Name: Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Leer een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties met behoud van intestinale fysiologie. Deze methode combineert in vitro- en in vivo-voordelen voor microbioomonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken voormalige en huidige leden van het Yissachar lab voor hun waardevolle bijdragen aan het optimaliseren van het darmorgaancultuursysteemprotocol. Wij danken Yael Laure voor de kritische bewerking van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie nr. 3114831), de Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (subsidie nr. 8165162) en het Gassner Fund for Medical Research, Israël.

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging die zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor dierenwelzijn.
1. Voorbereiding van experimenten
<ol><li>Fabricage van het darmorgaancultuurapparaat (3 dagen)<ol>
<li>Print met een 3D-printer de herbruikbare plastic mallen voor het orgaancultuurapparaat (het apparaat heeft 6 putten, met 24 kleine en grote gaten en voor het deksel van het apparaatdeksel) (3D-bestanden bevestigd). OPMERKING: Deze plastic mallen kunnen worden gebruikt voor de vervaardiging van tal van apparaten.</li>
		<li>Plaats de stompe naalden (22 G & 18 G) in de juiste positie in de vorm van het apparaat en giet ongeveer 20 g polydimethylsiloxaan (PDMS) mix (1:10 gewichtsverhouding, basis tot katalysator) voor één set van het apparaat en deksel.</li>
		<li>Plaats de mallen gedurende 30 minuten in een vacuümkamer om luchtbellen uit de PDMS-mix te verwijderen.</li>
		<li>Incubeer de mallen 's nachts bij 55 °C om PDMS-polymerisatie te voltooien.</li>
		<li>Wanneer het PDMS is ingesteld, trekt u de naalden uit de mal en laat u het kweekapparaat en deksel voorzichtig los van de plastic mallen.</li>
		<li>Verwijder PDMS-residuen uit de putcontour met behulp van een chirurgisch mes. Bevestig het PDMS-apparaat en de deksel van het apparaat op een afdekglas (75 mm x 50 mm microglijbanen) met behulp van niet-giftige siliconenlijm en laat de onderdelen 's nachts instellen (breng de lijm aan op de gladde kant van het apparaat).</li>
		<li>Plaats twaalf naalden van 22 G voor het lumen en twaalf naalden van 18 G voor de put. Bevestig alle naalden op hun plaats met siliconen en laat het 's nachts inzetten. Steek twee naalden van 18 G in het deksel van het deksel voor een goede luchtstroom in en uit het darmorgaankweekapparaat.</li>
		<li>Controleer alle naalden op lekkages met een met water gevulde spuit. Controleer of er geen lekkage is uit de putten door de putten met water te vullen.</li>
		<li>Leg twee chirurgische knopen op elke 22 G naald die verbonden zal zijn met de dikke darm. Plaats het apparaat en het deksel in een papieren zak van de autoclaaf en steriliseer in een autoclaaf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultuurmedium (0,5 uur)<ol>
<li>Meng in een biologische kap het volgende (in 50 ml buis): 37 ml Gemodificeerd Dulbecco's Medium (IMDM), 10 ml KSR-serumvervanging, 1 ml B27-supplement, 0,5 ml N2-supplement, 0,5 ml hepes-buffer van 1 M EN 0,5 ml niet-essentiële aminozuren.</li>
		<li>Filter en bewaar het volledige medium op 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tubing en chirurgische gereedschapsvoorbereiding<ol>
<li>Snijd de juiste lengte buizen voor het ingangslumen, de ingangsput, het uitgangslumen en de uitvoerput (12 korte buizen en 12 lange buizen). Sluit een geschikte adapter aan op elke kant van de buis.</li>
		<li>Bereid de chirurgische hulpmiddelen voor: rechte schaar, 4x dunne tang en 2x scherpe tang.</li>
