Name: Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart met tissue clearing en light-sheet microscopie. Deze methode behoudt de driedimensionale structuur en biedt micrometrische resolutie voor cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 952166 (REPAIR), MUR in het kader van het FISR-programma, project FISR2019_00320 en Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-project.

Alle dierbehandeling en -procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en in overeenstemming met de beginselen en voorschriften van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (protocolnummer 647/2015-PR). Alle dieren werden geleverd door ENVIGO, Italië. Voor deze experimenten werden 5 mannelijke C57BL/6J muizen van 6 maanden oud gebruikt.
1. Oplossingsvoorbereiding
<ol><li>Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,6) in een chemische kap. Bewaar de 4% PFA aliquots bij -20 °C gedurende enkele maanden.</li>
	<li>Hydrogeloplossing bereiden: Meng 4% Acrylamide, 0,05% Bis-acrylamide, 0,25% Initiatior AV-044 in 0,01 M PBS in een chemische kap. Bewaar de reagentia en de oplossing gedurende de gehele bereiding op ijs. Bewaar de hydrogel aliquots bij -20 °C gedurende enkele maanden.</li>
	<li>Bereid clearingoplossing voor: Meng 200 mM boorzuur, 4% natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedeïoniseerd water; pH 8,6 in een chemische kap. Bewaar de oplossing tussen 21-37 °C om SDS-neerslag te voorkomen.</li>
	<li>Bereid verse Tyrode-oplossing op de dag van het experiment: voeg 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 en 4,7 mM KCl toe; titreer tot pH 7,4 met 1 M NaOH.</li>
</ol>2. Hartisolatie
<ol><li>Injecteer 0,1 ml 500 I.U. Heparine subcutaan 30 minuten vóór de hartisolatieprocedure.</li>
	<li>Vul een spuit van 30 ml en drie petrischalen van 6 cm met verse Tyrode-oplossing. Maak een kleine scheur (3-4 mm diep) op de rand van een van de petrischalen en plaats deze onder een stereoscopische microscoop.</li>
	<li>Bevestig een canule met een diameter van 1 mm op de spuit en steek deze in de spleet van de petrischaal. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten.</li>
	<li>Vul een spuit van 20 ml met 4% PFA en bewaar deze in de chemische kap. Maak een lege petrischaal onder de motorkap.</li>
	<li>Verdoof de muis met 3% isofluraan/zuurstof bij een stroomsnelheid van 1,0 l/min en offer deze op door cervicale dislocatie volgens de geldende dierenwelzijnsregels.</li>
	<li>Verwijder na het offer de vacht over de borst en open de borst om volledige toegang tot het hart te hebben.</li>
	<li>Isoleer het hart, dompel het onder in de petrischaal die eerder gevuld was met 50 ml Tyrode-oplossing. Gebruik een chirurgische schaar om de aorta direct in de buurt van de aortaboog te knippen om het hart bloot te leggen.</li>
	<li>Breng het hart over onder een stereoscopische microscoop en voer de cannulatie zorgvuldig uit. Steek de canule niet te diep in de aorta (niet meer dan 2 mm) om weefselschade te voorkomen.</li>
	<li>Gebruik een kleine klem en een hechtdraad (maat 5/0) om het hart aan de canule te bevestigen.</li>
	<li>Perfuseer het hart met 30 ml van de Tyrode-oplossing met een constante druk van 10 ml / min om bloed uit de bloedvaten te verwijderen.</li>
	<li>Maak de canule los van de spuit en plaats het hart in de petrischaal gevuld met Tyrode-oplossing. Pas op dat u geen luchtbellen in de canule heeft; verwijder anders de luchtbellen op de juiste manier.</li>
