Een high throughput microplate feeder assay voor kwantificering van consumptie in Drosophila
14 juni 2021
De microplate feeder assay biedt een economische, hoge doorvoermethode voor het kwantificeren van vloeibare voedselconsumptie in Drosophila. Een 3D-geprint apparaat verbindt een 96-well microplaat waarin vliegen zijn gehuisvest met een 1536-well microplaat waaruit vliegen een voedingsoplossing met een tracerkleurstof consumeren. De volumedaling van de oplossing wordt spectrofotometrisch gemeten.
De microplate feeder assay biedt een eenvoudige, high-throughput, economische methode om Drosophila voedingsgedrag te meten, en het biedt meerdere voordelen ten opzichte van andere, meer uitgebreide methoden. Het kwantificeren van het verbruik door de absorptie te meten met een plaatlezer elimineert handmatige metingen en voorkomt handmatige gegevensinvoer. Gegevens zijn ook vatbaar voor programmatische extractie en verwerking.
Met deze high-throughput assay kunnen we het verbruik van in water oplosbare voedingsstoffen, medicijnen, farmaceutische producten of toxines kwantificeren en kan het systeem worden aangepast voor toepassingen op een verscheidenheid aan insectensoorten. Begin met het gieten van de gesmolten agarose in een reagenstrog en dispenseer 80 microliter gesmolten agarose in elke put van een 96-well microplaat met behulp van een meerkanaals pipet. Koel de overgebleven agarose tot een week in een afgesloten zak en bewaar het voor het maken van extra borden.
Als de barrièrestrips te los zijn, rol ze dan rond de vinger om ze kromming te geven om ze in de kanalen te houden. Steek de barrièrestroken in de barrièrestrookkanalen om de koppelingen voor te bereiden. Bevestig de koppeling aan een verhongeringsplaat en zorg ervoor dat u de koppeling niet gebruikt om de plaat te manipuleren, omdat de koppeling eraf kan glijden.
Zorg ervoor dat de schuine hoek van de koppeling overeenkomt met de schuine hoek van de microplaat om de juiste oriëntatie te behouden. Sorteer onder CO2-anesthesie drie tot vijf dagen oude vliegen. Laad individuele vliegen per kolom in de hongerplaat.
Sluit elke kolom terwijl deze zich vult door de barrièrestrook aan te passen aan de gesloten positie. Noteer zorgvuldig de monsterlay-out in de microplaat. Zodra de hongerplaat is gevuld, laat u de vliegen spontaan herstellen na het verwijderen van de CO2 en hongert u ze zes uur uit vanaf hun eerste verdovingstijd.
Bereid 10 milliliter vloeibaar voedsel in een conische buis van 15 milliliter door 0,4 gram sucrose en 0,1 gram gistextract op te lossen in 10 milliliter gedestilleerd water. Vortex de buis totdat de vaste stoffen volledig zijn opgelost. Voeg 40 microliter verfmiddeloplossing toe en breng het vloeibare voedsel over in een spuit van 10 milliliter met een filter van 0,45 micrometer.
Filtreer ongeveer 1,5 milliliter van de oplossing per keer in een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Zet de spuit met de oplossing apart en filter de extra oplossing indien nodig tijdens de bereiding van de invoerplaat. Bereid een invoerplaat voor door de bodem van een microplaat met 1536 putten af te dichten met een afdichtfolie.
Gebruik een afdichtingspeddel om de film grondig te hechten. Knip vervolgens overtollige film van de linker- en rechterrand af met een scheermesje. Dispense 10 microliter van het gefilterde vloeibare voedsel kolomgewijs in de linkerbovenhoekput voor elk cluster van vier putten van de 1536-well microplaat.
Zodra alle putten zijn gevuld, brengt u een afdichtingsfolie aan op de bovenkant van de plaat, volgens dezelfde stappen die worden gebruikt om de onderkant van de microplaat af te dichten. Herhaal dit voor het gewenste aantal platen. Centrifugeer de platen gedurende 10 seconden op 200 maal G om de vloeistof te laten bezinken.