		<li>Plaats de buizen en het chirurgische gereedschap in een papieren zak van de autoclaaf en steriliseer ze met behulp van een autoclaaf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de luminale input voor (gewenste stimulatie - bacteriën, ontlasting, medicijnen, enz.).<ol>
<li>Bepaal vóór het experiment de bacteriële belasting van de bacteriecultuur, door seriële verdunningen12,en kweek onder aerobe en/of anaerobe omstandigheden.</li>
		<li>Verdun na het berekenen van de bacteriële belasting de bacteriële culturen in steriel weefselkweekmedium om de vereiste bacteriële concentratie te verkrijgen. Filter voor fecale monsters met een zeef van 100 μm. OPMERKING: Verdun de stof voor niet-bacteriële stimulatie (geneesmiddelen, metabolieten, enz.) tot de vereiste concentratie met behulp van het darmkweekmedium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorbereiding van de experimentopstelling
<ol><li>Schakel in de couveuse van de orgelcultuur de verwarmingseenheid in en zet deze op 37 °C.</li>
	<li>Stel de pompen en de in- en uitgangsspuiten in.</li>
	<li>Weefselkweek medium input<ol>
<li>Vul in een biologische of laminaire stromingskap de spuitspuiten van de ingangsput met een compleet kweekmedium. Het uiteindelijke volume is afhankelijk van de duur van het experiment en het debiet; meestal 1 ml/h plus extra medium voor zuivering.</li>
		<li>Sluit de buizen aan op de spuiten met behulp van de Luer-lock adapter. Plaats de gevulde spuiten in de spuitpompen.</li>
		<li>Reinig de invoerspuiten. Zorg ervoor dat het putmedium uit alle buizen in een afvalglas stroomt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Luminal-ingang<ol>
<li>Vul de luminale ingangsspuiten met stimulatiebehandeling (bacteriën, medicijnen, enz.). Het volume is afhankelijk van de duur van het experiment en het debiet (meestal 30 μL/h plus extra medium voor zuivering).</li>
		<li>Sluit de buizen aan op de spuiten met behulp van de Luer-lock adapter. Plaats de gevulde spuiten in de spuitpompen.</li>
		<li>Zuiveringsspuiten. Zorg ervoor dat de stimulatie uit alle buizen in een afvalglas stroomt. Pas op dat u de verschillende stimulaties niet vervuilt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uitgangen<ol>
<li>Plaats de lege spuiten in de pomppompen van de uitgangsspuit (zet de pompmodus op 'terugtrekken').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Apparaat instellen<ol>
<li>Stel de regelaar in die het gasmengsel (95% O2 + 5% CO2)regelt voor een zacht, minimaal debiet.</li>
		<li>Onderzoek het apparaat in een laminaire kap.</li>
		<li>Spoel de naalden van het apparaat door met steriel IMDM om de naalden te wassen.</li>
		<li>Voeg 500 μL steriel kweekmedium toe aan elke put van het apparaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding op weefseldissectie<ol>
<li>Doe het steriele chirurgische gereedschap in de laminaire kap.</li>
		<li>Vul een spuit van 10 ml met steriel IMDM en sluit een steriele (autoclaaf) 22 G stompe naald aan voor het doorspoelen van de dikke darm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Orgelculturen
<ol><li>Muizenoffer en weefseldissectie<ol>
<li>Offer in een laminaire kap 12-14 dagen oude muizen op door onthoofding. Besproei de muizen met 70% ethanol en leg de muizen op een plastic plaat.</li>
		<li>Ontleed met een scherpe schaar en tang de muis en haal het spijsverteringskanaal van de maag naar de anus door al het vet- en bindweefsel te snijden. Snijd de dikke darm door en leg deze op een nieuw bord. OPMERKING: Minimaliseer het contact met het darmweefsel. Raak het middelste deel van het darmweefsel niet aan. Houd het weefsel voorzichtig en alleen aan de randen van het weefsel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colon flush en wassen<ol>
