Kwantitatieve analyse van de groeisnelheid van Aspergillus nidulans met behulp van live microscopie en open-source software

In deze video beschrijven we een labelvrij live imaging protocol om beelden van de modelschimmel aspergillus nidulans vast te leggen, met behulp van microscopietechnieken voor doorgegeven licht. We gebruiken deze beelden om de groeikinetiek van aspergillus nidulans in zowel vloeibare als vaste media te analyseren en te kwantificeren. Een visuele weergave van dit protocol stelt gebruikers in staat om vertrouwd te raken met belangrijke stappen van het vastleggen van afbeeldingen en microscopie beeldverwerking.

Een veelgebruikte methode om filamenteuze schimmelgroei te meten is twee ent schimmelsporen in een petrischaal met voedingsagar en om de diameter van de zich ontwikkelende kolonie een paar dagen later te meten. Deze aanpak is echter niet gevoelig genoeg om fijne groeiverschillen te kwantificeren. Daarom werden eencellige metingen met behulp van timelapse-microscopie ontwikkeld.

Deze metingen zijn niet alleen in staat om nauwkeurige en kwantitatieve resultaten te leveren, maar ook om de groeidynamiek van verschillende cellen binnen een populatie weer te geven. Bovendien is deze aanpak gericht op een beter begrip van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij schimmelgroeireacties op endogene en omgevingssignalen. Begin met het gieten van 15 milliliter vloeibare voedingsagar in petrischalen.

Plaats het deksel op de bovenkant en laat het afkoelen. Gebruik UV-straling om platen te steriliseren. Voordat u de schimmelstam van belang uit een voorraad streept, verwarmt u de nodulating-lus in de Bunsen-brander totdat deze roodgloeiend is, koelt u de lus af door deze in de agar te steken.

Vortex de buis en streep de lus over het oppervlak van het agar minimal medium aangevuld met de juiste voedingsbehoeften. Incubeer platen gedurende twee tot drie dagen bij 37 graden Celsius. Breng met behulp van een steriele tandenstoker een klein aantal conidia over door voorzichtig een enkele kolonie aan te raken op platen met complete media.

Incubeer platen gedurende drie tot vier dagen bij 37 graden Celsius. Conidia van aspergillus nidulans, worden geoogst in een steriele vortexbuis van 1,5 milliliter, met 1,0 milliliter gedestilleerd autoclaaf gedestilleerd water met 0,05% volume per volume, Tween 80, voor het verminderen van het aantal conidia-klonten. Een aangepaste versie van de omgekeerde agar-methode wordt gebruikt voor het afbeelden van filamenteuze schimmels op het oppervlak van het agarmedium.

Spot in eerste instantie 10 microliter aliquots van krachtig vortex conidiale suspensie, ongeveer twee keer 104 cellen per milliliter op petrischalen van 15 milliliter minimaal medium met één gewicht per volume agar. Incubeer de experimentele cultuur volgens het te onderzoeken ontwikkelingsstadium. Hier incuberen we drie dagen bij 30 graden Celsius.

Snijd daarna een blok agar uit dat de kolonie bevat, met behulp van een steriel scalpel. Hier snijden we een wig van agar uit aan de kolonierand, keren om en plaatsen de agar-plak in een acht, goed schuiven. Breng 10 microliter aliquots van krachtig vortex conidiale suspensie van ongeveer twee keer 10 in de kracht van vier in de putten van een put dia met 200 microliter minimaal medium met de juiste supplementen.

Incubateer voor de tijd en temperatuur die elke keer moeten worden onderzocht. De keuze van de microscoop hangt af van de beschikbare apparatuur. In ieder geval moet de microscoopop een omgekeerde fase, een omgevingskamer of op zijn minst een kamer met nauwkeurige luchttemperatuurregeling bevatten.

Verwarm in eerste instantie de thermostaat en de microscoopkamer voor om de gewenste temperatuur te stabiliseren. Hier stellen we de temperatuur in op 30 graden Celsius. Schakel de microscoop, de scannervoeding, de laservoeding en de computer in en laad de beeldbewerkingssoftware.