Laat de plaat niet koelen, omdat dit condensatie in de putten kan veroorzaken, waardoor absorptiemetingen worden verduisterd. Perforeer de putjes op het bovenoppervlak van de plaat met het naaldsondegereedschap uitgerust met een naald met een diameter van 0,25 millimeter, waarbij dezelfde volgorde wordt gebruikt om te perforeren als werd gebruikt bij het doseren van de oplossingen. Veeg de naald tussen de oplossingen af om kruisbesmetting te voorkomen.
Draai de plaat om en perforeer de putjes aan de onderkant. Lees de absorptie van de plaat op 630 nanometer zonder deksel. Plaats een binnendeksel op de bovenste afdichtingsfolie om ervoor te zorgen dat de condensatieringen de geperforeerde putten omringen en plaats vervolgens het externe deksel op de plaat.
Plaats de invoerplaat met de voorkant naar boven op de koppeling, zodat de geleiders de juiste gaten van de invoerplaat en de uithongeringsplaat uitlijnen. Zorg ervoor dat de koppeling en platen correct zijn georiënteerd. Zodra alle invoerplaten op de koppelingen zijn geladen, opent u de putten voor de platen door de barrièrestroken op de koppeling aan te passen.
Plaats de koppeling en plaatassemblages in de secundaire container. Plaats de onderste helft van een pipetdoos met geweekte papieren handdoeken in elke secundaire container om vocht te bieden. Sluit het deksel van de secundaire container en breng deze over naar een gecontroleerde omgeving.
Laat de vliegen 22 uur consumeren. Controleer na de 22 uur blootstelling elke plaat op dode vliegen en werk de lay-out van de plaat dienovereenkomstig bij. Nadat alle platen zijn gecontroleerd, verdooft u de vliegen massaal door CO2 in de secundaire container te pompen.
Zorg er na ongeveer 60 seconden voor dat alle vliegen zijn geïmmobiliseerd. Tik de vliegen voorzichtig in de uithongerplaat en vervang de plastic barrièrestrips. Verwijder de invoerplaten om af te lezen.
Herlees de absorptie van de plaat op 630 nanometer. Herhaal het proces totdat alle platen zijn gelezen. Verdamping werd gekwantificeerd voor elke put en bleek te bepalen of er correlaties bestaan tussen de putten van individuele platen.
Pearson correlatiecoëfficiënten voor verdamping versus rijen en verdamping versus kolommen werden berekend om trends tussen verdamping en putlocaties te evalueren. Het verbruik van drie tot vijf dagen oude Canton-SB-vliegen werd gekwantificeerd om de geldigheid van het protocol vast te stellen. Vliegen kregen de keuze tussen een 4%sucrose-oplossing met 1%gistextract en een 4%sucrose-oplossing aangevuld met 15%ethanol en 1%gistextract.
Zowel mannen als vrouwen vertoonden een overweldigende voorkeur voor de oplossing met ethanol en gistextract. Het is essentieel om consistentie te behouden bij het construeren van de feederplaten, zodat elke vlieg een identiek consumptiescenario krijgt met betrekking tot voedselvolume, verdamping en toegang. Deze techniek stelt onderzoekers in het Drosophila-veld in staat om high-throughput assays uit te voeren voor consumptie en voorkeursgedrag met een hogere doorvoer en tegen lagere kosten in vergelijking met traditionele methoden.
Overzicht
De microplate-voedingsassay biedt een methode met een hoge doorvoersnelheid voor het kwantificeren van het voedingsgedrag van Drosophila. Deze economische aanpak maakt gebruik van een 3D-geprint apparaat om microplates te verbinden, waardoor de consumptie van vloeibaar voedsel efficiënt kan worden gemeten.
Belangrijkste Onderdeelenvon Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Entomologie
Achtergrond
- Het meten van het voedingsgedrag bij Drosophila is essentieel voor het begrijpen van nutritionele voorkeuren.
- Traditionele methoden kunnen arbeidsintensief en minder efficiënt zijn.
- De microplate-voederassay stroomlijnt dit proces.
- Maakt gebruik van spectrophotometrische metingen voor de gegevensverzameling.
Doel van de studie
- Om een high-throughput methode te ontwikkelen voor het beoordelen van de voedselconsumptie bij Drosophila.
- Om de kwantificering van diverse voedingsstoffen en stoffen te vergemakkelijken.
- Om de efficiëntie van studies naar voedingsgedrag te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van agarose en microplaten voor voedingsassays.