	<li>Bevestig de spuit van 20 ml gevuld met koude 4% PFA aan de canule en perfuseer het hart met dezelfde constante druk.</li>
	<li>Incubeer het hart in 10 ml van 4% PFA bij 4 °C 's nachts (O/N). Om weefselafbraak te voorkomen, voert u stappen 2.6-2.13 in de kortst mogelijke tijd uit.</li>
</ol>3. Hart opruiming
<ol><li>Was de volgende dag het hart in 0,01 M PBS 3 keer bij 4 °C gedurende 15 minuten. OPMERKING: Na deze stap kan het hart gedurende enkele maanden worden bewaard in PBS + 0,01% natriumazide (NaN3) bij 4 °C.</li>
	<li>Incubeer het hart in 30 ml Hydrogel-oplossing bij schudden (15 tpm) bij 4 °C gedurende 3 dagen.</li>
	<li>Ontgas het monster bij kamertemperatuur met behulp van een droger, een vacuümpomp en een buizensysteem dat de droger verbindt met zowel de pomp als een stikstofleiding.<ol><li>Plaats het monster in de droger en open de injectieflacon, houd de dop erop.</li>
		<li>Sluit de droger en haal de zuurstof uit de buis door de stikstofleiding te openen.</li>
		<li>Zet de vacuümpomp aan om de zuurstof gedurende 10 minuten uit de droger te verwijderen.</li>
		<li>Schakel de pomp uit en gebruik de knop van de droger om de stikstofleiding te openen. Zodra de druk gelijk is aan de atmosferische druk, opent u de droger voorzichtig en sluit u de injectieflacon snel.</li>
	</ol></li>
	<li>Houd het hart in de ontgaste Hydrogel-oplossing bij 37 °C gedurende 3 uur in rust.</li>
	<li>Wanneer de Hydrogel goed gepolymeriseerd is en er volledig gelatineus uitziet, verwijdert u voorzichtig het hart en plaatst u het in de monsterhouder.</li>
	<li>Plaats de monsterhouder met het hart in een van de opruimkamers en sluit deze goed om lekken van de opruimoplossing te voorkomen.</li>
	<li>Schakel het waterbad in waar de container met de opruimoplossing is geplaatst en de peristaltische pomp om de recirculatie van de opruimoplossing te starten.</li>
	<li>Vervang de opruimoplossing in de container eenmaal per week om de verduidelijkingsprocedure te versnellen.</li>
</ol>4. Kleuring van het celmembraan
<ol><li>Zodra het hart volledig helder lijkt, verwijdert u het uit de monsterhouder en wast u het gedurende 24 uur in 50 ml opgewarmde PBS. Was opnieuw in 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) gedurende 24 uur.</li>
	<li>Incubeer het monster in 0,01 mg / ml Wheat Germ Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 in 3 ml PBS-T 1x bij schudden (50 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 7 dagen.</li>
	<li>Was het monster na de incubatie van 7 dagen in 50 ml PBS-T 1x bij kamertemperatuur in schudden gedurende 24 uur.</li>
	<li>Incubeer het monster in 4% PFA gedurende 15 minuten en was het vervolgens 3 keer in PBS gedurende 5 minuten elk. OPMERKING: Na deze stap kan het hart gedurende enkele maanden worden opgeslagen in PBS + 0,01% NaN3 bij 4 °C.</li>
	<li>Incubeer het hart in toenemende concentraties van 2,2′-Thiodiethanol (TDE) in 0,01 M PBS (20% en 47% TDE/PBS) gedurende elk 8 uur, tot de uiteindelijke concentratie van 68% TDE in 0,01 M PBS om de vereiste brekingsindex (RI = 1,46) te leveren. Dit is het RI matching medium (RI-medium) om beelden te verkrijgen16.</li>
</ol>5. Hartmontage en -acquisitie
OPMERKING: Alle componenten van het optische systeem worden in detail vermeld in de tabel met materialen.