Plaats de eerder voorbereide goed voorbereide dia in het microscoopstadium en stel scherp. Zoek gezichtsvelden die geïsoleerde, niet overlappende cellen bevatten, of in ieder geval niet overvol, om groeimetingen tijdens beeldanalyse te vergemakkelijken. Selecteer de te gebruiken microscopietechniek voor doorlatend licht en activeer indien nodig de detector voor doorlatend licht en detectoren voor fluorescentie.

Stel de microscoop in om beelden met de gewenste tijdsintervallen te verkrijgen en de acquisitie van tijdreeksen te starten. Het laden, visualiseren en verwerken van afbeeldingen wordt bereikt met de open source imageJ Fiji-software. Begin met het importeren van de afbeeldingen naar Fiji met behulp van plug-ins op een indeling.

Selecteer de standaardkleurmodus en automatisch schalen. Om een tijdstempel en een schaalbalk als overlay te visualiseren, gaat u naar analyseren, gereedschappen, schaalbalk. Stel de gewenste parameters in met betrekking tot breedte, hoogte, kleur en locatie van de schaalbalk.

Ga naar afbeelding, eigenschappen, om afbeeldingseigenschappen weer te geven in imageJ Fiji-software. Observeer frame-intervalinformatie. Hier gebruiken we een tijdsinterval van ongeveer 15 minuten en drukken we op ok.

Ga vervolgens naar afbeelding, stapels, label en stel de juiste informatie in op interval. Stel de locatie van het label in door X en Y te wijzigen.Stel de maateenheid in de veldtekst in en druk op voorvertoning. Gebruik histogram matching voor verlichtingscorrectie tussen verschillende frames door het selecteren van beeld, aanpassen, bleekcorrectie, histogram matching.

Er verschijnt een nieuw venster met gecorrigeerde verlichting. Gebruik de MtrackJ-plug-in bij plug-ins, MtrackJ, om groeiende hyphaltip te volgen Om de track toe te voegen, selecteert u de knop Toevoegen in de werkbalk en plaatst u het eerste punt op de hyphaltip met de linkermuisklik. De tijdreeks gaat automatisch naar het volgende frame.

Als u het trackingproces wilt voltooien, dubbelklikt u met de muis op het laatste punt of drukt u op de escape-toets. Scrollend door de uitvoertabel, de belangrijkste kolom voor het berekenen van de groei van de hyphaltip, is de snelheid bij een bepaald frame. Veilig metingen bijhouden, bestand toevoegen, opslaan als, in de bestandsindeling van uw keuze, bijvoorbeeld CSV, importeer het opgeslagen bestand in uw spreadsheetprogramma en bereken de visualisatie en verdere tests.

Druk op de filmknop om een film te genereren, RGB-kleurtype, met de frames met de tracks erin getekend, die kunnen worden gevisualiseerd in elke standaard multimediaspeler. Volgens dit protocol hebben we verschillende beelden vastgelegd en geanalyseerd die overeenkomen met verschillende groei- en ontwikkelingsstadia van de filamenteuze schimmel aspergillus nidulans. Figuur toont de vergelijking van wild type en azhAD Delta ngnA Delta groeisnelheid metingen.

De azhAD Delta ngnA Delta is een dubbel verwijderde stam in twee genen die betrokken zijn bij de ontgifting en assimilatie van het toxische gevechtsproduct L zoals toegevoegd in twee carbonzuren. Het toont statistisch significante lagere groeisnelheidsmetingen in vergelijking met de wildtype stam in ondergedompelde vloeibare culturen. Dit verschil in groei is niet waarneembaar door het koloniegebied van deze twee stammen in vast minimaal medium te meten.

Single cell, long-term live imaging is van grote waarde in de inspanning om ruimtelijke en temporele informatie van cellulaire eiwitdynamica te verkrijgen. Dit protocol is ook geschikt voor het uitvoeren van langdurige live cell imaging. Hier zien we kieming van conidia die het GFP-gelabelde kern eisosomaal eiwit PilA en het mRFP histonen H1 co-tot expressie brengen. Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van schimmelgroeikinetiek op een reproduceerbare en betrouwbare manier zonder de noodzaak van enige voorafgaande beeldanalyse-ervaring van de gebruiker.

Dit protocol maakt een objectieve nauwkeurige kwantificering van schimmelgroei mogelijk.