<li>Spoel onder een dissectiemicroscoop het colongehalte voorzichtig door met steriel IMDM (in de proximale zijde) met de voorbereide spuit van 10 ml (stap 2.7.2). Na het verwijderen van de uitwerpselen uit het darmweefsel, plaatst u de dikke darm in een nieuwe 6-putplaat gevuld met 0,5 ml steriel IMDM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De dubbele punt op het apparaat aansluiten<ol>
<li>Neem het weefsel en sluit het voorzichtig aan op de 22 G naald en maak een strakke band met de twee draden. Op dit punt is het noodzakelijk om de juiste oriëntatie van de dubbele punt op de lumenstroom te behouden (proximaal = input, distaal = output). Herhaal stap 3.2-3.3 voor alle 6 weefsels.</li>
		<li>Controleer of de luervergrendelingen van de invoernaald leeg zijn vanaf het medium. Zo niet, maak ze dan leeg. Voeg stimulaties toe aan de ingangsnaald Luer lock (om te voorkomen dat luchtbellen in het lumen komen). Herhaal deze stap voor elke dikke darm met de juiste stimulatie.</li>
		<li>Controleer of alle weefsels met elkaar verbonden zijn en plaats het deksel op het apparaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aansluiten van het orgaancultuurapparaat op de pompen<ol>
<li>Plaats het apparaat in de voorverwarmde temperatuurgeregelde kamer (37 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gasstroom aansluiten<ol>
<li>Sluit de gasadapter aan op het deksel met behulp van de juiste invoernaald.</li>
		<li>Sluit de in- en uitvoerbuizen aan op het apparaat. OPMERKING: Sluit de proximale dikke darmzijde aan op de invoerbaden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinig het lumen met de stimulatie-ingangen.<ol>
<li>Vloei voorzichtig luminale stimulatie door de darm en controleer de gemiddelde stroom in de uitgangsbuizen.</li>
		<li>Was het externe medium.</li>
		<li>Was het externe medium 3 keer (zet de pompen op een snelheid van 600 μL/min voor zowel de in- als de uitgangsput). Elke wasbeurt duurt 1 minuut (te beginnen met het legen van de put).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Start het experiment.<ol>
<li>Start de pompen met de volgende tarieven: Debiet: lumen: input- 30 μL/h, output- 35 μL/h Extern medium: ingang- 1000 μL/h, output- 950 μL/h OPMERKING: De experimenteertijd kan variëren van 30 minuten tot 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einde experiment (tot 24 uur voor colon orgaanculturen)<ol>
<li>Koppel alle buizen los van het apparaat.</li>
		<li>Koppel de weefsels los van de naalden en ga verder met de gewenste uitlezingen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
<li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li>
<li>Haller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell%2Fleucocyte+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li>
<li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).</li>
<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor ex vivo darmorgaanculturen die Yissachar et al. onlangs hebben ontwikkeld (gepubliceerde9 en niet-gepubliceerde gegevens). Het darmorgaankweeksysteem ondersteunt multiplexed cultuur van intacte darmfragmenten met behoud van de luminale stroom. Het biedt volledige controle over de intra- en extra-luminale omgeving (inclusief stimulatiedosis, belichtingstijd en debiet) en behoudt de naïeve darmweefselstructuur en de cellulaire complex...

