Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie
August 9th, 2021
Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie en de daaropvolgende karakterisering van cellulaire subsets op standaard flowcytometrische platforms.
Dit protocol lost veelvoorkomende uitdagingen op die worden ervaren met sputumverwerking die het in het verleden moeilijk hebben gemaakt om te gebruiken met flowcytometrie voor klinische diagnostische doeleinden met hoge doorvoer. Dit protocol is ontworpen om tijd te besparen door het sputumgewicht te gebruiken om antilichaam- en kleuringsvolumes te bepalen. Tijdens de kleuringsincubatie kan het celgetal worden uitgevoerd voor de stroomafwaartse stappen.
Het is belangrijk om een nauwkeurig celgetal te bereiken om het juiste re-suspensievolume te bepalen om problemen bij het uitvoeren op de flowcytometer te voorkomen. Dit protocol kan inzicht geven in onderzoeksgebieden die de gezondheid van de longen onderzoeken. Zo zouden ziekten als COPD, astma, longkanker of de effecten van COVID bestudeerd kunnen worden.
De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Michael Lai, een onderzoeks- en ontwikkelingswetenschapper uit mijn laboratorium. Weeg om te beginnen het sputummonster om de volumes dissociatiereagentia te bepalen. Breng het monster over in het vat van de juiste grootte op basis van het sputumgewicht en voeg vervolgens één milliliter per gram 0,5% NAC en vier milliliter per gram 0,1% DTT toe.
Vortex de monsters op maximale snelheid gedurende 15 seconden en rock op maximale snelheid gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verdun dit monster met 4X Hanks gebalanceerde zoutoplossing of HBSS om de NAC en DTT te neutraliseren. En na snel vortexen, rock het monster op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
Filter celsuspensie door een 100 micrometer nylon mesh celzeef in een of meer conische centrifugebuizen van 50 milliliter om een eencellige suspensie te creëren. Pellet de cellen naar beneden. Na het aanzuigen van het supernatant, combineer pellets in één conische buis van 15 milliliter en was met HBSS onder dezelfde omstandigheden.
Resuspend de celkorrel in een volume buffer dat wordt bepaald door het begingewicht van het sputummonster. Neem een aliquot uit de celsuspensie en meng 10 microliter van de sputumverdunning met 30 microliter van 0,4% trypan blauw en laad vervolgens in de telkamers van een hemocytometer voor een levend / dood celgetal. Label sputum in compensatiebuizen.
Voeg HBSS-antilichaam en kleurstof toe aan elke sputumcelbuis en compensatiebuizen zoals aangegeven in de tekst. Voeg de sputumcellen toe aan de testbuizen en voeg compensatieparels toe aan de compensatiebuizen zoals vermeld in de tekst. Incubeer alle buizen op ijs beschermd tegen licht gedurende 35 minuten.
Centrifugeer vervolgens na het vullen van de buizen met ijskoude HBSS gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op 800 keer G.Voor compensatiebuizen, zuig het supernatant zo dicht mogelijk bij de pellets aan en veeg de pellets om los te maken. Voeg vervolgens 0,5 milliliter koude HBSS toe aan de compensatiebuizen en bewaar de buizen op het ijs in een lichtbeschermd gebied totdat het nodig is voor flowcytometrie-analyse. Aspiraleer vervolgens het supernatant uit de onbevlekte, isotype-, bloed- en epitheelbuizen.
Maak de pellets los door de buizen te draaien. Voeg twee milliliter van 1% PFA toe aan de onbevlekte en isotypebuizen en 10 milliliter aan de bloed- en epitheelbuizen. Incubeer de buizen op ijs op een lichtbeschermde manier gedurende 30 minuten, vortex dan snel op maximale snelheid en incubaleer opnieuw gedurende nog eens 30 minuten.
Vul vervolgens de buisjes met ijskoude HBSS. Centrifugeer vervolgens de buizen bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 1.600 keer G.Aspirateer zoveel mogelijk bovennatuurlijk mogelijk zonder de celkorrel te verstoren en veeg met de vingers over de buis om de cellen los te maken en voeg vervolgens 200 microliter koude HBSS toe aan de niet-gekleurde en isotypebuizen. Bereken en voeg het vereiste volume HBSS toe voor resuspensie van het bloed en de epitheelbuis volgens het totale celgetal.
Bewaar alle monsters in compensatiebuizen beschermd tegen licht op het ijs bij vier graden Celsius totdat flowcytometrie-analyse is uitgevoerd. Pas de juiste opstartprocedures toe voor de gebruikte flowcytometer. Gebruik het mengsel van National Institute of Standards and Technology of NIST-kralen om ervoor te zorgen dat voorwaartse strooi- en zijverstrooiingsspanningen worden ingesteld om de NIST-kralen te plaatsen om het perceel te overspannen zonder de kralen te dicht bij de assen te plaatsen.
Stel het debiet in op gemiddeld voor LSRII of hoog voor Navios EX. Pas de spanningen aan voor elke parameter die wordt gebruikt voor de scatter- en fluorescentieparameters om de celpopulaties op schaal te plaatsen. Gebruik de cijfers met de gating-strategie als leidraad om de spanningen dienovereenkomstig aan te passen. Verkrijg eerst gegevens voor het niet-gekleurde sputummonster, gevolgd door het isotype bevlekte monster en vervolgens de bloedbuis en de epitheelbuis.
Sputumgewicht werd gebruikt om antilichaam- of kleurstofvolumes voor kleuring te bepalen. De correlatie tussen sputumgewicht en celopbrengst was niet sterk. Sputummonsters werden verdeeld in vier gewichtscategorieën, die zich clusterden in de verdeling van de celopbrengst.
