Bepaling van de tripartiete interactie tussen twee monomeren van een MADS-box transcriptiefactor en een calciumsensoreiwit door BiFC-FRET-FLIM-assay

De studie van eiwit-eiwit interacties geeft inzicht in de regulatie van vele biologische processen. Hier demonstreren we een procedure beschreven in eerste instantie door Y John schoen en co. Workers in 2007, waar de auteurs BiFC in combinatie met FRET hebben gebruikt om de tripartiete interactie tussen drie eiwitmoleculen te valideren.

We hebben echter fluorescentielevensduurmetingen in deze procedure opgenomen om FRET-metingen te onderbouwen. Om een tripartiete interactie aan te tonen, hebben we een eiwit gekozen waarvan bekend is dat het homodimeriseert. Bovendien is het ook intern gevalideerd om te interageren met een calciumsensor van eiwit die in dit protocol C-eiwit wordt genoemd.

De MNC-eiwitten interageren in het cytoplasma. Bij deze techniek worden twee eiwitten gelabeld met gesplitste YFP-eiwitten. Hun interactie resulteert in de teruggave van functionele YFP die fungeren als een FRET-acceptor aan de derde interacterende partner, die is getagd met CFP die optreedt als EEN FRET-donor.

Begin met de amplificatie van de coderende sequenties van de genen van belang die in ons geval M- en C-genen zijn door PCR en kloon ze in geschikte invoervectoren. Valideer klonen die zijn geselecteerd op de antibiotica die platen bevatten door restrictievertering en DNA-sequencing. Mobiliseer de gereconstitueerde CDS'van invoerklonen naar de doelvectoren.

Alle vectoren die in dit experiment zijn gebruikt, staan in tabel één. Transformeer ten slotte agrobacterium GV3101-cellen met de bestemmingsvectoren door elektroporatie. Hier kweken we Nicotiana Benthamiana planten die nog steeds vier tot zes in gecontroleerde omstandigheden in een kweekkamer staan.

Bereid het grondmengsel door soilrite, cocopeat en compost te mengen in een verhouding van 2:1:1. Verspreid een een centimeter dikke laag van deze mix in een plastic bak om het grondbed te maken en te verzadigen met een beetje water. Strooi ongeveer 200 zaden over de grond en breng het over in een grotere bak die ongeveer een centimeter stilstaand water is.

Bedek dit bakje met plasticfolie om een vochtkamer te creëren. Breng deze tray over naar een kweekkamer op 23 graden Celsius met een lichte en acht uur donkere cyclus van 16 uur. Breng na twee weken de jonge zaailingen over naar kleine potten van drie tot vier inch met waterverzadigde grondmix.

Plaats deze potten in een plastic bakje en breng ze nog vier weken over naar de kweekkamer. Voor agro-infiltratie moeten de bacteriestammen vers worden gesubcultureerd en gemengd samen met de P19-stam van agrobacterium in geschikte verhoudingen. Start deze procedure door GV3101 agrobacterium stammen die BiFC en FRET constructies bevatten uit streepplaten in 10 ml te enten.

op de bouillon die geschikte antibiotica bevat. Start daarnaast ook een cultuur van P19-stam van agrobacteriën, die wordt toegevoegd om transgene silencing te voorkomen. Bedek de kolf met aluminiumfolie en bewaar ze in een incubator shaker, zet hem 28 graden Celsius bij 170 RPM gedurende 16 uur.

Na de nachtelijke groei wordt 1 ml. van deze culturen overgebracht naar een wegwerpcubit om de optische dichtheid op 600 nanometer te meten met behulp van een spectrofotometer. Meng de culturen van geschikte BiFC- en FRET-partnerbevattende stammen zodat de uiteindelijke OD 0,5 is en die van P19 0,3 in een totaal volume van 2 ml.

Om deze verhoudingen te bereiken volgen we voor deze berekeningen de formule op het scherm. Centrifugeer de gemengde agrobacteriumculturen bij 3000G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant voorzichtig weg. Suspensie van de pellets in een 2 ml.

infiltratiebuffer. Mogelijk moet u een vortexmixer gebruiken om de cellen opnieuw volledig in een homogene celsuspensie te suspensie te suspensie. Incubeer hierna de buizen bij kamertemperatuur in het donker gedurende drie uur.

