Name: Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Leer een gestroomlijnde methode voor sputumverwerking door flowcytometrie voor longgezondheidsonderzoek. Dit protocol verbetert celanalyse voor COPD, astma en longkankerstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen David Rodriguez bedanken voor zijn hulp bij de figuurvoorbereiding. Sputummonsters werden uitgevoerd op de BD LSR II in de UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, ondersteund door UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC bij UT Health) en UL1 TR001120 (CTSA-subsidie).

Alle stappen van de sputumverwerking worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
1. Reagensvoorbereiding voordat met sputumdissociatie wordt begonnen
<ol><li>Ontdooi 1% paraformaldehyde (PFA), 25 ml per monster op ijs en houd koud tot gebruik. LET OP: PFA is giftig bij inademing en huidcontact. Bereid het fixeermiddel volgens de instructies van de fabrikant en vries het tot gebruik in bij -20 °C in 25 ml aliquots.</li>
	<li>Benader het gewicht van het monster en ontdooi voldoende 0,1% Dithiothreitol (DTT) voor stap 2.2 en breng het op 37 °C. (Aliquots van DTT moeten vóór gebruik bij -20 °C worden bewaard.)</li>
	<li>Breng voldoende 0,5% N-acetyl- L-cysteïne (NAC) tot 37 °C voor stap 2.2. (NAC moet wekelijks vers worden gemaakt en vóór gebruik bij 4 °C worden bewaard.)</li>
</ol>2. Sputumdissociatie
<ol><li>Weeg het sputummonster om de volumes dissociatiereagentia te bepalen. OPMERKING: Een monster wordt als klein beschouwd als het begingewicht ≤3 g is, gemiddeld als >3 g maar ≤8 g, groot als >8 maar ≤16 g, en extra groot als een monster >16 g weegt. De indicaties small, medium, large en extra-large worden in het hele protocol gebruikt. De hoeveelheid reagentia die nodig is voor dissociatie en etikettering verschilt afhankelijk van de grootte van het sputummonster.</li>
	<li>Breng een klein monster over naar een schone conische buis van 50 ml, een medium monster naar een schone plastic wegwerpfles van 250 ml of een groot en extra groot monster naar een schone plastic wegwerpfles van 500 ml. Voeg 1 ml/g monstergewicht van 0,5% NAC en 4 ml/g monstergewicht van 0,1% DTT toe.</li>
	<li>Vortex op maximale snelheid (gedurende 15 s) en vervolgens rocken bij kamertemperatuur (op maximale snelheid) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Verdun het monster met vier volumes Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (gebaseerd op het totale volume monster + reagentia) om de NAC en DTT te neutraliseren; vortex snel op maximale snelheid en gesteente bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op maximale snelheid.</li>
	<li>Filtreer de celsuspensie door 100 μm nylon mesh celzeef(en) in een of meer conische centrifugebuizen van 50 ml om een eencellige suspensie te creëren.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant op, combineer alle pellets in één conische buis van 15 ml en was de pellets vervolgens met HBSS onder dezelfde omstandigheden.</li>
	<li>Resuspend de celkorrel in een volume buffer dat wordt bepaald door het begingewicht van het sputummonster. OPMERKING: Een klein monster wordt geresuspendeerd in 250 μL HBSS. Een mediummonster wordt geresuspendeerd in 760 μL HBSS. Grote en extra grote monsters worden geresuspendeerd in 1460 μL HBSS.</li>
	<li>Neem een aliquot van de celsuspensie voor een levend/dood celgetal met Trypan Blue. OPMERKING: Gebruik voor een klein monster 5 μL. Gebruik voor een medium, groot of extra groot monster 10 μL. Verdun 1:10 met HBSS.<ol>