<ol><li>Vul voorzichtig ongeveer 80% van het externe cuvette (kwarts, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) met het RI-medium. OPMERKING: Hier is het mogelijk om verschillende niet-vluchtige oplossingen te gebruiken die een RI van 1,46 garanderen.</li>
	<li>Vul het interne cuvet (kwarts, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) voorzichtig met hetzelfde RI-medium.</li>
	<li>Dompel het monster onder in de interne cuvette. De hierboven beschreven monsterincubaties zorgen ervoor dat het monster stabiel blijft in het RI-medium zonder te worden vastgehouden.</li>
	<li>Verplaats het monster voorzichtig naar de bodem van de cuvette met een dun pincet en rangschik het hart met zijn lengteas evenwijdig aan de hoofdas van de cuvette om het excitatielichtpad door het weefsel tijdens het scannen te minimaliseren.</li>
	<li>Bevestig de op maat gemaakte plug voorzichtig boven de interne cuvette met twee schroeven.</li>
	<li>Monteer het monster met behulp van de magneten op de microscooptrap.</li>
	<li>Vertaal de verticale monstertrap handmatig om de interne cuvette onder te dompelen in de externe.</li>
	<li>Schakel de excitatielichtbron (golflengte van 638 nm) in en stel een laag vermogen in (in de orde van grootte van 3 mW).</li>
	<li>Verplaats het monster met behulp van de gemotoriseerde vertaler om een binnenvlak van het weefsel te verlichten.</li>
	<li>Schakel de beeldbewerkingssoftware (HCImageLive) in en stel de cameratrigger in op de externe (light-sheet) modus om de acquisitietrigger van de camera aan te sturen door de aangepaste software die de volledige installatie regelt.</li>
	<li>Schakel Automatisch opslaan in het deelvenster Scaninstellingen in en stel de uitvoermap in waarin de afbeeldingen moeten worden opgeslagen.</li>
	<li>Pas de monsterpositie in het XY-vlak handmatig aan met de lineaire vertalers om het monster naar het midden van de FoV van de camerasensor te verplaatsen.</li>
	<li>Verplaats het monster langs de Z-as met behulp van de lineair gemotoriseerde vertaler om hartgrenzen te identificeren voor tomografische reconstructie.</li>
	<li>Verhoog het laservermogen tot ~20 mW, klaar voor de beeldverwerkingssessie.</li>
	<li>Start de tomografische acquisitie, klik op de knop Start in het sequence panel van de imaging software en verplaats tegelijkertijd het monster langs de Z-as met de constante snelheid van 6 μm/s met behulp van de gemotoriseerde vertaler.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
<li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li>
<li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transaction+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73(2019).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).</li>
<li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li>
<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
<li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+prediction+in+H%26E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

Niets te onthullen.

In dit werk werd een succesvolle aanpak geïntroduceerd om een heel muizenhart op hoge resolutie te zuiveren, te beitsen en in beeld te brengen. Eerst werd een weefseltransformatieprotocol (CLARITY) geoptimaliseerd en uitgevoerd, enigszins aangepast voor de toepassing ervan op het hartweefsel. Inderdaad, om een efficiënte reconstructie in 3D van een heel hart te verkrijgen, is het essentieel om het fenomeen van lichtverstrooiing te voorkomen. De CLARITY-methodologie stelt ons in staat om een zeer transparant intact hart t...

Structurele remodellering geassocieerd met hartaandoeningen kan de elektrische geleiding beïnvloeden en elektromechanische disfuncties van het orgaan introduceren 1,2. Huidige benaderingen die worden gebruikt om functionele veranderingen te voorspellen, maken vaak gebruik van MRI en DT-MRI om een algehele reconstructie van fibroseafzetting, vasculaire boom en vezelverdeling van het hart te verkrijgen, en ze worden gebruikt om preferentiële actiepotentiaalvoortplanting (APP) -paden over het orgaan te modelleren 3,4. Deze strategieën kunnen een mooi overzicht geven van de hartorganisatie. Hun ruimtelijke resolutie is echter onvoldoende om de impact van structurele remodellering op de hartfunctie op cellulair niveau te onderzoeken.
Het plaatsen van dit raamwerk in een andere orde van grootte, waar afzonderlijke cellen individuele rollen kunnen spelen bij de verspreiding van actiepotentialen, is een uitdaging. De belangrijkste beperking is de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden om beeldvorming met hoge resolutie (micrometrische resolutie) uit te voeren in massieve (centimetergrote) weefsels. In feite is het afbeelden van biologische weefsels in 3D met hoge resolutie erg ingewikkeld vanwege weefselondoorzichtigheid. De meest gebruikelijke aanpak om 3D-reconstructies in hele organen uit te voeren, is het voorbereiden van dunne secties. Nauwkeurige secties, assemblage en beeldvorming vereisen echter aanzienlijke inspanning en tijd. Een alternatieve aanpak die niet vereist dat het monster wordt gesneden, is het genereren van een transparant weefsel. In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden voor het ophelderen van weefsels voorgesteld 5,6,7,8. De uitdaging om massieve, transparante en fluorescerend gelabelde weefsels te produceren, is onlangs bereikt door echte weefseltransformatiebenaderingen te ontwikkelen (CLARITY9, SHIELD10). In het bijzonder is de CLARITY-methode gebaseerd op de transformatie van een intact weefsel in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidevrije vorm die het mogelijk maakt om hoge transparantie te verlenen door de selectieve verwijdering van membraanlipide-bilayers. Opmerkelijk is dat deze methode ook succesvol is gebleken bij hartvoorbereiding 11,12,13,14. Omdat het hart echter te kwetsbaar is om geschikt te zijn voor een actieve opruiming, moet het worden geklaard met behulp van de passieve benadering, die veel tijd nodig heeft om volledige transparantie te verlenen.
