Een high throughput microplate feeder assay voor kwantificering van consumptie in Drosophila
June 14th, 2021
De microplate feeder assay biedt een economische, hoge doorvoermethode voor het kwantificeren van vloeibare voedselconsumptie in Drosophila. Een 3D-geprint apparaat verbindt een 96-well microplaat waarin vliegen zijn gehuisvest met een 1536-well microplaat waaruit vliegen een voedingsoplossing met een tracerkleurstof consumeren. De volumedaling van de oplossing wordt spectrofotometrisch gemeten.
De microplate feeder assay biedt een eenvoudige, high-throughput, economische methode om Drosophila voedingsgedrag te meten, en het biedt meerdere voordelen ten opzichte van andere, meer uitgebreide methoden. Het kwantificeren van het verbruik door de absorptie te meten met een plaatlezer elimineert handmatige metingen en voorkomt handmatige gegevensinvoer. Gegevens zijn ook vatbaar voor programmatische extractie en verwerking.
Met deze high-throughput assay kunnen we het verbruik van in water oplosbare voedingsstoffen, medicijnen, farmaceutische producten of toxines kwantificeren en kan het systeem worden aangepast voor toepassingen op een verscheidenheid aan insectensoorten. Begin met het gieten van de gesmolten agarose in een reagenstrog en dispenseer 80 microliter gesmolten agarose in elke put van een 96-well microplaat met behulp van een meerkanaals pipet. Koel de overgebleven agarose tot een week in een afgesloten zak en bewaar het voor het maken van extra borden.
Als de barrièrestrips te los zijn, rol ze dan rond de vinger om ze kromming te geven om ze in de kanalen te houden. Steek de barrièrestroken in de barrièrestrookkanalen om de koppelingen voor te bereiden. Bevestig de koppeling aan een verhongeringsplaat en zorg ervoor dat u de koppeling niet gebruikt om de plaat te manipuleren, omdat de koppeling eraf kan glijden.
Zorg ervoor dat de schuine hoek van de koppeling overeenkomt met de schuine hoek van de microplaat om de juiste oriëntatie te behouden. Sorteer onder CO2-anesthesie drie tot vijf dagen oude vliegen. Laad individuele vliegen per kolom in de hongerplaat.
Sluit elke kolom terwijl deze zich vult door de barrièrestrook aan te passen aan de gesloten positie. Noteer zorgvuldig de monsterlay-out in de microplaat. Zodra de hongerplaat is gevuld, laat u de vliegen spontaan herstellen na het verwijderen van de CO2 en hongert u ze zes uur uit vanaf hun eerste verdovingstijd.
Bereid 10 milliliter vloeibaar voedsel in een conische buis van 15 milliliter door 0,4 gram sucrose en 0,1 gram gistextract op te lossen in 10 milliliter gedestilleerd water. Vortex de buis totdat de vaste stoffen volledig zijn opgelost. Voeg 40 microliter verfmiddeloplossing toe en breng het vloeibare voedsel over in een spuit van 10 milliliter met een filter van 0,45 micrometer.
Filtreer ongeveer 1,5 milliliter van de oplossing per keer in een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Zet de spuit met de oplossing apart en filter de extra oplossing indien nodig tijdens de bereiding van de invoerplaat. Bereid een invoerplaat voor door de bodem van een microplaat met 1536 putten af te dichten met een afdichtfolie.
Gebruik een afdichtingspeddel om de film grondig te hechten. Knip vervolgens overtollige film van de linker- en rechterrand af met een scheermesje. Dispense 10 microliter van het gefilterde vloeibare voedsel kolomgewijs in de linkerbovenhoekput voor elk cluster van vier putten van de 1536-well microplaat.
Zodra alle putten zijn gevuld, brengt u een afdichtingsfolie aan op de bovenkant van de plaat, volgens dezelfde stappen die worden gebruikt om de onderkant van de microplaat af te dichten. Herhaal dit voor het gewenste aantal platen. Centrifugeer de platen gedurende 10 seconden op 200 maal G om de vloeistof te laten bezinken.
Laat de plaat niet koelen, omdat dit condensatie in de putten kan veroorzaken, waardoor absorptiemetingen worden verduisterd. Perforeer de putjes op het bovenoppervlak van de plaat met het naaldsondegereedschap uitgerust met een naald met een diameter van 0,25 millimeter, waarbij dezelfde volgorde wordt gebruikt om te perforeren als werd gebruikt bij het doseren van de oplossingen. Veeg de naald tussen de oplossingen af om kruisbesmetting te voorkomen.
Draai de plaat om en perforeer de putjes aan de onderkant. Lees de absorptie van de plaat op 630 nanometer zonder deksel. Plaats een binnendeksel op de bovenste afdichtingsfolie om ervoor te zorgen dat de condensatieringen de geperforeerde putten omringen en plaats vervolgens het externe deksel op de plaat.
Plaats de invoerplaat met de voorkant naar boven op de koppeling, zodat de geleiders de juiste gaten van de invoerplaat en de uithongeringsplaat uitlijnen. Zorg ervoor dat de koppeling en platen correct zijn georiënteerd. Zodra alle invoerplaten op de koppelingen zijn geladen, opent u de putten voor de platen door de barrièrestroken op de koppeling aan te passen.
Plaats de koppeling en plaatassemblages in de secundaire container. Plaats de onderste helft van een pipetdoos met geweekte papieren handdoeken in elke secundaire container om vocht te bieden. Sluit het deksel van de secundaire container en breng deze over naar een gecontroleerde omgeving.