Elk gebruikt antilichaam werd getitreerd in een concentratie op de plateaufase met de hoogste kleuringsindex als werkconcentratie. In alle gewichtscategorieën was de gemiddelde SEC-besmetting minder dan 20%, waarbij het percentage levensvatbare cellen werd getoond. Gepresenteerd is de gating-strategie die wordt gebruikt voor analyse.
NIST-kralen werden gebruikt om een poort in te stellen die op het sputummonster werd aangebracht om puin te verwijderen. Klein puin werd verder geëlimineerd door de breedtepoort. Levensvatbaarheidskleurstof werd gebruikt om dode cellen te elimineren, terwijl de singletpoort doubletten verwijderde.
De anti-CD45 antilichaam labeling maakte de scheiding van levende enkele sputumcellen in een bloedcel en een niet-bloedcelcompartiment mogelijk. De profielen verkregen van Navios EX, LSRII en Lyric werden vergeleken. De gating-strategie voor het elimineren van puin, dode cellen, doubletten en het vergelijken van bloed- en niet-bloedprofielen wordt getoond.
Deze techniek stelde ons in staat om deze methoden toe te passen om het risico op longkanker op te sporen voor gebruik als een niet-invasieve klinische test.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol lost veelvoorkomende uitdagingen op die worden ervaren met sputumverwerking, waardoor het gebruik ervan met flowcytometrie voor hoogdoorvoer klinische diagnostiek wordt vergemakkelijkt. Het benadrukt het belang van nauwkeurige celtelling en re-suspensievolume voor succesvolle flowcytometrieanalyse.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Flow Cytometrie
- Celbiologie
- Longgezondheidsonderzoek
Achtergrond
- Sputumverwerking heeft historisch gezien uitdagingen opgeleverd voor flowcytometrie.
- Nauwkeurige celtellingen zijn cruciaal voor effectieve analyse.
- Onderzoeksgebieden omvatten COPD, astma, longkanker en COVID-19.
- Dit protocol heeft tot doel sputumanalyse voor klinische diagnostiek te stroomlijnen.
Doel van de studie
- Om een efficiënte methode te bieden voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie.
- Om cellulaire subsets te karakteriseren met behulp van standaard flowcytometrische platforms.
- Om onderzoek naar longgezondheid en gerelateerde ziekten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bepalen van antilichaam- en kleurstofkleuringsvolumes op basis van sputumgewicht.
- Uitvoeren van celtellingen tijdens kleuringsincubatie.
- Gebruikmaken van flowcytometrie voor downstreamanalyse.
- Karakteriseren van cellulaire subsets voor onderzoeksinzichten.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol dissocieert sputum succesvol in enkele celsuspensies.
- Nauwkeurige celtellingen worden bereikt, wat effectieve flowcytometrie mogelijk maakt.
- Inzichten in longgezondheid en ziektemechanismen worden geboden.
- De gestroomlijnde proces verbetert de klinische diagnostische capaciteiten.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor sputumanalyse.
- Het lost eerdere uitdagingen op bij sputumverwerking voor flowcytometrie.
- De bevindingen ondersteunen verder onderzoek naar longgerelateerde ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in lung disease research by enabling high-throughput, quantitative analysis of sputum via flow cytometry. It transforms a traditionally low-yield, labor-intensive cytology method into a scalable, reproducible platform suitable for biomarker discovery and target validation in respiratory therapeutics. The approach supports mechanistic de-risking by providing immunophenotypic resolution of hematopoietic and epithelial lineages while excluding confounding debris and squamous epithelial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular heterogeneity in lung microenvironment to validate therapeutic targets in inflammatory and oncologic pathways.
- Operational Value: Reduces reliance on specialized cytopathology personnel through automated, standardized phenotyping.
- Predictive Value: Supports target confidence by quantifying immune cell infiltration and epithelial activation states relevant to COPD, asthma, lung cancer, and post-COVID lung pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts of CD45+ and CD45− populations for assay standardization across drug screening campaigns.
- Operational Value: Enables high-throughput sample processing using weight-based reagent normalization, improving reproducibility across sites and operators.
- Platform Reuse: Demonstrated compatibility across Navios EX, LSR II, and Lyric cytometers, supporting cross-platform assay transfer and centralized core lab utilization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses lung-specific macrophage identification as a quality control to confirm sample origin, enhancing confidence in preclinical-to-clinical continuity.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal monitoring of immune and epithelial shifts in disease models, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
- Predictive Confidence: Provides a biomarker-ready framework for evaluating target engagement in pulmonary inflammation or tumor microenvironment modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized immune profiling of lung-derived samples, supporting hypothesis testing in early discovery and mechanistic validation in preclinical stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of lung immune landscapes and stromal interactions in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular readouts suitable for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Generates multiparametric flow cytometry data enabling statistical comparison of treatment effects across experimental groups.
- Translational Research: Supports biomarker alignment through lineage-specific gating and viability-based exclusion of nonviable or contaminating cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, weight-normalized workflow that can be deployed across multiple sites and instrument platforms for consistent data generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from debris and squamous epithelial contamination.
- Operational Value: Improves throughput and reproducibility via sputum weight-based reagent dosing and standardized gating strategies.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions in respiratory drug programs by providing quantifiable immune and epithelial phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating translatable biomarker data from non-invasive lung samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, gating, and immunophenotyping of primary human cells.
- Dependent on access to flow cytometers with adequate fluorescence detection and scatter resolution.
- Necessitates standardization of staining protocols and QC metrics (e.g., NIST bead normalization) across sites.
- Requires adaptation of antibody panels based on target biology while maintaining viability and singlet gating.
- Limited by sample quality and sputum viscosity, which may affect dissociation efficiency and cell yield.