<li>Meng 10 μL van de sputumverdunning met 30 μL 0,4% Trypan Blue om een uiteindelijke monsterverdunning van 1:40 te bereiken. Laad in de telkamers van een hemocytometer voor een celtelling. OPMERKING: Het kan nodig zijn om de uiteindelijke verdunning aan te passen als de celaantallen te laag of te hoog zijn om een nauwkeurige telling te bereiken. Het raadplegen van Guiot et al.20 voor het correct onderscheiden van sputumcellen van SECs en puin wordt hier sterk aanbevolen. Dit is essentieel voor een nauwkeurig celgetal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder uit het extra grote monster 50 x 106 cellen uit het totaal en voeg toe aan een nieuwe buis met voldoende toegevoegde HBSS om een totaal volume van 1700 μL te creëren. OPMERKING: Beschouw dit als een grote steekproef voor de rest van het protocol. Overgebleven monsters kunnen worden weggegooid of voor andere doeleinden worden gebruikt.</li>
</ol>3. Antilichaam en levensvatbaarheid kleurstof kleuring
<ol><li>Keuze van antilichaam en kleurstof OPMERKING: Tabel 1 toont de antilichamen en levensvatbaarheidskleurstof die in dit protocol worden gebruikt en de celpopulaties die zij identificeren.<ol>
<li>Label de buisjes met de sputumcellen (zie tabel 2 voor etiketten).</li>
		<li>Gebruik 5 ml flowcytometriebuizen (compatibel met de gebruikte flowcytometer) voor de monsterbuis met de niet-gekleurde cellen en de buis met de isotypecontrole. Gebruik 15 ml conische buizen voor de bloed- en epitheliale buismonsters. OPMERKING: Deze monsters worden overgebracht naar flowcytometriebuizen na antilichaamkleuring en -fixatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label de compensatiebuizen (tabel 3). OPMERKING: Gebruik 5 ml flowcytometriebuizen die compatibel zijn met de gebruikte flowcytometer.</li>
	<li>Voeg de hoeveelheid HBSS, antilichaam en/of kleurstof toe aan elk van de sputumcelbuizen en compensatiebuizen zoals aangegeven in respectievelijk tabel 2 en tabel 3. OPMERKING: Voeg buffer (HBBS), antilichamen en kleurstof toe aan alle buizen voordat u cellen of compensatieparels toevoegt om ervoor te zorgen dat de kleuringstijd van alle buizen consistent is.</li>
	<li>Voeg de in tabel 2 vermelde hoeveelheden sputumcelvolume toe aan de testbuizen.</li>
	<li>Voeg compensatieparels toe aan de compensatiebuizen zoals vermeld in tabel 3.</li>
	<li>Incubeer alle buizen (assay- en compensatiebuizen) op ijs, beschermd tegen licht, gedurende 35 minuten. Vul vervolgens de buizen met ijskoud HBSS en centrifugeer bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 800 x g.</li>
	<li>Zuig voor de compensatiebuizen het supernatant zo dicht mogelijk bij de pellets aan en veeg de pellets los om los te maken.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml koude HBSS toe aan de compensatiebuizen, bewaar ze op het ijs bij 4 °C en bescherm ze tegen licht totdat ze nodig zijn voor flowcytometrie-analyse.</li>
	<li>Zuig het supernatant na centrifugering (stap 3.6 van de antilichaamkleuringssectie) uit de onbevlekte isotype-, bloed- en epitheelbuizen en maak de pellets los door de buizen te vegen.</li>
</ol>4. Fixatie met 1% paraformaldehyde (PFA)
<ol><li>Voeg koude 1% PFA (die inmiddels ontdooid zou moeten zijn) toe aan de onbevlekte, isotype-, bloed- en epitheliale buizen; 2 ml naar de onbevlekte en isotypebuizen en 10 ml naar de bloed- en epitheelbuizen.</li>
	<li>Incubeer de buizen op ijs, beschermd tegen licht gedurende 1 uur. Vortex snel op maximale snelheid na 30 min.</li>
	<li>Vul de tubes met ijskoude HBSS. Centrifugeer vervolgens buizen bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 1600 x g.</li>