De darm is een zeer complex orgaan dat een breed scala aan celtypen bevat (epitheelcellen, cellen van het immuunsysteem, neuronen en meer) georganiseerd in een bepaalde structuur die cellen in staat stelt om met elkaar en met het luminale gehalte (microbiota, voedsel, enz.) te communiceren en te communiceren. 1. Momenteel omvat de onderzoekstoolbox die beschikbaar is voor het analyseren van gastheer-microbiota-interacties in vitro celculturen en in vivo diermodellen2. In vivo diermodellen bieden een fysiologische weefselconstructie3, maar met slechte experimentele controle en beperkt vermogen om de experimentomstandigheden te manipuleren. In vitro kweeksystemen daarentegen gebruiken primaire cellen of cellijnen die kunnen worden aangevuld met microben4, die strakke controle bieden over de experimentparameters, maar de cellulaire complexiteit en de weefselarchitectuur missen. Moderne in vitro assays maken het geavanceerde gebruik van gezonde en pathologische menselijke weefselmonsters mogelijk, zoals epitheliale organoïden afgeleid van muis of menselijke bronnen5,6, en monsters die het mucosale micromilieu nabootsen7. Een ander voorbeeld is de 'gut on a chip'-test, die de menselijke colonische epitheelcellijn (Caco2), extracellulaire matrix en microfluïdische kanalen omvat om de fysiologische toestand van de darm invariant8na te bootsen . Hoe geavanceerd en innovatief in vitro monsters ook mogen zijn, ze behouden geen normale weefselarchitectuur of naïeve cellulaire samenstelling.
Om dat aan te pakken, ontwikkelden Yissachar et al. onlangs een ex vivo orgaankweeksysteem9 (figuur 1) dat intacte darmfragmenten ex vivobehoudt , profiterend van de voordelen van zowel in vivo als in vitro modellen. Dit ex vivo darmorgaankweeksysteem is gebaseerd op een op maat gemaakt kweekapparaat dat een multiplexed kweek van zes darmweefsels ondersteunt, waardoor experimentele ingangen onder vergelijkbare omstandigheden kunnen worden onderzocht terwijl de in- en uitgangen van het systeem worden gecontroleerd. Recente werken hebben aangetoond dat dit systeem waardevol is voor het analyseren van darmreacties op individuele darmbacteriën9, hele menselijke microbiotamonsters10 en microbiële metabolieten11. Dit systeem maakt voor het eerst de studie mogelijk van deze vroege gastheer-microbiota interacties met een hoog niveau van controle over de gastheer, microbiële en omgevingscomponenten. Bovendien maakt het het mogelijk om het systeem gedurende het hele experiment in realtime te volgen en te manipuleren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> Figuur 1: Schema's van het darmkweekapparaat. Een heel darmweefselfragment wordt bevestigd aan de output- en ingangspoorten van de kamer (boven), met pompen die de gemiddelde stroom in het lumen en in de externe middelgrote kamer regelen. Het hele apparaat (onder) bevat 6 van dergelijke kamers. Dit cijfer is aangepast van Yissachar et al. 2017. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Apparaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 Gauge Blunt Needle</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge Blunt Needle</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide 1 mm Thick</td><td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>Mini Incubator im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E Vacuum PUMP</td><td></td><td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs</td><td>Mcmaster</td><td>51525k121</td><td></td></tr><tr><td>plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td><td>Dow</td><td></td><td>Polydimethylsiloxaan, PDMS</td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Mcmaster</td><td>6516t11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 Materials: z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x), Serum Free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Knock-Out Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Non Essential Amino Acid (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische gereedschappen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grote schaar</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>Scherpe pincet</td><td>F.S.T</td><td>11297-10</td><td></td></tr><tr><td>Zijde gevlochten chirurgisch draad</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>Rechte schaar</td><td>F.S.T</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Dunne pincet</td><td>F.S.T</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Orgaansysteem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &micro;m Filter</td><td>Life Gene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m Filter</td><td>Life Gene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer Lock Syringe</td><td>B-D</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereo Microscope</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Recirculating Precision Air Heater "CUBE"</td><td></td><td>CUBE-2-LIS</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>new era pump systems inc</td><td>nep-ne-1600-em</td><td></td></tr></tbody></table>

