Name: Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer hoe je extracellulaire blaasjes labelt en hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten monitort met confocale microscopie. Deze methode is waardevol voor onderzoek naar osteoartritis en therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medegefinancierd door het ESF Europees Sociaal Fonds en het EFRO Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (MS16/00124; CP16/00124); door het PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), gefinancierd door de duurzame toeristenbelasting van de Balearen; van de Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); door het POSTDOCTORALE PROGRAMMA FOLIUM (FOLIUM 17/01) binnen de FUTURMed, gefinancierd voor 50% door de belasting op duurzaam toerisme van de Balearen en voor 50% door het ESF; en door de Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

OPMERKING: Kraakbeenexplantaten werden verkregen van de IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) in overeenstemming met institutionele richtlijnen na ethische goedkeuring van het project door de CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Kolomvoorbereiding
<ol><li>Kolommen in evenwicht brengen volgens de instructies van de fabrikant of als volgt:<ol>
<li>Verwijder de kolomkap en breng de kolom in evenwicht. Verwijder de opslagbuffer door elutie.</li>
		<li>Was de kolom 3 keer met 2,5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Wacht tijdens elke wasbeurt tot de kolom het hele volume absorbeert. OPMERKING: Laat de kolom niet drogen.</li>
		<li>Bedek de kolom met de dop na de laatste wasbeurt en tot de monstervoorbereiding.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. EV-etikettering
OPMERKING: Dit EV-etiketteringsprotocol maakt gebruik van een PL-EV-monster dat eerder is geïsoleerd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met eerder beschreven voorwaarden21,22. Elk EV-monster van elke bron kan echter met dit protocol worden gebruikt.
<ol><li>Concentreer het EV-monster en de besturing (PBS) met behulp van een concentratiebuis.<ol>
<li>Plaats de monsters in een concentratiebuis van 15 ml of 500 μL, afhankelijk van het startvolume van het EV-monster. Centrifugeer de buizen volgens de instructies van de fabrikant totdat een bijna droog monster is verkregen. OPMERKING: Het controlemonster is nodig om te controleren op een eventuele kleurstofachtergrond. Hoewel deze methode geen specifiek initieel volume vereist, moet er rekening mee worden gehouden dat ongeveer 10% van de deeltjes verloren gaat tijdens zuiveringsstappen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend de geconcentreerde monsters met verdunningsmiddel C. Resuspend EV-monsters met 200 μL en de controlegroep met 100 μL en breng ze over naar nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml.</li>
	<li>Scheid het EV-monster in twee aliquots van 100 μL. Markeer er een met kleurstof en gebruik het als behandeling (PKH-PL-EV); laat de andere ongemarkeerd, maar verwerk het (NTA-PL-EV) zoals het EV-monster en gebruik het om de EV-concentratie per NTA te kwantificeren.</li>
	<li>Bereid 2x kleurstofoplossing, resulterend in 8 μM PKH26-oplossing in verdunningsmiddel C.</li>
	<li>Meng 1 μL van 1 mM PKH26 linker per 125 μL verdunningsmiddel C in het monster. Bereid een volume voor dat nodig is om aan de monsters toe te voegen in een verhouding van 1:1.</li>
	<li>Voeg 2x kleurstofoplossing toe aan PKH-PL-EV en controleer monsters in een verhouding van 1:1 om 1x kleurstofconcentratie en 4 μM PKH26-concentratie te bereiken. Voeg hetzelfde volume PBS toe aan het NTA-PL-EV-monster. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 5% runderserum albumine-PBS-oplossing toe aan de monsters in een verhouding van 1:1 en zorg ervoor dat het uiteindelijke volume ~400 μL is. OPMERKING: Met deze stap kunt u niet-specifieke kleurstofinteracties of ongebonden kleurstof verwijderen.</li>
	<li>Ga verder met het scheiden van de gelabelde EV's van de ongebonden kleurstof en niet-specifieke interacties van de kleurstof met de kolom.</li>
</ol>3. Gelabelde EV-isolatie
<ol><li>Verwijder de dop van de kolom, voeg 400 μL van het monster toe (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV of control) en gooi alle geëlueerde vloeistof weg.</li>
	<li>Wacht tot het monster de kolom volledig heeft ingevoerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 600 μL PBS toe en gooi alle geëlueerde vloeistof weg.</li>
	<li>Wacht tot de PBS de kolom volledig heeft ingevoerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 600 μL PBS toe en verzamel een fractie van 600 μL in een 1,5. ml centrifugebuis (EV's of besturing). OPMERKING: Deze stappen zijn nodig om de overtollige kleurstof uit de monsters te verwijderen. Een andere scheiding per kolom is nodig om zuiverdere EV's te verkrijgen. Daarom moeten de volgende stappen worden uitgevoerd in een nieuwe gebalanceerde kolom (stap 4.1.) of dezelfde kolom na een eerste wasstap (stap 4.2).</li>
	<li>Bereid de kolom voor op een nieuwe EV-scheidingsstap om zuiverdere EV's te verkrijgen. Als het een nieuwe kolom is, herhaalt u stap 2.1. en 2.2. Als het dezelfde kolom is, wast u de kolom met 2,5 ml 20% isopropanol en herhaalt u stap 2.1 en 2.2.</li>