	<li>Adem zoveel mogelijk bovennatuurlijk mogelijk op zonder de celkorrel te verstoren en veeg met de vingers over de buis om de cellen los te maken.</li>
	<li>Voeg 200 μL koude HBSS toe aan de ongevlekte en isotypebuizen.</li>
	<li>Bereken het volume HBSS voor resuspensie van het bloed en de epitheelbuis volgens het totale celgetal. OPMERKING: Resuspensievolume = 0,15 x [totaal celgetal (stap 8 van sputumdissociatie) / 106]. Gebruik 50 x 106 als celgetal voor een extra groot monster.</li>
	<li>Bewaar alle monsters en compensatiebuizen, beschermd tegen licht op het ijs bij 4 °C totdat de flowcytometrieanalyse is uitgevoerd. OPMERKING: Dit protocol is niet langer dan 24 uur getest voor opslag.</li>
</ol>5. Gegevensverzameling op de flowcytometer
<ol><li>Pas de juiste opstartprocedures toe voor de gebruikte flowcytometer. OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol gaat ervan uit dat de persoon die de flowcytometer bedient, is getraind in het gebruik van het instrument dat voor hen beschikbaar is, met name met betrekking tot dagelijkse procedures, waaronder het controleren van de stabiliteit van de optica- en fluidics-systemen, technieken voor het standaardiseren van lichtverstrooiing en fluorescentie-intensiteit, evenals het berekenen en toepassen van de juiste compensatiematrix.</li>
	<li>Gebruik het mengsel van NIST-kralen (National Institute of Standards and Technology) om ervoor te zorgen dat voorwaartse verstrooiings- en zijverstrooiingsspanningen zijn ingesteld om de NIST-kralen te plaatsen om het hele perceel te overspannen zonder de kralen te dicht bij de assen te plaatsen. OPMERKING: Deze stap is cruciaal om ervoor te zorgen dat vuil kleiner dan 5 μm kan worden geëlimineerd door gating post-acquisitie analyse. Afhankelijk van de gebruikte flowcytometer, moet u er rekening mee houden dat de kleinste kralen niet worden uitgesloten met de drempel (bij gebruik van de LSR II of de Lyric) of met de hoge discriminator (met behulp van de Navios EX flowcytometer). Voor de Navios EX werd een versterking van 2 gebruikt voor de voorwaartse en zijverstrooiing, een spanning van 236 voor voorwaartse spreiding en 250 voor zijverstrooiing. Voor de LSR II werd een voorwaartse verstrooiingsspanning van 165 en een zijdelingse verstrooiingsspanning van 190 gebruikt.</li>
	<li>Stel het debiet in op gemiddeld (LSR II) of hoog (Navios EX). OPMERKING: Het gemiddelde of hoge debiet voor de meeste instrumenten kan worden gebruikt om de sputumbuizen te verkrijgen. Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van een te lage stroomsnelheid of te verdunning van het monster ertoe kan leiden dat de cellen bezinken, wat resulteert in verhoogde vortexing die niet gewenst is. Daarom moet het vasthouden aan het berekende resuspensievolume in stap 4.6 resulteren in cellulaire dichtheid die snel kan worden verkregen, maar de machine niet verstoppen.</li>
	<li>Pas de spanningen aan voor elke parameter die wordt gebruikt voor de scatter- en fluorescentieparameters om de celpopulaties op de schaal te plaatsen. Gebruik de cijfers met de gating-strategie als leidraad voor het aanpassen van de spanningen. OPMERKING: Zorg ervoor dat alle benodigde parameters vóór de acquisitie zijn geselecteerd in het parameterselectievenster, anders worden er geen gegevens verzameld.</li>
	<li>Verkrijg eerst gegevens voor het niet-gekleurde sputummonster, gevolgd door het isotype-gekleurde monster en vervolgens de bloedbuis en de epitheelbuis. OPMERKING: Als de celsuspensie te geconcentreerd is om de flowcytometer in staat te stellen de monsters zonder verstopping uit te voeren, kunnen de monsters verder worden verdund met HBSS.</li>
</ol>