een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

De structuur van het darmweefsel vergemakkelijkt nauwe en mutualistische interacties tussen de gastheer en de darmmicrobiota. Deze kruisbesprekingen zijn van cruciaal belang voor het behoud van lokale en systemische homeostase; veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota (dysbiose) associëren met een breed scala aan menselijke ziekten. Methoden voor het ontleden van gastheer-microbiota-interacties omvatten een inherente afweging tussen het behoud van fysiologische weefselstructuur (bij gebruik van in vivo diermodellen) en het niveau van controle over de experimentfactoren (zoals in eenvoudige in vitro celkweeksystemen). Om deze afweging aan te pakken, ontwikkelden Yissachar et al. onlangs een darmorgaancultuursysteem. Het systeem behoudt een naïeve colonweefselconstructie en cellulaire mechanismen en het maakt ook strakke experimentele controle mogelijk, waardoor experimenten mogelijk zijn die niet gemakkelijk in vivokunnen worden uitgevoerd . Het is optimaal voor het ontleden van kortetermijnreacties van verschillende darmcomponenten (zoals epitheliale, immunologische en neuronale elementen) op luminale verstoringen (waaronder anaerobe of aerobe microben, hele microbiotamonsters van muizen of mensen, geneesmiddelen en metabolieten). Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een geoptimaliseerd protocol voor orgaancultuur van meerdere darmfragmenten met behulp van een op maat gemaakt darmcultuurapparaat. Gastheerreacties op luminale verstoringen kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorescentiekleuring van weefselsecties of weefselfragmenten met hele montering, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) of time-lapse-beeldvorming. Dit systeem ondersteunt een breed scala aan uitlezingen, waaronder next-generation sequencing, flow cytometrie en verschillende cellulaire en biochemische assays. Over het algemeen ondersteunt dit driedimensionale orgaancultuursysteem de cultuur van grote, intacte darmweefsels en heeft het brede toepassingen voor hoge resolutie analyse en visualisatie van gastheer-microbiota interacties in de lokale darmomgeving.

Het darmorgaankweeksysteem behoudt de levensvatbaarheid van het weefsel ex vivo. De evaluatie van de levensvatbaarheid van het weefsel werd gedurende de hele kweekperiode uitgevoerd. Colonweefselfragmenten werden geïncubeerd in het darmorgaankweeksysteem en vastgesteld na 2/12/24 uur cultuur. De integriteit van de intestinale epitheelcel (IEC)-laag werd gevalideerd door immunofluorescentiekleuring met behulp van E-cadherine en cytokeratine-18 antilichamen. Evenzo werden met slijm gevulde bokaalcellen in het col...

Dit artikel presenteert een unieke methode voor het analyseren van gastheer-microbioom interacties met behulp van een nieuw darmorgaancultuursysteem voor ex vivo experimenten.

Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Het darmorgaankweeksysteem combineert de voordelen van in vitro en in vivo assays en dient dus als een tussenstap tussen eenvoudige in vitro assays en complexe in vivo experimenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de combinatie van strakke experimentele controle met het behoud van darmfysiologie. Deze methode biedt inzicht voor het analyseren van intestinale reacties op specifieke stimulus met een hoog niveau van controle over de gastheer, microbiële en de omgevingscomponenten.Alon Shemesh, een masterstudent van mijn laboratorium, en Dr.Sivan Amidror, onze labmanager, demonstreren de procedure. Om te beginnen, plaats de stompe naalden in de juiste positie in de vorm van het apparaat en giet ongeveer 20 gram polydimethylsiloxaan of PDMS-mix, voor één set van het apparaat en deksel. Plaats de mallen gedurende 30 minuten in een vacuümkamer om luchtbellen uit de PDMS-mix te verwijderen en incubeer de mallen vervolgens 's nachts op 55 graden Celsius om PDMS-polymerisatie te voltooien.Wanneer het PDMS is ingesteld, trekt u de naalden uit de mal en laat u het kweekapparaat en deksel voorzichtig los van de plastic mallen. Verwijder PDMS-residuen uit de putcontour met behulp van een chirurgisch mes. Bevestig het PDMS-apparaat en het deksel van het apparaat op een afdekglas van 75 bij 50 millimeter microglijbanen met behulp van niet-giftige siliconenlijm en laat de onderdelen 's nachts inzetten.Breng de lijm aan op de gladde kant van het apparaat. Plaats 12, 22 gauge naalden voor het lumen en 12, 18 gauge naalden voor de put. Bevestig alle naalden op hun plaats met siliconen en laat het 's nachts inzetten.Reinig de invoerspuiten en zorg ervoor dat het putmedium uit alle buizen in een afvalglas stroomt, reinig vervolgens de invoerspuiten en zorg ervoor dat de stimulaties uit alle buizen in een afvalglas stromen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de verschillende stimulaties niet worden verontreinigd. Na het offeren van de muis, gebruik een scherpe schaar en tang om het te ontleden en haal het spijsverteringskanaal van de maag naar de anus, door al het vet en bindweefsel te snijden. Snijd de dikke darm door en leg deze op een nieuw bord.Minimaliseer het contact terwijl u het weefsel voorzichtig vasthoudt en alleen aan de randen. Voer de colon flush uit onder een dissectiemicroscoop. Spoel het colongehalte voorzichtig door met steriel IMDM met de voorbereide spuit van 10 milliliter zoals beschreven in de tekst.Na het verwijderen van de uitwerpselen uit het darmweefsel, plaatst u de dikke darm in een nieuwe zes putplaat gevuld met 0,5 milliliter steriel IMDM. Neem vervolgens het darmweefsel en verbind het voorzichtig met de 22 gauge naald, waardoor een strakke band met de twee draden wordt gemaakt. Houd de juiste oriëntatie van de dubbele punt op de lumenstroom, zodat het proximale en distale gelijk is aan respectievelijk input en output.Herhaal het spoelen van de dikke darm en het aaneendelen van de naald voor alle weefsels. Sluit de in- en uitgangsbuizen aan op het apparaat en begin het experiment door de pompen met de gewenste snelheden te starten. Met slijm gevulde bokaalcellen in het colonepitheel en slijmafscheiding in het lumen werden gedetecteerd, evenals proliferatie van IEC in de colonische crypten, zoals aangegeven door KI67-kleuring.Deze resultaten toonden aan dat het darmkweeksysteem de darmfunctie en structuur ex-vivo behoudt. Na twee uur gesegmenteerde filamenteuze bacteriën, of SFB, introductie, werden typische SFB-filamenten gedetecteerd in nauwe samenwerking met villi van de dunne darm met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie. Bovendien presenteerde een transmissie-elektronenmicroscopie SFB binnen een paar micron van de rand van de dunne darmepitheelborstel.Genexpressieprofielen van hele weefselmonsters werden twee uur na infusie met SFB in drievoud geproduceerd. Controleculturen werden doordrenkt met fecale suspensuspensus van kiemvrije of Bacteroides fragilis monocolonized muizen. Deze veranderingen die door SFB werden overtuigd, waren voornamelijk van kleine amplitude in vergelijking met de kiemvrije controle.De oriëntatie van de dikke darm is zeer belangrijk. Wees extra voorzichtig bij het vasten van de dikke darm aan de naald. Een goede band voorkomt vervuiling van de put met het lumengehalte.Een breed scala aan uitleestechnieken kan dit protocol volgen, zoals next generation sequencing, imaging, celsortering en nog veel meer. Deze voorlezingen geven nieuw inzicht in gastheermicrobioominteracties in gezondheid en ziekte.

an-intestinal-gut-organ-culture-system-for-analyzing-host-microbiota

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates an in vitro gut host–microbe model to study bacterial viability. A co-culture of Caco-2 and HT29-MTX cells is incubated with bacteria pre-treated under simulated digestive conditions. Epithelial barrier integrity is assessed using transepithelial electrical resistance, and fractions from the medium, solubilized...