	<li>Voeg 600 μL eerder geëlueerde EV's verkregen in stap 2.5 toe aan de kolom en gooi het geëlueerde volume weg. Wacht tot de vloeistof de kolom volledig binnenkomt voordat u doorgaat naar de volgende stap.</li>
	<li>Voeg 400 μL PBS toe en gooi al het geëlueerde volume weg. Wacht tot de vloeistof de kolom volledig binnenkomt voordat u doorgaat naar de volgende stap.</li>
	<li>Voeg 600 μL PBS toe en verzamel een fractie van 600 μL in een centrifugebuis van 1,5 ml. Gebruik de EV's en controlemonsters voor verdere analyses of bewaar ze 's nachts bij 4 oC.</li>
	<li>Sla de gebruikte kolommen op voor toekomstig gebruik.<ol>
<li>Was de kolom met 25 ml 20% isopropanol en gooi het geëlueerde volume weg. Was de kolom 3 keer met 2,5 ml PBS.</li>
		<li>Voeg de opslagbuffer toe die in stap 1.1.1 is verwijderd en wacht tot de buffer de kolom binnenkomt. Bedek de kolom met de dop en bewaar bij 4 oC tot het volgende gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ev-kwantificering
<ol><li>Bereid 1:1.000 verdunningen van het NTA-PL-EV-monster en het eerste PL-EV-monster voor zoals beschreven in de volgende twee stappen.<ol>
<li>Bereid 1 ml 1:10 verdunde NTA-PL-EV en 1 ml 1:10 verdunde initiële PL-EV met PBS gefilterd door een filter van 0,2 μm.</li>
		<li>Bereid 1 ml van een verdunning van 1:100 van de vorige verdunde monsters met PBS gefilterd door een filter van 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecteer het 1:1.000 verdunde NTA-PL-EV-monster of het eerste PL-EV-monster met behulp van een steriele spuit in de NTA-pomp. Volg de instructies en aanbevelingen van de fabrikant voor de bepaling van de deeltjesconcentratie en de grootteverdeling. OPMERKING: Aangezien de EV-concentratie afhankelijk is van het startvolume van het monster, kan het nodig zijn om tussentijdse verdunningen af te lezen en aanpassingen aan te brengen om een correcte NTA-bepaling te verkrijgen.</li>
</ol>5. EV's gebruikt als een behandeling voor ontstekingsgestuurde artrose
<ol><li>Was het kraakbeen tweemaal met PBS en snijd het onder steriele omstandigheden weg met een biopsiepons met een diameter van 3 mm. OPMERKING: Voer de procedure uit van stap 5.1 tot en met 5.6 in een celkweekkap.</li>
	<li>Plaats de explantaten in 96-well kweekplaten met DMEM-F12 medium aangevuld met 1% penicilline-streptomycine bij 37 oC, 5% CO2en 80% vochtigheid.<ol>
<li>Om een ontstekingsgestuurd OA-model vast te stellen, vult u het celkweekmedium aan met 10 ng / ml oncostatine M en 2 ng / ml tumornecrosefactor-alfa (TNFα).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Behandel de explantaten met 1 × 109 deeltjes/put van gelabelde EV's (PKH-PL-EV) of controle in celkweekmedium aangevuld met oncostatine M en TNFα. OPMERKING: Meet het volume van het monster dat 1 × 109 deeltjes/put bevat en gebruik hetzelfde volume voor de regeling.</li>
	<li>Verwijder het medium van de 96-well celkweekplaten met kraakbeenexplantaten. Voeg 200 μL van het celkweekmedium beschreven in stap 5.3 toe aan elk putje. OPMERKING: Als de 96-well platen in contact zijn geweest met foetaal runderserum (FBS), was dan elke put drie keer met 200 μL PBS om eventuele EV's uit de FBS te verwijderen.</li>
	<li>Stop de in vitro test op verschillende tijdstippen: 0, 1, 2, 3, 4 en 5 uur.</li>
	<li>Was de celkweekputten met de kraakbeenexplantaten tweemaal met 200 μL PBS.</li>
	<li>Voeg 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan het weefsel om het gedurende 3 uur bij 4 oC te fixeren. OPMERKING: Stappen met PFA moeten worden uitgevoerd in een zuurkast volgens de aanbevelingen van het veiligheidsinformatieblad.</li>
	<li>Verwijder de PFA, voeg 100 μL PBS toe, bewaar het vaste weefsel bij 4 °C en verwerk de monsters binnen 48 uur.</li>
</ol>6. Microscopie voorbereiding en visualisatie
OPMERKING: Deze histologische procedure bestaat uit uitdroging, paraffine-inbedding en rehydratatiestappen. Deze stappen kunnen de algehele kleurstoffluorescentie verminderen (een beperking die wordt vermeld in het gegevensblad voor PKH26). Daarom kunnen andere procedures, zoals bevroren secties, meer geschikt zijn voor EV-visualisatie door confocale microscopie.
<ol><li>Sluit de vaste weefsels in paraffineblokken in. Snijd het weefsel in 6 μm dikke delen.</li>
	<li>Deparaffiniseer de weefselsecties. OPMERKING: Alle stappen met xyleen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast.<ol>
<li>Dompel de weefselsecties gedurende 30 minuten onder in xyleen, 100% ethanol gedurende 2 minuten, 96% ethanol gedurende 2 minuten, 75% ethanol gedurende 1 minuut en ten slotte in gedestilleerd water gedurende 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabiliseer de weefselsecties.<ol>
<li>Bereid een 0,1% Triton-0,1% natriumcitraatoplossing om het weefsel te permeabiliseren. Voeg een druppel van 20 μL toe aan elk weefselgedeelte en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was elke sectie tweemaal met 20 μL PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg op een microscopisch kleine dia een druppel montagemedium toe met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) met een waterig montagemedium voor het behoud van de fluorescentie. Bedek de dia met 3 weefselsecties uit stap 6.3.1.</li>
	<li>Incubeer de dia's 's nachts bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Bewaren bij 4 °C, beschermd tegen licht tot confocale microscopie.</li>
</ol>