Alle auteurs zijn voormalige of huidige medewerkers van bioAffinity Technologies.

De cellulaire inhoud van sputum omvat een grote verscheidenheid aan brede cellen, vaak vergezeld van veel puin37. Bovendien vereist sputumanalyse een kwaliteitscontrole die bevestigt dat het monster wordt verzameld uit de long in plaats van de mondholte38. Daarom is het niet zo eenvoudig om sputum te analyseren door flowcytometrie als voor bijvoorbeeld bloed, dat een veel schonere en homogene celsuspensie vrijgeeft. Dit protocol heeft al deze problemen aangepakt: het bieden...

Technische vooruitgang in de hardware en software van flowcytometers heeft het mogelijk gemaakt om veel verschillende celpopulaties tegelijkertijd te identificeren1,2,3,4. Het gebruik van de flowcytometer in hematopoëtisch celonderzoek heeft bijvoorbeeld geleid tot een veel beter begrip van het immuunsysteem2 en de cellulaire hiërarchie van het hematopoëtische systeem5, evenals het diagnostische onderscheid van een veelheid aan verschillende bloedkankers6,7,8. Hoewel de meeste sputumcellen van hematopoëtische oorsprong zijn9,10,11, is flowcytometrie niet op grote schaal toegepast op sputumanalyse voor diagnostische doeleinden. Verschillende studies suggereren echter dat de evaluatie van immuuncelpopulaties in sputum (de belangrijkste subset van cellen) van grote hulp kan zijn bij het diagnosticeren en / of monitoren van ziekten zoals astma en chronische obstructieve longziekte (COPD)12,13,14,15. Bovendien maakt het bestaan van epitheliale specifieke markers die kunnen worden gebruikt in flowcytometrie de ondervraging van de volgende belangrijkste subset van cellen in sputum, longepitheelcellen mogelijk.
Naast het vermogen om veel verschillende celpopulaties van verschillende weefseloorsprongen te analyseren, kan een flowcytometer grote aantallen cellen in een relatief korte periode evalueren. Ter vergelijking: op dia's gebaseerde, cytologische soorten analyses vereisen vaak zeer gespecialiseerd personeel en / of apparatuur. Deze analyses kunnen arbeidsintensief zijn, wat ertoe leidt dat slechts een deel van het sputummonster wordt geanalyseerd16.
Drie kritieke problemen beperken het wijdverbreide gebruik van sputum in flowcytometrie. Het eerste probleem heeft betrekking op het verzamelen van sputum. Sputum wordt verzameld door middel van een hoest die slijm uit de longen in de mondholte verdrijft en vervolgens in een verzamelbeker spuugt. Omdat het slijm door de mondholte reist, is er een grote kans op SEC-besmetting. Deze verontreiniging bemoeilijkt de monsteranalyse, maar het probleem kan gemakkelijk worden verholpen op een flowcytometrisch platform, zoals blijkt uit deze studie.
Niet iedereen kan spontaan sputum produceren; daarom zijn er verschillende apparaten ontwikkeld om te helpen bij het verzamelen van sputum op een niet-invasieve manier17. De vernevelaar is zo'n apparaat en er is aangetoond dat het betrouwbare sputummonsters produceert18,19,20. Hoewel de vernevelaar een zeer effectieve manier is om sputum niet-invasief te verzamelen, vereist het gebruik ervan nog steeds een instelling in een medische faciliteit met gespecialiseerd personeel21. Handheld-apparaten zoals de longfluit22,23,24 en de acapella16,25 kunnen daarentegen thuis worden gebruikt omdat ze zeer gebruiksvriendelijk zijn. Deze hulpmiddelen zijn zowel veilig als kosteneffectief.
Voor ons gaf de acapella consistent betere resultaten dan de longfluit16, en daarom is het acapella-apparaat gekozen voor sputumcollecties. Er werd besloten tot een 3-daags verzamelmonster omdat het primaire doel voor het gebruik van sputum het ontwikkelen van een longkankerdetectietest16 is. Het is aangetoond dat een 3-daagse steekproef de kans op detectie van longkanker verhoogt in vergelijking met een 1- of 2-daagse steekproef26,27,28. Andere methoden voor het verzamelen van sputum kunnen echter de voorkeur hebben voor verschillende doeleinden. Als een andere sputumverzamelingsmethode wordt gebruikt dan de hier beschreven methode, wordt aanbevolen om elk antilichaam of kleurstof dat wordt gebruikt voor flowcytometrische analyse zorgvuldig te titreren; er zijn zeer weinig gegevens beschikbaar over hoe verschillende sputumverzamelingsmethoden de beoogde eiwitten voor flowcytometrie beïnvloeden.
Het tweede probleem dat het enthousiasme voor het gebruik van sputum voor diagnostiek, voornamelijk gerelateerd aan flowcytometrie, dempt, is het celnummer. Het probleem is het verzamelen van voldoende levensvatbare cellen voor een betrouwbare analyse. Twee studies toonden aan dat sputummonsters verzameld door niet-invasieve methoden, met behulp van een hulpmiddel, voldoende levensvatbare cellen bevatten die kunnen worden gebruikt in klinische diagnose- of onderzoeksstudies16,24. Geen van deze studies ging echter in op de kwestie van celaantallen met betrekking tot flowcytometrie.
Voor de studies die de basis vormen voor dit protocol, werden sputummonsters verzameld van deelnemers met een hoog risico op het ontwikkelen van longkanker volgens goedgekeurde institutionele richtlijnen voor elke onderzoekslocatie. Deelnemers met een hoog risico werden gedefinieerd als tussen 55-75 jaar, 30 pakjaren gerookt en niet gestopt met roken in de afgelopen 15 jaar. Patiënten kregen te zien hoe ze het acapella-apparaat moesten gebruiken volgens de instructies van de fabrikant29 en verzamelden sputum gedurende drie opeenvolgende dagen thuis. Het monster werd tot de laatste verzameling in de koelkast bewaard. Op de laatste ophaaldag werd het monster 's nachts met een bevroren coldpack naar het laboratorium verscheept. De monsters werden verwerkt tot een enkele celsuspensie op de dag dat ze werden ontvangen. Met deze methode van sputumverzameling worden meer dan voldoende levensvatbare cellen verkregen voor een betrouwbare flowcytometrische analyse.
Ten slotte, en gerelateerd aan de vorige kwestie van het celnummer, is de vraag hoe de sputumcellen uit zijn mucineuze omgeving kunnen worden bevrijd. Hoe kunnen de cellen levensvatbaar worden gehouden en een enkele celsuspensie creëren die de flowcytometer niet verstopt? Gebaseerd op het eerste werk van Pizzichini et al.30 en Miller et al.31, beschrijft dit protocol een eenvoudige en betrouwbare methode voor sputumverwerking tot een enkele celsuspensie die geschikt is voor flowcytometrische analyse. Deze methode heeft gevestigde richtlijnen in flowcytometrie32,33,34 gebruikt om een efficiënte antilichaametiketteringsstrategie te ontwikkelen om hematopoëtische en epitheelcellen in sputum te identificeren en instrumentinstellingen, kwaliteitscontrolemaatregelen en analyserichtlijnen te bieden die sputumanalyse standaardiseren op een flowcytometrisch platform.