In Vitro Gut Model to Assess Bacterial Adhesion and Internalization

In this video, we describe the methodology for setting up an ex vivo gut organ culture system to study the interactions between mouse intestinal tissue fragments and specific gut bacteria. The device consists of two pairs of input-output ports, the first connecting the intestinal tissue lumen and supplying the specific bacterial suspension into it, and the second continuously supplying media to the device's wells to maintain ex vivo tissue viability.

An Ex Vivo Gut Organ Culture System to Study Host-Microbiota Interactions

We beschrijven een in vitro protocol co-cultuur darm microbioom en darmvlokken voor een langere periode met een menselijke darm-on-a-chip microphysiological systeem.

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

De ex vivo orgaankweek maakt onderzoek naar biologische processen mogelijk in de context van de intacte weefselarchitectuur. Hier introduceren we een methode van ex vivo kweek van de muizencolon, die kan worden gebruikt om aangeboren immuniteit en antimicrobiële gastheerverdediging in de darm te bestuderen.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Cultuur en het gebruik ervan in Antimicrobial Host Defensie Studies

Gut host-microbe interacties werden geschat aan de hand van een nieuwe benadering van het combineren van een synthetische mondelinge Gemeenschap, in vitro gastro-intestinale spijsvertering en een model van het epitheel van de dunne darm. Presenteren we een methode die aangepast worden kan voor de beoordeling van de cel invasie van ziekteverwekkers en multispecifieke biofilms, of zelfs om te testen op het overlevingsvermogen van probiotische formuleringen.

Beoordelen van de levensvatbaarheid van een synthetische bacteriële Consortium op de In Vitro -Interface van het Gut-Host-microbe

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van de darmflora van de dikke darm in vitro, met behulp van een reeks van bioreactoren die de fysiologische omstandigheden van de gastro-intestinale tractus simuleren.

Toepassing van geavanceerde In Vitro kweken van technologie om te bestuderen van de menselijke darmflora

Dit protocol beschrijft een in vitro batch cultuur fermentatiesysteem van menselijke fecale microbiota, met behulp van inuline (een bekende prebiotisch en een van de meest bestudeerde microbiota modulatoren) om het gebruik van dit systeem te demonstreren bij het inschatten van de effecten van specifieke interventies op fecale microbiota samenstelling en metabole activiteiten.

Een in vitro batch cultuur model om de effecten van Interventionele regimes op menselijke fecale microbiota te schatten

Hier beschreven is een protocol om de interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota met behulp van in vitro batch fermentatiesystemen te onderzoeken.

Analyse van interacties tussen Endobiotica en humane gut microbiota met behulp van in-vitro Bad fermentatiesystemen

Dit gestroomlijnde protocol beschrijft een workflow om bacteriën in complexe weefselmonsters te detecteren en in beeld te brengen, van het fixeren van het weefsel tot het kleuren van microben met fluorescerende in situ hybridisatie.

Visualisatie van darmmicrobiota-gastheerinteracties via fluorescentie in situ hybridisatie, lectinekleuring en beeldvorming

Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.

Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies

De studie presenteert een methode voor in vitro onderzoek van bacteriële infecties met behulp van intestinale organoïden afkomstig van weefselstamcellen. Het protocol beschrijft hoe organoïden in twee dimensies kunnen worden gekweekt en onderscheiden, geïnfecteerd met adherent-invasieve Escherichia coli, en belangrijke metingen worden beoordeeld, waaronder het doorbreken van de epitheliale barrière, infectiebeeldvorming en de repitheliale RNA-respons.

Een tweedimensionale organoïde cultuur op invasine of basement membraanextract om gastheer-bacteriën interacties te bestuderen

Leer een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties met behoud van intestinale fysiologie. Deze methode combineert in vitro- en in vivo-voordelen voor microbioomonderzoek.

Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

Meer video's verkennen