In combinatie met geavanceerde beeldvormingstechnieken zoals light-sheet microscopie, heeft CLARITY het potentieel om 3D massieve hartweefsels met micrometrische resolutie in beeld te brengen. Bij lichtplaatmicroscopie wordt de verlichting van het monster uitgevoerd met een dunne vellen licht die zijn opgesloten in het brandpuntsvlak van het detectieobjectief. De fluorescentie-emissie wordt verzameld langs een as loodrecht op het verlichtingsvlak15. De detectiearchitectuur is vergelijkbaar met widefield-microscopie, waardoor de acquisitie veel sneller is dan laserscanmicroscopen. Door het monster door het lichtblad te verplaatsen, kan een volledige tomografie van grote monsters worden verkregen, tot centimeters groot. Vanwege de intrinsieke eigenschappen van de Gaussische bundel is het echter mogelijk om een zeer dunne (in de orde van enkele micron) lichtplaat alleen voor een beperkte ruimtelijke uitbreiding te verkrijgen, waardoor het gezichtsveld (FoV) drastisch wordt beperkt. Onlangs is een nieuw excitatieschema geïntroduceerd om deze beperking te overwinnen en toegepast voor beeldvorming van de hersenen, waardoor 3D-reconstructies met isotrope resolutie16 mogelijk zijn.
In dit document wordt een passieve clearingbenadering gepresenteerd, waardoor de clearingtiming die nodig is voor het CLARITY-protocol aanzienlijk kan worden verminderd. Het hier beschreven methodologische raamwerk maakt het mogelijk om een heel muizenhart met micrometrische resolutie te reconstrueren in een enkele tomografische scan met een acquisitietijd in de orde van minuten.

<table><tbody><tr><td>2-2&rsquo; Thiodiethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>61-0140</td><td></td></tr><tr><td>AV-044 Initiator</td><td>Wako Chemicals</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca flash 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>Camera software</td><td>Hamamatsu</td><td>HC Image</td><td></td></tr><tr><td>Collimating lens</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Detection arm</td><td>Integrated optics</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Excitation lens</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera&igrave;nal quartz cuvette</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>Fold mirrors</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometric mirror</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Internal quartz cuvette</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Laser source</td><td>Integrated Optics</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Long-pass filter</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>Motorized traslator</td><td>Physisk Instrument</td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>Whatman</td><td>2606T</td><td></td></tr><tr><td>Relay lens</td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tube lens</td><td>Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Tunable lens</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Zowel genetische als niet-genetische hartaandoeningen kunnen ernstige remodelleringsprocessen in het hart veroorzaken. Structurele remodellering, zoals collageenafzetting (fibrose) en cellulaire uitlijning, kan de elektrische geleiding beïnvloeden, elektromechanische disfuncties introduceren en uiteindelijk leiden tot aritmie. De huidige voorspellende modellen van deze functionele veranderingen zijn gebaseerd op niet-geïntegreerde structurele informatie met een lage resolutie. Het plaatsen van dit raamwerk op een andere orde van grootte is een uitdaging vanwege de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden bij het uitvoeren van beeldvorming met hoge resolutie in massief weefsel. In dit werk beschrijven we een methodologisch raamwerk dat beeldvorming van hele muizenharten met micrometrische resolutie mogelijk maakt. Het bereiken van dit doel heeft een technologische inspanning vereist waarbij vooruitgang in weefseltransformatie en beeldvormingsmethoden zijn gecombineerd. Ten eerste beschrijven we een geoptimaliseerd CLARITY-protocol dat in staat is om een intact hart te transformeren in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidenvrije vorm die een hoge transparantie en diepe kleuring mogelijk maakt. Vervolgens wordt een fluorescentie lichtplaatmicroscoop beschreven die in staat is om snel beelden te verkrijgen van een mesoscopisch gezichtsveld (mm-schaal) met de resolutie op micronschaal. In navolging van het mesoSPIM-project maakt de bedachte microscoop de reconstructie van het hele muizenhart met micrometrische resolutie in een enkele tomografische scan mogelijk. Wij geloven dat dit methodologische kader het mogelijk zal maken om de betrokkenheid van de cytoarchitectuur-wanorde in de elektrische disfuncties te verduidelijken en de weg vrij te maken voor een uitgebreid model dat zowel de functionele als structurele gegevens beschouwt, waardoor een uniform onderzoek mogelijk wordt naar de structurele oorzaken die leiden tot elektrische en mechanische veranderingen na de weefselremodellering.