<table><tbody><tr><td>1% Paraformaldehyde Flow-Fix</td><td>Polysciences</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische falconbuis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti-human CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti-human CD3</td><td>BioLegend</td><td>300415</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti-human cytokeratine</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 PanCK, CD3 en CD19 Isotype</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 anti-human CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>CD66b FITC isotype</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>CompBead Plus Compensatiekralen</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>Corning Polystyrene wegwerpbare steriele fles 250 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-4</td><td></td></tr><tr><td>Corning Polystyrene wegwerpbare steriele fles 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS&amp;T kralen</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-human CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>FlowSet</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NIST Beads, 05 &mu;M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>NIST Beads, 20 &mu;M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>NIST Beads, 30 &mu;M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human CD45</td><td>BioLegend</td><td>304039</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 anti-human EpCAM</td><td>BD Biosciences</td><td>565399</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td><td>BD Biosciences</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>PE-CR594 anti-human CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat dihydraat</td><td>EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw oplossing, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Sputum, veel gebruikt om de cellulaire inhoud en andere micro-omgevingskenmerken te bestuderen om de gezondheid van de long te begrijpen, wordt traditioneel geanalyseerd met behulp van cytologie-gebaseerde methodologieën. Het nut ervan is beperkt omdat het lezen van de dia's tijdrovend is en zeer gespecialiseerd personeel vereist. Bovendien maakt uitgebreid puin en de aanwezigheid van te veel plaveiselepitheelcellen (SECs), of wangcellen, een monster vaak ongeschikt voor diagnose. Flowcytometrie daarentegen maakt fenotypering met hoge doorvoer van cellulaire populaties mogelijk, terwijl tegelijkertijd puin en SECs worden uitgesloten.
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om sputum te dissociëren in een enkele celsuspensie, antilichaamkleuring en cellulaire populaties te fixeren en monsters te verkrijgen op een flowcytometrisch platform. Een gating-strategie die de uitsluiting van puin, dode cellen (inclusief SECs) en celdubbelts beschrijft, wordt hier gepresenteerd. Verder legt dit werk ook uit hoe levensvatbare, enkele sputumcellen kunnen worden geanalyseerd op basis van een cluster van differentiatie (CD)45 positieve en negatieve populaties om hematopoëtische en epitheliale afstammingssubsets te karakteriseren. Een kwaliteitscontrolemaatregel wordt ook geleverd door longspecifieke macrofagen te identificeren als bewijs dat een monster is afgeleid van de long en geen speeksel is. Ten slotte is aangetoond dat deze methode kan worden toegepast op verschillende cytometrische platforms door sputumprofielen van dezelfde patiënt te verstrekken die op drie flowcytometers zijn geanalyseerd; Navios EX, LSR II en Lyric. Bovendien kan dit protocol worden gewijzigd om extra cellulaire markers van belang op te nemen. Een methode om een volledig sputummonster te analyseren op een flowcytometrisch platform wordt hier gepresenteerd dat sputum geschikt maakt voor het ontwikkelen van high-throughput diagnostiek van longziekte.