Laat de vliegen 22 uur consumeren. Controleer na de 22 uur blootstelling elke plaat op dode vliegen en werk de lay-out van de plaat dienovereenkomstig bij. Nadat alle platen zijn gecontroleerd, verdooft u de vliegen massaal door CO2 in de secundaire container te pompen.
Zorg er na ongeveer 60 seconden voor dat alle vliegen zijn geïmmobiliseerd. Tik de vliegen voorzichtig in de uithongerplaat en vervang de plastic barrièrestrips. Verwijder de invoerplaten om af te lezen.
Herlees de absorptie van de plaat op 630 nanometer. Herhaal het proces totdat alle platen zijn gelezen. Verdamping werd gekwantificeerd voor elke put en bleek te bepalen of er correlaties bestaan tussen de putten van individuele platen.
Pearson correlatiecoëfficiënten voor verdamping versus rijen en verdamping versus kolommen werden berekend om trends tussen verdamping en putlocaties te evalueren. Het verbruik van drie tot vijf dagen oude Canton-SB-vliegen werd gekwantificeerd om de geldigheid van het protocol vast te stellen. Vliegen kregen de keuze tussen een 4%sucrose-oplossing met 1%gistextract en een 4%sucrose-oplossing aangevuld met 15%ethanol en 1%gistextract.
Zowel mannen als vrouwen vertoonden een overweldigende voorkeur voor de oplossing met ethanol en gistextract. Het is essentieel om consistentie te behouden bij het construeren van de feederplaten, zodat elke vlieg een identiek consumptiescenario krijgt met betrekking tot voedselvolume, verdamping en toegang. Deze techniek stelt onderzoekers in het Drosophila-veld in staat om high-throughput assays uit te voeren voor consumptie en voorkeursgedrag met een hogere doorvoer en tegen lagere kosten in vergelijking met traditionele methoden.
Overzicht
De microplate feeder assay biedt een high-throughput methode voor het kwantificeren van het voedingsgedrag van Drosophila. Deze economische aanpak maakt gebruik van een 3D-geprint apparaat om microplaten te verbinden, waardoor efficiënte meting van de consumptie van vloeibaar voedsel mogelijk is.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Entomologie
Achtergrond
- Het meten van voedingsgedrag bij Drosophila is cruciaal voor het begrijpen van voedingsvoorkeuren.
- Traditionele methoden kunnen arbeidsintensief en minder efficiënt zijn.
- De microplate feeder assay stroomlijnt dit proces.
- Maakt gebruik van spectrofotometrische metingen voor gegevensverzameling.
Doel van de studie
- Om een high-throughput methode te ontwikkelen voor het beoordelen van voedselconsumptie bij Drosophila.
- Om de kwantificering van verschillende voedingsstoffen en substanties te vergemakkelijken.
- Om de efficiëntie van studies naar voedingsgedrag te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van agarose en microplates voor voedingsproeven.
- Sorteren en anestheseren van vliegen voor gecontroleerde voedingsexperimenten.
- Meten van absorbantie om voedselconsumptie te kwantificeren.
- Analyseren van gegevens voor trends in voedingsgedrag en voorkeuren.
Belangrijkste resultaten
- Vliegen toonden een voorkeur voor voedsel dat ethanol en gistextract bevatte.
- Gegevensverzameling werd gestroomlijnd door geautomatiseerde absorbantiemetingen.
- Verdampingssnelheden werden gekwantificeerd en geanalyseerd op correlaties.
- De assay bleek effectief voor high-throughput voedingsstudies.
Conclusies
- De microplate feeder assay is een waardevol hulpmiddel voor Drosophila-onderzoek.
- Het maakt efficiënte en nauwkeurige meting van voedingsgedrag mogelijk.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende insectensoorten en toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying consumption in model organisms supports target validation and phenotypic screening in early discovery. The microplate feeder assay enables high-throughput measurement of liquid food intake in Drosophila, providing quantitative data for mechanistic de-risking of nutritional, toxicological, or pharmacological interventions. This approach improves predictive confidence in lead identification by standardizing consumption metrics across large sample sets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals in a genetically tractable model.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, absorbance-based measurement of liquid food intake.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating reproducible consumption data for compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by isolating individual fly consumption in multi-well formats.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sealed microplates and controlled evaporation correction.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse via 3D-printed couplers that synchronize 96- and 1536-well microplates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling dose-response analysis of consumable compounds.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when assessing behavioral responses to substances like ethanol or yeast extract.
- Disease-Relevant System: Supports studies of consumption-associated traits with environmental and pharmacological variables.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting quantitative behavioral phenotyping.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through quantified liquid food intake.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via absorbance measurements before and after consumption.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including evaporation correction and Pearson correlation analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via preference testing between sucrose and ethanol-supplemented solutions.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through 3D-printed couplers and sealing protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in consumption-related phenotypes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through microplate-based absorbance readings and barrier strip controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling high-throughput preference and consumption assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative intake data across compound libraries.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in Drosophila handling, microplate preparation, and spectrophotometry.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include plate readers capable of 630 nm absorbance and 3D-printed coupler systems.
- Cross-team standardization requirements for sealing, perforation, and environmental controls to minimize condensation and evaporation artifacts.
- Adaptation considerations across model systems, noting potential for extension to other insect species with modified food formulations.
- Practical limitations supported by source material: evaporation must be quantified and corrected; chilling plates causes condensation that obscures readings; consistent orientation of coupler and microplates is required for proper well access.