- Sorteren en anesthetiseren van vliegen voor gecontroleerde voedingsexperimenten.
- Meting van de absorbantie om de voedselconsumptie te kwantificeren.
- Analyseren van gegevens op trends in voedingsgedrag en voorkeuren.
Belangrijkste resultaten
- Vliegen vertoonden een voorkeur voor voedsel dat ethanol en gistextract bevatte.
- De gegevensverzameling werd gestroomlijnd door middel van geautomatiseerde absorbentiemetingen.
- Verdampingssnelheden werden gekwantificeerd en geanalyseerd op correlaties.
- De assay bleek effectief voor high-throughput voedingsstudies.
Conclusies
- De microplate-voederassay is een waardevol hulpmiddel voor onderzoek naar Drosophila.
- Het maakt een efficiënte en nauwkeurige meting van het voedingsgedrag mogelijk.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse insectensoorten en toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het kwantificeren van de consumptie in modelorganismen ondersteunt doelwitvalidatie en fenotypische screening in de vroege ontdekkingsfase. De microplate-voedingsassay maakt high-throughput meting van de inname van vloeibaar voedsel bij Drosophila mogelijk, waardoor kwantitatieve gegevens worden verkregen voor het mechanistisch minimaliseren van risico's bij nutritionele, toxicologische of farmacologische interventies. Deze aanpak verbetert het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door consumptiemetrieken te standaardiseren over grote steekproefsets.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de consumptie van voedingsstoffen, toxinen of geneesmiddelen te kwantificeren in een genetisch hanteerbaar model.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk via gestandaardiseerde, op absorptie gebaseerde meting van de vloeibare voedselinname.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door reproduceerbare consumptiegegevens te genereren voor compound-screening.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door individuele vliegconsumptie te isoleren in multi-well formaten.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via verzegelde microplaten en gecontroleerde correctie van verdamping.
- Schaalbaarheid: Benadrukt de geschiktheid voor screening en platformhergebruik via 3D-geprinte koppelingen die 96- en 1536-well microplaten synchroniseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door dosis-responsanalyse van consumeerbare verbindingen mogelijk te maken.
- Mechanische risicoreductie: Richt zich op de predictieve waarde bij het beoordelen van gedragsresponsen op stoffen zoals ethanol of gistextract.
- Ziekte-relevant systeem: Ondersteunt studies naar consumptie-geassocieerde kenmerken met omgevings- en farmacologische variabelen.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, ter ondersteuning van kwantitatieve gedragsfenotypering.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetesten, het verduidelijken van signaalpaden of biologische risicoreductie ondersteunt door middel van gekwantificeerde vloeibare voedselinname.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay, reproduceerbaarheid of kwantitatieve resultaten wanneer dit door het artikel wordt ondersteund via absorbentiemetingen voor en na consumptie.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische resultaten die teams helpen om condities te vergelijken, inclusief evaporatiecorrectie en Pearson-correlatieanalyse.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming, uitsluitend wanneer de bron dit ondersteunt via voorkeurstests tussen sucrose- en ethanol-gesupplementeerde oplossingen.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek door middel van 3D-geprinte koppelingen en afdichtingsprotocollen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie en vermindering van mechanistische ambiguïteit bij consumptiegerelateerde fenotypes.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door middel van absorptiemetingen in microplates en barrièrestrips als controles.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door het mogelijk maken van high-throughput preference- en consumptie-assays.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen op basis van kwantitatieve opnamegegevens over compound-bibliotheken heen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in het hanteren van Drosophila, de voorbereiding van microplaten en spectrophotometrie.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten platenlezers die in staat zijn tot absorptie bij 630 nm en 3D-geprinte koppelingssystemen.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams voor verzegeling, perforatie en omgevingscontroles om condensatie- en verdampingsartefacten te minimaliseren.
- Overwegingen voor aanpassing over verschillende modelsystemen, met aandacht voor de mogelijkheid tot uitbreiding naar andere insectensoorten met aangepaste voedingsformuleringen.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronommateriaal: verdamping moet worden gekwantificeerd en gecorrigeerd; het koelen van platen veroorzaakt condensatie die aflezingen belemmert; een consistente oriëntatie van de koppeling en de microplaten is vereist voor correcte toegang tot de wells.