Dit protocol is ontwikkeld met een klinische laboratoriumomgeving in het achterhoofd. De focus tijdens de ontwikkeling van het protocol lag op eenvoud, efficiëntie en reproduceerbaarheid. Het bleek dat de meest tijdrovende stap in de verwerking van sputum het tellen van de cellen was. Daarom is het protocol zo opgezet dat sputumverwerking en celetikettering onafhankelijk van het tellen van cellen kunnen worden uitgevoerd zonder tijdverlies. Een nauwkeurig celgetal, dat nog steeds nodig is om het monster op de juiste mani...

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie en de daaropvolgende karakterisering van cellulaire subsets op standaard flowcytometrische platforms.

Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Dit protocol lost veelvoorkomende uitdagingen op die worden ervaren met sputumverwerking die het in het verleden moeilijk hebben gemaakt om te gebruiken met flowcytometrie voor klinische diagnostische doeleinden met hoge doorvoer. Dit protocol is ontworpen om tijd te besparen door het sputumgewicht te gebruiken om antilichaam- en kleuringsvolumes te bepalen. Tijdens de kleuringsincubatie kan het celgetal worden uitgevoerd voor de stroomafwaartse stappen.Het is belangrijk om een nauwkeurig celgetal te bereiken om het juiste re-suspensievolume te bepalen om problemen bij het uitvoeren op de flowcytometer te voorkomen. Dit protocol kan inzicht geven in onderzoeksgebieden die de gezondheid van de longen onderzoeken. Zo zouden ziekten als COPD, astma, longkanker of de effecten van COVID bestudeerd kunnen worden.De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Michael Lai, een onderzoeks- en ontwikkelingswetenschapper uit mijn laboratorium. Weeg om te beginnen het sputummonster om de volumes dissociatiereagentia te bepalen. Breng het monster over in het vat van de juiste grootte op basis van het sputumgewicht en voeg vervolgens één milliliter per gram 0,5% NAC en vier milliliter per gram 0,1% DTT toe.Vortex de monsters op maximale snelheid gedurende 15 seconden en rock op maximale snelheid gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verdun dit monster met 4X Hanks gebalanceerde zoutoplossing of HBSS om de NAC en DTT te neutraliseren. En na snel vortexen, rock het monster op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Filter celsuspensie door een 100 micrometer nylon mesh celzeef in een of meer conische centrifugebuizen van 50 milliliter om een eencellige suspensie te creëren. Pellet de cellen naar beneden. Na het aanzuigen van het supernatant, combineer pellets in één conische buis van 15 milliliter en was met HBSS onder dezelfde omstandigheden.Resuspend de celkorrel in een volume buffer dat wordt bepaald door het begingewicht van het sputummonster. Neem een aliquot uit de celsuspensie en meng 10 microliter van de sputumverdunning met 30 microliter van 0,4% trypan blauw en laad vervolgens in de telkamers van een hemocytometer voor een levend / dood celgetal. Label sputum in compensatiebuizen.Voeg HBSS-antilichaam en kleurstof toe aan elke sputumcelbuis en compensatiebuizen zoals aangegeven in de tekst. Voeg de sputumcellen toe aan de testbuizen en voeg compensatieparels toe aan de compensatiebuizen zoals vermeld in de tekst. Incubeer alle buizen op ijs beschermd tegen licht gedurende 35 minuten.Centrifugeer vervolgens na het vullen van de buizen met ijskoude HBSS gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op 800 keer G.Voor compensatiebuizen, zuig het supernatant zo dicht mogelijk bij de pellets aan en veeg de pellets om los te maken. Voeg vervolgens 0,5 milliliter koude HBSS toe aan de compensatiebuizen en bewaar de buizen op het ijs in een lichtbeschermd gebied totdat het