerichte mutagenese, eiwitexpressie in Escherichia coli,affiniteitschromatografie, gelfiltratiechromatografie en kristallisatie.

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Om de beperkingen van klassieke site-directed mutagenese te overwinnen, werden proline analogen met specifieke modificaties opgenomen in verschillende fluorescerende eiwitten. We laten zien hoe de vervanging van waterstof door fluor of van de enkele door dubbele bindingen in prolineresiduen ("moleculaire chirurgie") fundamentele eiwiteigenschappen beïnvloedt, inclusief hun vouwing en interactie met licht.

Residu-specifieke uitwisseling van Proline door Proline-analogen in fluorescerende eiwitten: hoe "moleculaire chirurgie" van de ruggengraat de vouwing en stabiliteit beïnvloedt

Functionele site-directed fluorometrie is een methode om eiwitdomeinbewegingen in realtime te bestuderen. Modificatie van deze techniek voor de toepassing ervan in native cellen maakt nu de detectie en tracking mogelijk van bewegingen van enkele spanningssensor van spanningsafhankelijke Ca2 + -kanalen in murine geïsoleerde skeletspiervezels.

Functionele site-directed fluorometrie in inheemse cellen om de prikkelbaarheid van skeletspieren te bestuderen

De functies van dynamine-superfamilie-eiwitten zijn afhankelijk van conformationele veranderingen in combinatie met GTP-hydrolyse. Een systeem wordt beschreven met behulp van de single-molecule FRET (smFRET) -techniek om de conformationele dynamiek van dynamin-achtig GTPase-atlastine in verschillende nucleotide-ladende toestanden te volgen.

Single-molecule FRET-beeldvorming voor het observeren van de conformationele dynamiek van dynamin-achtig GTPase-atlastine

Dit protocol beschrijft een verbeterde SERCA-zuiveringsmethode, waarbij het disacharide trehalose in de laatste centrifugatiestap wordt opgenomen. Dit koolhydraat stabiliseert eiwitten onder zware omstandigheden. De gezuiverde SERCA was katalytisch actief en vertoonde een hoge zuiverheid, waardoor het geschikt was voor structurele en functionele studies.

Zuivering van het sarco-endoplasmatisch reticulum ca2+-ATPase uit de spier van konijnen

Leer hoe je tryptofaanresiduen in recombinant Ca²⁺-ATPase N-domeinen chemisch wijzigt met NBS om FRET tussen tryptofaan en ANS te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers eiwitinteracties te analyseren.

Chemische modificatie van het tryptofaanresidu in een recombinant Ca2 +-ATPase N-domein voor het bestuderen van tryptofaan-ANS FRET (Video) | JoVE Journal

Chemische modificatie van het tryptofaanresidu in een recombinant Ca^{2 +}-ATPase N-domein voor het bestuderen van tryptofaan-ANS FRET

Meer video's verkennen