<ol><li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+synovium%2C+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li>
<li>Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+articular+cartilage+defects%3A+Focus+on+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li>
<li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li>
<li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li>
<li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li>
<li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).</li>
<li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li>
<li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li>
<li>Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+secreted+vesicles+and+intercellular+communications%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).</li>
<li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).</li>
<li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li>
<li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li>
<li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graefe%27s+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li>
<li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).</li>
<li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).</li>
<li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).</li>
<li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).</li>
<li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+carriers+of+microRNA%2C+proteins+and+lipids+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).</li>
<li>Ortega, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).</li>
<li>de Miguel Pérez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%2C+intracellular+sorting%2C+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li>
<li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+Current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).</li>
<li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029(2015).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li>
<li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li>
<li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li>
<li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

EV-beeldvorming helpt om EV-eigenschappen te begrijpen, zoals hun afgifte- en opnamemechanismen. Hun beeldvorming maakt het mogelijk om hun biodistributie te monitoren en hun farmacokinetische eigenschappen te karakteriseren als medicijnvoertuigen. EV-beeldvorming en -tracking kunnen echter moeilijk zijn vanwege hun kleine afmetingen, hoewel veel beeldvormingsapparaten en etiketteringstechnieken zijn ontwikkeld om onderzoekers te helpen EV's te volgen onder in vitro en in vivo omstandigheden<sup class="...