nodig is voor flowcytometrie-analyse. Aspiraleer vervolgens het supernatant uit de onbevlekte, isotype-, bloed- en epitheelbuizen.Maak de pellets los door de buizen te draaien. Voeg twee milliliter van 1% PFA toe aan de onbevlekte en isotypebuizen en 10 milliliter aan de bloed- en epitheelbuizen. Incubeer de buizen op ijs op een lichtbeschermde manier gedurende 30 minuten, vortex dan snel op maximale snelheid en incubaleer opnieuw gedurende nog eens 30 minuten.Vul vervolgens de buisjes met ijskoude HBSS. Centrifugeer vervolgens de buizen bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 1.600 keer G.Aspirateer zoveel mogelijk bovennatuurlijk mogelijk zonder de celkorrel te verstoren en veeg met de vingers over de buis om de cellen los te maken en voeg vervolgens 200 microliter koude HBSS toe aan de niet-gekleurde en isotypebuizen. Bereken en voeg het vereiste volume HBSS toe voor resuspensie van het bloed en de epitheelbuis volgens het totale celgetal.Bewaar alle monsters in compensatiebuizen beschermd tegen licht op het ijs bij vier graden Celsius totdat flowcytometrie-analyse is uitgevoerd. Pas de juiste opstartprocedures toe voor de gebruikte flowcytometer. Gebruik het mengsel van National Institute of Standards and Technology of NIST-kralen om ervoor te zorgen dat voorwaartse strooi- en zijverstrooiingsspanningen worden ingesteld om de NIST-kralen te plaatsen om het perceel te overspannen zonder de kralen te dicht bij de assen te plaatsen.Stel het debiet in op gemiddeld voor LSRII of hoog voor Navios EX. Pas de spanningen aan voor elke parameter die wordt gebruikt voor de scatter- en fluorescentieparameters om de celpopulaties op schaal te plaatsen. Gebruik de cijfers met de gating-strategie als leidraad om de spanningen dienovereenkomstig aan te passen. Verkrijg eerst gegevens voor het niet-gekleurde sputummonster, gevolgd door het isotype bevlekte monster en vervolgens de bloedbuis en de epitheelbuis.Sputumgewicht werd gebruikt om antilichaam- of kleurstofvolumes voor kleuring te bepalen. De correlatie tussen sputumgewicht en celopbrengst was niet sterk. Sputummonsters werden verdeeld in vier gewichtscategorieën, die zich clusterden in de verdeling van de celopbrengst.Elk gebruikt antilichaam werd getitreerd in een concentratie op de plateaufase met de hoogste kleuringsindex als werkconcentratie. In alle gewichtscategorieën was de gemiddelde SEC-besmetting minder dan 20%, waarbij het percentage levensvatbare cellen werd getoond. Gepresenteerd is de gating-strategie die wordt gebruikt voor analyse.NIST-kralen werden gebruikt om een poort in te stellen die op het sputummonster werd aangebracht om puin te verwijderen. Klein puin werd verder geëlimineerd door de breedtepoort. Levensvatbaarheidskleurstof werd gebruikt om dode cellen te elimineren, terwijl de singletpoort doubletten verwijderde.De anti-CD45 antilichaam labeling maakte de scheiding van levende enkele sputumcellen in een bloedcel en een niet-bloedcelcompartiment mogelijk. De profielen verkregen van Navios EX, LSRII en Lyric werden vergeleken. De gating-strategie voor het elimineren van puin, dode cellen, doubletten en het vergelijken van bloed- en niet-bloedprofielen wordt getoond.Deze techniek stelde ons in staat om deze methoden toe te passen om het risico op longkanker op te sporen voor gebruik als een niet-invasieve klinische test.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the use of flow cytometry to identify and count various immune cells in bronchoalveolar lavage fluid. Initially, single immune cells are identified using a viability dye, followed by differential staining of surface marker proteins, enabling the precise enumeration of each cell type.