Label ondertussen elke plantenpot voor het constructmengsel waarmee het zal worden geïnfiltreerd. Vul een naaldloze spuit van 1 ml. met de agrobacteriële mix.

Druk de punt van de spuit voorzichtig maar stevig tegen de abaxiale kant van een volledig geëxpandeerd blad terwijl u het blad vanaf de andere kant ondersteunt. Duw voorzichtig op de zuiger totdat de oplossing zich vult in het bladoppervlak dat overeenkomt met twee tot drie keer dat van de punt van de spuit. Infiltreer het bacteriële mengsel op maximaal vier plekken op één blad en herhaal deze procedure voor drie tot vier bladeren voor één soort infiltratie.

Neem ook ten minste twee planten per constructie op voor infiltratie. Vergeet niet om je handen af te vegen met 70% alcohol of je handschoenen te vervangen om kruisbesmetting te voorkomen. Breng alle potten over naar een bak en incubeer in de groeikamer in dezelfde groeiconditie.

Controleer een klein deel van het agro-geïnfiltreerde blad met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Wanneer de fluorescentie van zowel YFP als CFP detecteerbaar zijn in cellen, gaat u verder met de confocale microscoop voor BiFC FRET-FLIM-test. In ons geval werd deze analyse drie dagen na agro-infiltratie uitgevoerd.

Nu de planten klaar zijn om onder een microscoop te worden gevisualiseerd, snijdt u vierkante bladmonsters van vijf tot 8 mm. weg van de spuitpunt wond en monteert u ze op gedestilleerd water. Leg er een schone afdekplaat overheen en sluit af.

Visualiseer deze monsters in een confocale laserscanmicroscoop. In deze procedure is de basis voor het bepalen en kwantificeren van de interactie tussen twee eiwitten de vermindering van de fluorescentielevensduur van de FRET-donorpartner bij zijn interactie met de acceptor, die wordt gebruikt om de efficiëntie van FRET te berekenen. De complexiteit in het geval van tripartiete interactie neemt verder toe omdat FRET-acceptor in dit geval geen enkel molecuul is, maar een gesplitst YFP BiFC-paar, dat eerst in vivo moet worden gereconstitueerd om een functionele FRET-acceptorfluoofoor te worden.

Om FRET-FLIM uit te voeren, moeten we de fluorescentielevensduur van de donormoleculen bepalen, eerst alleen en vervolgens in aanwezigheid van een FRET-partner. Open de FLIM-toepassing in de confocale laserscanmicroscoop, start de console en gebruik de patroonherkenning fotonentelling om de fluorescentielevensduur te meten. Selecteer de standaard meetmodus voor het tellen van fotonen.

We nemen twee soorten agro-geïnfiltreerde planten. Een die het CCFP-gen heeft en de andere die CCFP samen met MYFP heeft omdat de interactie van M-eiwit al is gevalideerd met het C-eiwit met behulp van BiFC en Y2H, we verwachten een goede FRET-efficiëntie met dit interagerende paar. Nu scannen we eerst het CCFP agro-geïnfiltreerde blad en zoeken we naar een cel met goede CFP-fluorescentie.

De microscoopinstellingen worden op het scherm weergegeven. Het monster wordt verlicht met voldoende laservermogen om ongeveer 0,1 fotonen per puls te bereiken. Voor monsters met variabele fluorescentie-intensiteit leggen we 50 frames vast om voldoende fotonen te verzamelen die nodig zijn voor de levensduurmeting.

Omdat bekend is dat CFP twee fluorescentielevensduur vertoont vanwege de bevestigingsaanpassing, voeden we de gegevens met behulp van een exponentieel reconvolutiemodel terwijl de waarde van N gelijk blijft aan twee. Bij deze instellingen zijn de twee levens zichtbaar op één en 3,2 nanoseconden. We zullen de hogere levensduur gebruiken voor alle volgende berekeningen.