Artrose (OA) is een articulaire degeneratieve ziekte die een progressieve en onomkeerbare ontsteking en vernietiging van de extracellulaire matrix van het gewrichtskraakbeen impliceert1. Hoewel verschillende vormen van artritis tal van behandelingenhebben 2,3,4,worden deze beperkt door hun bijwerkingen en beperkte werkzaamheid. Tissue engineering technieken met behulp van autologe chondrocyten implantatie worden routinematig toegepast voor de regeneratieve behandeling van gewond kraakbeen in vroege OA kraakbeen laesies4. Celgebaseerde therapieën zijn voornamelijk beperkt vanwege het beperkte aantal fenotypisch stabiele chondrocyten of chondroprogenitors die in staat zijn om het kraakbeen effectief te repareren3. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om ziekteprogressie te voorkomen en grote kraakbeenlaesies te regenereren van het grootste belang.
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn voorgesteld als een behandeling voor artrose door verschillende auteurs5,6. EV's zijn vliezige lichamen die door de meerderheid van de celtypen worden uitgescheiden, zijn betrokken bij intercellulaire signalering en er is aangetoond dat ze de therapeutische effecten van stamcellen uitoefenen7,8,9, waardoor ze onlangs interesse hebben gewekt in regeneratieve geneeskunde10. EV's afgeleid van mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn de belangrijkste therapeutische EV's die zijn onderzocht voor artrose, hoewel andere gewrichtsgerelateerde cellen zijn gebruikt als EV-bronnen, bijvoorbeeld chondroprogenitors of immuuncellen11,12.
Bloedplaatjesconcentraten, zoals bloedplaatjeslysaten (PR's), worden gebruikt om de wondgenezing bij verschillende verwondingen te verbeteren, zoals hoornvlieszweren13,14,15 of bij peesweefselregeneratie16, vanwege de hypothese dat de EV-component van bloedplaatjesconcentraten verantwoordelijk kan zijn voor deze effecten17 . Sommige studies met betrekking tot gewrichtsgerelateerde ziekten gebruiken van bloedplaatjes afgeleide EV's (PL-EV's) als een behandeling om artroseaandoeningen te verbeteren. PL-EV's verbeteren de proliferatie en celmigratie van chondrocyten door de Wnt/β-catenineroute18te activeren, de expressie van chondrogene markers in artrose chondrocyten19te bevorderen of hogere niveaus van chondrogene eiwitten en minder tissulaire afwijkingen te vertonen bij artrosekonijnen die worden behandeld met PL-EV's18.
EV's bevatten eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die vrijkomen in de doelcel, waardoor cel-tot-cel communicatie tot stand wordt gebracht, wat het belangrijkste kenmerk is met betrekking tot hun therapeutische toepassingen20. De effecten van EV's zijn afhankelijk van hun bereikcellen en de daaropvolgende ladingafgifte. Dit effect kan indirect worden bevestigd door veranderingen in cellen, zoals metabole activiteit of genexpressiemodificatie. Deze methoden laten echter niet toe om te visualiseren hoe EV's cellen bereiken om hun functie uit te oefenen. Dit artikel presenteert dus een methode om deze PL-afgeleide EV's te labelen om te worden gebruikt als een behandeling voor ontstekingsgedreven OA-kraakbeenexplantaten. Confocale microscopie werd gebruikt om de EV-opname en progressie naar de chondrocyten in de explantaten te volgen in een time-lapse van 5 uur.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Centrifuge tube</td><td>SPL life sciences</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td><td>Bereidt op 20% met Milli-Q water</td></tr><tr><td>96-well culture plate</td><td>SPL life sciences</td><td>PLC30096</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol Pharmpur</td><td>Scharlab</td><td>ET0006005P</td><td>Gebruikt om 96% en 75% ethanol te bereiden met Milli-Q water</td></tr><tr><td>Biopsy Punch met zuiger 3 mm</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum&nbsp;Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Bereidt op 5% met PBS</td></tr><tr><td>Kraakbeen explanten</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentration tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>Concentration tube 500 &micro;L Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Ingebedde paraffine weefselblokken</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td>Tarief voor dienst</td></tr><tr><td>Exo-spin mini-HD kolommen</td><td>Cell guidance systems</td><td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 Microtome Blade</td><td>Feather</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &micro;m spuitfilter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield met DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td><td>Bereidt een stockoplossing tot een eindconcentratie van 0.1 &micro;g/&micro;L verdunnen in PBS-0.1% BSA</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18715.1000</td><td>Bereidt op 4% met PBS en bewaard bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine Oplossing 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit voor Algemene Celmembraan Labeling</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 en Dliuent C inbegrepen</td></tr><tr><td>Natriumcitraat dihydraat</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscoopglazen</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>R&amp;D systems</td><td>210-TA-005</td><td>Bereidt een stockoplossing tot een eindconcentratie van 0.01 &micro;g/&micro;L verdund in PBS-0.1% BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Gebruikt om een 0.1% Triton-0.1% natriumcitraat oplossing te bereiden met Milli-Q water</td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11 rotor</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td>Apparaat met ingebouwde laser bij &lambda;= 532 nm en sCMOS camera</td></tr><tr><td>Shandon Finesse 325 Manuele Microtome</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>A78100101</td><td></td></tr><tr><td>TCS-SPE confocale microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>5200000271</td><td></td></tr></tbody></table>

etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellulaire blaasjes (EV's) worden in verschillende onderzoeken gebruikt om hun potentieel als celvrije behandeling te bewijzen vanwege hun lading afgeleid van hun cellulaire bron, zoals bloedplaatjeslysaat (PL). Bij gebruik als behandeling wordt verwacht dat EV's de doelcellen binnendringen en een reactie hiervan bewerkstelligen. In dit onderzoek zijn PL-afgeleide EV's bestudeerd als een celvrije behandeling voor artrose (OA). Zo werd een methode opgezet om EV's te labelen en hun opname op kraakbeenexplantaten te testen. PL-afgeleide EV's worden gelabeld met de lipofiele kleurstof PKH26, tweemaal door een kolom gewassen en vervolgens getest in een in vitro ontstekingsgestuurd OA-model gedurende 5 uur na deeltjeskwantificering door nanodeeltjesvolganalyse (NTA). Elk uur worden kraakbeenexplantaten gefixeerd, geparaffined, in secties van 6 μm gesneden om op dia's te monteren en waargenomen onder een confocale microscoop. Dit maakt het mogelijk om te verifiëren of EV's tijdens deze periode de doelcellen (chondrocyten) binnendringen en hun directe effect analyseren.

Een schematisch overzicht voor EV-etikettering en opnamemonitoring is weergegeven in figuur 1. De deeltjesconcentratie en EV-grootte gedetecteerd door NTA in tabel 1 laten zien dat de EV-concentratie tijdens het proces afneemt als gevolg van de zuiveringsstap die tweemaal wordt uitgevoerd na etikettering met de kolom. De verkregen hoeveelheid ligt echter in het optimale bereik van het aantal deeltjes dat voor de behandeling moet worden gebruikt. Deze deeltjesconcentratie wor...

Hier presenteren we een protocol om van bloedplaatjes lysaat afgeleide extracellulaire blaasjes te labelen om hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten te volgen die worden gebruikt als een model voor artrose.

Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Met dit eenvoudige protocol kan men EV's labelen en monitoren via confocale microscopie. EV-beeldvorming kan bijvoorbeeld helpen bij het evalueren van EV-distributie bij gebruik in therapeutica. Met deze techniek kan men ev-migratie en opname in kraakbeenexplantaten eenvoudig volgen, met confocale microscopie zonder speciale functie.Hetzelfde protocol kan worden gebruikt voor EV's voor in vitro of in vivo experimenten. Zorg ervoor dat de kolommen van tevoren zijn voorbereid en dat het initiële volume EV's voldoende is om de gewenste uiteindelijke deeltjesconcentratie te bereiken, aangezien ongeveer 10% van de deeltjes verloren gaat tijdens de zuiveringsstap. Begin met het concentreren van het extracellulaire blaasje, of EV, monster en de controle.Plaats de monsters in een concentratiebuis van 15 milliliter of 500 microliter, afhankelijk van het startvolume van het EV-monster. Centrifugeer de buizen volgens de instructies van de fabrikant totdat een bijna droog monster is verkregen. Suspensie de geconcentreerde EV-monsters opnieuw met 200 microliter en de controlegroep met 100 microliter verdunningsmiddel C en breng ze over naar nieuwe centrifugebuizen van 1,5 milliliter.Scheid het EV-monster in twee aliquots van elk 100 microliter. Markeer een van de aliquots met kleurstof en gebruik het als behandeling. Laat de andere ongemarkeerd, maar verwerk het zoals het EV-monster en gebruik het om de EV-concentratie te kwantificeren door analyse van nanodeeltjes volgen.Bereid 2x kleurstofoplossing zodanig dat de resulterende concentratie van PKH26-oplossing in verdunningsmiddel C acht micromolair is. Meng één microliter PKH26-linker van één millimol per 125 microliter verdunningsmiddel C in het monster. Bereid het volume voor dat nodig is om aan de monsters toe te voegen in een verhouding van 1:1.Voeg 2x kleurstofoplossing toe aan van PKH-bloedplaatjeslysaat afgeleide EV's en controleer monsters in een verhouding van 1:1 om 1x kleurstofconcentratie en vier micromolaire PKH26-concentraties te bereiken. Voeg hetzelfde volume PBS toe aan het van NTA-bloedplaatjeslysaat afgeleide EV-monster. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg 5% runderserumalbumine-PBS-oplossing toe aan de monsters in een verhouding van 1:1 en zorg ervoor dat het uiteindelijke volume ongeveer 400 microliter is. Ga verder met het scheiden van de gelabelde EV's van de ongebonden kleurstof en niet-specifieke kleurstofinteracties met de kolom. Verwijder de dop van de kolom, voeg 400 microliter PKH-bloedplaatjeslysaat-afgeleide EV's, van NTA-bloedplaatjeslysaat afgeleide EV's toe of controleer en gooi alle geëlueerde vloeistof weg.Wacht tot het monster de kolom volledig heeft ingevoerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 600 microliter PBS toe en gooi alle geëlueerde vloeistof weg. Wacht tot de PBS de kolom volledig heeft ingevoerd voordat u doorgaat naar de volgende stap.Voeg 600 microliter PBS toe en verzamel een fractie van 600 microliter in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Herhaal voor een nieuwe kolom de stappen met betrekking tot de concentratie van de monsters die aan het begin van het protocol worden vermeld. Voeg 600 microliter eerder geëlueerde EV's toe aan de kolom en gooi het geëlueerde volume weg.Voeg vervolgens 400 microliter PBS toe en gooi alle geëlueerde volumes weg. Voeg 600 microliter PBS toe aan de kolom en verzamel een fractie van 600 microliter in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Was het kraakbeen twee keer met PBS en snijd het onder steriele omstandigheden weg met een biopsiepons met een diameter van drie millimeter.Plaats de explantaten in 96-well kweekplaten met DMEM-F12 medium, aangevuld met 1% penicilline streptomycine bij 37 graden Celsius, 5% CO2 en 80% vochtigheid. Om een ontstekingsgestuurd OA-model vast te stellen, vult u het celkweekmedium aan met 10 nanogram per milliliter oncostatine M en twee nanogram per milliliter tumornecrosefactor-alfa. Behandel de explantaten met 1 maal 10 tot de 9e deeltjes per putje van PKH-bloedplaatjeslysaat-afgeleide EV's, of controle, in celkweekmedium aangevuld met oncostatine M en tumornecrosefactor-alfa.Verwijder het medium van de 96-well celkweekplaten met kraakbeenexplantaten. Voeg 200 microliter van het celkweekmedium toe aan elke put zoals beschreven in het manuscript. Stop de in vitro test elk uur van nul tot vijf uur.Was de celkweekputten met het kraakbeen twee keer met 200 microliter PBS. Voeg 100 microliter 4% paraformaldehyde toe aan het weefsel om het drie uur lang bij vier graden Celsius te fixeren. Verwijder de PFA, voeg 100 microliter PBS toe, bewaar het vaste weefsel bij vier graden Celsius en verwerk de monsters binnen 48 uur.Beelden gemaakt op verschillende tijdstippen laten zien hoe EV's het weefsel binnendringen totdat ze de chondrocyten bereiken en na verloop van tijd de chondrocyten binnengaan. De gelabelde EV's waren na een uur incubatie al gelokaliseerd rond chondrocyten. Zorg ervoor dat het initiële volume ev's voldoende is om de gewenste uiteindelijke deeltjesconcentratie te bereiken.Een ander belangrijk ding om te onthouden is om de gelabelde EV's binnen de komende 24 uur te gebruiken. Als u het niet binnen 24 uur gebruikt, kan een afname van fluorescentie optreden. Deze techniek zal onderzoekers helpen om EV-beeldvorming te verbeteren en EV's in biologie en therapieën te bestuderen.