Identification and Enumeration of Immune Cells in Bronchoalveolar Lavage Fluid by Flow Cytometry

Het gebruik van cytobrush-sampling om lymfocyten en monocyten uit de endocervix te verzamelen is een minimaal invasieve techniek die monsters levert voor analyse van de immuniteit van het vrouwelijke genitale kanaal. In dit protocol beschrijven we het verzamelen van cytobrush-monsters en het isoleren van immuuncellen voor flowcytometrie-analyses.

Collectie, Isolatie, en Flowcytometrische analyse van de menselijke Endocervicale Monsters

Deze methode toont een techniek voor het beoordelen van de functie van granulocyten door gelijktijdig de fagocytose van bacteriën en oxidatieve burst te meten. Beeldgebaseerde flowcytometrie maakte het mogelijk om drie verschillende subsets van geactiveerde granulocyten te identificeren die allemaal verschilden in hun relatieve functionele capaciteit.

Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro

Hier presenteren we een protocol-allergeen geladen deeltjes kwantificeren flowcytometrie. Zwevende deeltjes deeltjes kunnen fungeren als dragers geadsorbeerd allergenen. We tonen hier dat flowcytometrie, een werkwijze op grote schaal gebruikt op gesuspendeerde stoffen te karakteriseren&gt; 0,5 pm in diameter, kan worden gebruikt om deze allergeen geladen deeltjes te verrichten.

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

De gezondheidsstatus van de long wordt weerspiegeld door het type en het aantal immuuncellen die aanwezig zijn in de bronchiolen van de long. We beschrijven een bronchoalveolaire lavage techniek die de isolatie en studie van niet-adherente cellen en oplosbare factoren uit het onderste luchtwegen van muizen mogelijk maakt.

Bronchoalveolaire lavage van meneuze longen om ontstekingscelinfiltratie te analyseren

Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.

Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie

Hier beschrijven we de techniek van sputum inductie. Dit protocol legt ook uit het sputum verwerking voor het uitvoeren van een telling van de differentiële cel en voor het verzamelen van sputum supernatant en cellen voor verdere analyse.

Methodologie voor Sputum inductie en laboratorium Processing

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

De hierin beschreven protocollen bieden een gids om de activiteit van neutrofiele proteasen in humaan sputum te visualiseren en te kwantificeren. De toepassingen van een dergelijke analyse variëren van de evaluatie van ontstekingsremmende behandelingen tot biomarkervalidatie, geneesmiddelenscreening en grote cohort klinische studies.

Monitoring van neutrofiele Elastase en Cathepsine G-activiteit in menselijke Sputummonsters

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Leer een gestroomlijnde methode voor sputumverwerking door flowcytometrie voor longgezondheidsonderzoek. Dit protocol verbetert celanalyse voor COPD, astma en longkankerstudies.

Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Meer video's verkennen