In vitro Differentiatie van menselijke dendritische cellen en hun markers bij Leishmania-infectie

Samenvatting

Dendritische cellen (DC's) zijn essentiële componenten van aangeboren immuniteit tegen Leishmania-infectie. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de complexe interactie tussen DC's en Leishmania blijven slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om te evalueren hoe Leishmania-infectie de immunobiologische functie van menselijke DC's beïnvloedt, zoals migratiegerelateerde en costimulatoire molecuulexpressie.

Samenvatting

Leishmaniasis omvat een verzameling van klinische manifestaties die verband houden met de infectie van obligate intracellulaire protozoa, Leishmania. De levenscyclus van Leishmania-parasieten bestaat uit twee afwisselende levensfasen (amastigoten en promastigoten), waarin parasieten respectievelijk in geleedpotige vectoren of gastheren van gewervelde dieren verblijven. Met name de complexe interacties tussen Leishmania-parasieten en verschillende cellen van het immuunsysteem hebben een grote invloed op de uitkomst van de infectie. Belangrijk is dat, hoewel bekend is dat macrofagen de belangrijkste gastheerniche zijn voor Leishmania-replicatie , parasieten ook worden gefagocyteerd door andere aangeboren immuuncellen, zoals neutrofielen en dendritische cellen (DC's).

DC's spelen een belangrijke rol bij het overbruggen van de aangeboren en adaptieve takken van immuniteit en orkestreren zo immuunresponsen tegen een breed scala aan pathogenen. De mechanismen waarmee Leishmania en DC's op elkaar inwerken, blijven onduidelijk en omvatten aspecten van het vastleggen van pathogenen, de dynamiek van DC-rijping en -activering, DC-migratie naar drainerende lymfeklieren (dLN's) en antigeenpresentatie aan T-cellen. Hoewel een groot aantal studies het idee ondersteunt dat DC's een dubbele rol spelen bij het moduleren van immuunresponsen tegen Leishmania, blijft de deelname van deze cellen aan gevoeligheid of resistentie tegen Leishmania slecht begrepen. Na infectie ondergaan DC's een rijpingsproces dat gepaard gaat met de opregulatie van het oppervlakte-major histocompatibiliteitscomplex (MHC) II, naast costimulatoire moleculen (namelijk CD40, CD80 en CD86).

Inzicht in de rol van DC's in de uitkomst van infecties is cruciaal voor het ontwikkelen van therapeutische en profylactische strategieën om de immuunrespons tegen Leishmania te moduleren. Dit artikel beschrijft een methode voor de karakterisering van de Leishmania-DC interactie. Dit gedetailleerde protocol biedt richtlijnen voor de stappen van DC-differentiatie, de karakterisering van celoppervlaktemoleculen en infectieprotocollen, waardoor wetenschappers de DC-respons op Leishmania-infectie kunnen onderzoeken en inzicht kunnen krijgen in de rol die deze cellen spelen in de loop van infectie.

Inleiding

Leishmaniasis vormt een complex van verwaarloosde ziekten veroorzaakt door verschillende soorten van het geslacht Leishmania ¹. Leishmania is een intracellulaire protozoa van de familie Trypanosomatidae die mensen en andere zoogdieren infecteert en een spectrum van ziekten veroorzaakt, variërend van huidlaesies tot viscerale vormen². De voornaamste klinische manifestaties van deze ziekte zijn tegumentaire leishmaniasis (TL) en viscerale leishmaniasis (VL). De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) schat dat er jaarlijks 700.000 tot 1 miljoen nieuwe gevallen voorkomen, met 7....

Protocol

OPMERKING: Cellen zijn verkregen van gezonde donorvrijwilligers. De hierin beschreven procedure werd goedgekeurd door de Nationale Ethische Commissie (nummer 2.751.345) - Fiocruz, Bahia, Brazilië).

1. Differentiatie van menselijke dendritische cellen

1. Pipetteer 10 ml mengsel van polysucrose-natriumtriazoaat in conische buisjes van 50 ml.
2. Etiketteer de conische buisjes van 50 ml respectievelijk voor elke donor.
3. Verzamel 30 ml bloed van gezonde donoren en voer alle volgende stappen uit in de laminaire flowkap.
4. Breng het bloed voorzichtig over in de con....

Resultaten

Dit rapport onderzoekt de rol van DC's bij Leishmania-infectie met behulp van flowcytometrie en confocale microscopie. Aanvankelijk werd het fenotypische profiel van de van menselijke monocyten afgeleide DC vastgesteld. Met name de verkregen CD11c⁺ dendritische celpopulaties waren positief voor CCR7, CD209, CD80, CD1a en HLA-DR. De resultaten geven aan dat de expressie van deze markers in DC-populaties sterk wordt beïnvloed door Leishmania-infectie. Geïnfecte.......

Discussie

Leishmaniasis is wereldwijd een ernstig probleem voor de volksgezondheid. De pathogenese van deze ziekte is vrij complex en de mechanismen die de overleving van parasieten in gewervelde gastheren bevorderen, blijven ongrijpbaar¹⁷. DC's zijn professionele antigeenpresenterende cellen die door het hele lichaam worden aangetroffen, inclusief filter- en lymfoïde organen. Na het vastleggen en verwerken van antigeen, ondergaan onrijpe DC's een complex rijpingsproces dat.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
anti CCR7	Thermo
anti CD209	Isofarma
anti CD83	Leica SP8
anti HLA-DR	Gibco
Bovine serum albumin	Thermo	A2153-100G	Sigma
Ciprofloxacin	Gibco
confocal microscope	Thermo Fisher Scientific
Fetal bovine serum	Gibco
Flow Jo	Thermo Fisher Scientific
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific
Glutamin	Gibco
HEPES	Thermo Fisher Scientific
phalloidin	Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffer solution	Peprotech
prolong gold antifade kit	BD pharmigen
RPMI	BD pharmigen
Saponin	BD pharmigen	47036 – 50G – F	Sigma
Schneider's insect medium	software BD biosciences