labeling-extracellular-vesicles-for-monitoring-migration-uptake

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Doel van de presentatie is om aan te tonen een zeer reproduceerbare methode om matrix geassocieerd stamcelimplantaten genereren in kraakbeen defecten, die kunnen worden gevisualiseerd met MRI. Stamcellen zijn gelabeld met de FDA-goedgekeurde Ferumoxides, vermengd met agarose, geïmplanteerd in letsels aan het kraakbeen en afgebeeld met een 7T MR-scanner.

Implantatie van Ferumoxides Gelabelde humane mesenchymale stamcellen in kraakbeenletsels

In this video, we demonstrate an assay to visualize and quantify the cellular uptake of extracellular vesicles or EVs. This assay utilizes 3D fluorescent imaging using a confocal microscope and allows for distinguishing internalized EVs from ones adhered to the cell surface.

Extracellular Vesicle Uptake Assay: A Method to Visualize and Quantify Cellular Uptake of Extracellular Vesicles Using 3D Fluorescence Imaging Technique

Dit protocol beschrijft een efficiënte manier om te controleren de cel persistentie en ook menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) door far-red fluorescentie labeling in een rat knie artrose (KOA) model via intra-articulaire (IA) injectie.

In Vivo Bijhouden van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen in een Rat knie artrose Model met fluorescerende lipofiele membraan kleurstof

In dit protocol beschrijven we de complete workflow voor snelle isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijk bloed en karakterisering van specifieke markers door fluorescentie-gebaseerde analyse van het nanoparticle-tracking. De gepresenteerde resultaten geven een hoge graad van reproduceerbaarheid en kunnen worden aangepast aan de cel cultuur supernatant.

Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Hier presenteren we een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van een 3D-bioreactor.

Grootschalige bereiding van synoviale vloeistof Mesenchymale stamcel-afgeleide exosomen door 3D Bioreactor Cultuur

We beschrijven een protocol om van macrofagen afgeleide kleine extracellulaire blaasjes te labelen met PKH-kleurstoffen en hun opname in vitro en in het ruggenmerg na intrathecale toediening te observeren.

Opname van fluorescerende gelabelde kleine extracellulaire blaasjes in vitro en in het ruggenmerg

Extracellulaire blaasjes (EV's) dragen bij aan cellulaire biologie en intercellulaire communicatie. Er is behoefte aan praktische testen om de opname van EV's door de cellen te visualiseren en te kwantificeren. Het huidige protocol stelt de EV-opnametest voor door gebruik te maken van driedimensionale fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie, na EV-isolatie door een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat.

Extracellulaire vesikelopnametest via confocale microscoopbeeldvormingsanalyse

Het huidige protocol beschrijft een methode om extracellulaire blaasjes uit het perifere bloed en vaste weefsels te extraheren met daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen.

Isolatie en analyse van traceerbare en gefunctionaliseerde extracellulaire blaasjes uit het plasma en vaste weefsels

Dit protocol beschrijft de differentiële centrifugatie voor het isoleren en karakteriseren van representatieve EV's (exosomen en microvesicles) uit gekweekte menselijke MSC's. Verdere toepassingen van deze EV's worden in dit artikel ook toegelicht.

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het sorteren van extracellulaire blaasjes (EV's) die vrijkomen door mesenchymale stromale cellen. Het richt zich met name op de instelling van het instrument en de optimalisatie van de sorteeromstandigheden. Het doel is om extracellulaire blaasjes te sorteren met behoud van hun kenmerken.

Een succesvolle sortering instellen voor extracellulaire isolatie van blaasjes

Leer hoe je extracellulaire blaasjes labelt en hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten monitort met confocale microscopie. Deze methode is waardevol voor onderzoek naar osteoartritis en therapeutische toepassingen.

Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten

Meer video's verkennen