We zijn nu klaar om FRET te meten tussen CCFP en MYFP. Laten we hiervoor het bladmonster van de agro-geïnfiltreerde plant met CCFP en MYFP gebruiken. We zoeken naar een cel die zowel CCFP als MYFP tot expressie brengt en hun respectieve emissiepatronen bevestigt door ze op te winden met behulp van volledige 40 nanometer pulslaser en 514 nanometer witlichtlaser.

Daarna schakelen we over naar de FLIM-console om de levensduur van CFP te meten met dezelfde instellingen die we eerder gebruikten voor het meten van de levensduur van CCFP. Maar deze keer drukt de cel ook MYFP uit die mogelijk kan interageren met CCFP en een verkorting van de levensduur van CCFP kan veroorzaken. Zoals we de grafiek hebben gelezen die is verkregen met behulp van het N exponentiële reconvolutiemodel met N gelijk aan twee, is er in feite een afname van de GVB-levensduur van 3,2 tot 2,6 nanoseconden.

We starten nu de FRET-console in de software en berekenen de FRET-efficiëntie door handmatig een onbetwistbare levensduur in te voeren in de vergelijking in de software en de waargenomen FRET-efficiëntie is 56%Laten we nu naar de laatste stap gaan, dat is om de interactie tussen drie partners te visualiseren. Hiervoor nemen we het bladmonster van een plant die mede geïnfiltreerd was met CCFP en MYFPN met MYFPC. We scannen de bladplant op een cel die zowel CFP- als gereconstitueerde YFP-fluorescentie vertoont die voortkomt uit interactie tussen twee M-eiwitten.

We gebruiken dezelfde laser- en emissiegolflengte als eerder. Vervolgens schakelen we de 514 nanometer laser uit en gaan we naar de FLIM console. Als het MYFP-dimeer interageert met CCFP.

We zouden een vermindering van de levensduur van CCFP moeten zien, zoals waargenomen tijdens de interactie met MYFP. Als de CCFP echter niet interageert met het MYFP-dimeer, moet de fluorescentielevensduur op 3,2 nanoseconden blijven. Met behulp van de vergelijkbare instellingen zoals hierboven vermeld, meten we de GVB-levensduur in aanwezigheid van gereconstitueerde YFP.

We passen de grafiek met behulp van het N exponentiële reconvolutiemodel met een gelijk aan twee en gaan naar de FRET-console. En ja, er is een daling van de levensduur van het GVB van 3,2 naar 2,3 nanoseconden. Wij berekenen de FRET efficiëntie zoals hierboven beschreven.

De berekende FRET-efficiëntie is 55%Hier hebben we FLIM gebruikt om de fluorescentielevensduur van de FRET-donorpartner te meten in de aan- en afwezigheid van de FRET-acceptor. Een vermindering van de fluorescentielevensduur van de donor werd verwacht als er een positieve interactie tussen de twee eiwitten was. Bij positieve controle zijn dat CCFP en MYFP.

We zien een vermindering van de fluorescentielevensduur van de donor van 3,3 tot 2,5 nanoseconden en de FRET-efficiëntie was 56%Een vergelijkbare oefening met gereconstitueerde YFP resulteerde in de interactie tussen twee amonomeren en C-eiwitten resulteerde ook in een positieve FRET-interactie die leidde tot de vermindering van de fluorescentielevensduur van de donor tot 2,6 nanoseconden. De berekende FRET-efficiëntie was in dit geval ongeveer 55%. De vermindering van de fluorescentielevensduur van de FRET-donor levert een sterk bewijs voor een tripartiete interactie tussen deze eiwitten.

Het hier beschreven protocol is een krachtig hulpmiddel om tripartiete eiwit-eiwitinteracties in levende cellen te bepalen. Deze procedure kan ook helpen bij het bepalen van de intracellulaire lokalisatie van de resulterende complexen, wat belangrijk is bij het ontcijferen van de functie en fysiologische betekenis van elk eiwitcomplex. Kortom, biFC gebaseerde FRET-FLIM-test biedt de mogelijkheid om belangrijke aspecten van tripartiete eiwitinteracties te bestuderen en te karakteriseren, wat nuttig kan zijn in eiwit-eiwitinteractiestudies in zowel dierlijke als plantaardige systemen.