De ontwikkelde passieve clearing setup maakt het mogelijk om een geklaard volwassen muishart (met een afmeting van de orde 10 mm x 6 mm x 6 mm) te verkrijgen in ongeveer 3 maanden. Alle componenten van de opstelling zijn gemonteerd zoals weergegeven in figuur 1. De verwaarloosbare temperatuurgradiënt tussen elke clearingkamer (in de orde van 3 °C) maakt het mogelijk om de temperatuur in alle kamers in een goed bereik te houden.
<im...

We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.

Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Deze methodologie combineert verbetering van het clearingprotocol met de oogcapaciteit van optische sectioning van de Mesos PIM-technologie, waardoor we een mesoscopische reconstructie met micrometrische resolutie kunnen uitvoeren. Het biedt de mogelijkheid om massieve hartweefsels of hele muizenharten in één scan in beeld te brengen zonder de oorspronkelijke driedimensionale weefselorganisatie te verliezen. Nadat het hart is gecannuleerd door proximale aorta gewassen in tyro-oplossing en gefixeerd in 4% Paraform aldehyde in 0,01 molaire PBS, is het klaar om het clearingprotocol te starten.Was het hart drie keer in 0,01 molaire PBS op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Na deze stap kan het hart gedurende enkele maanden worden opgeslagen in PBS en 0,01% natriumazide bij vier graden Celsius. Incubeer het hart in 20 milliliter hydrogeloplossing in schudtoestand bij 15 RPM gedurende drie dagen bij vier graden Celsius.Ontgas het monster bij kamertemperatuur met behulp van een droger, een vacuümpomp en een buizensysteem dat de droger verbindt met zowel de pompband als de stikstofleiding. Plaats het monster in de droger en open de injectieflacon met de dop erop. Sluit de droger en haal de zuurstof uit de buis door de stikstofleiding te openen.Schakel de vacuümpomp in om de zuurstof gedurende 10 minuten uit de droger te verwijderen. Zet de pomp uit en open de knop van de droger naar de stikstofleiding. Open vervolgens de stikstofkraan.Zodra de druk gelijk is aan de atmosferische druk, opent u de droger voorzichtig en sluit u de injectieflacon snel. Houd het hart in de ontgaste hydrogeloplossing op 37 graden Celsius gedurende ongeveer drie uur in rust. Wanneer de hydrogel goed gepolymeriseerd is en er volledig gelatineus uitziet, verwijdert u het hart er voorzichtig uit en plaatst u het in een opruimoplossing in de injectieflacon met opruimoplossing.Vervang de clearingoplossing in de injectieflacon eens in de drie dagen om de verduidelijkingsprocedure te versnellen. Zodra het hart volledig geklaard lijkt, verwijdert u het uit de injectieflacon en wast u het in 50 milliliter opgewarmde PBS gedurende 24 uur in trillende toestand. Was opnieuw in 50 milliliter van één X PBS T gedurende 24 uur in schuddende toestand.Incubeer het monster in 0,01 milligram per milliliter tarwekiem aglutinine Alexa floor 633 in drie milliliter van één X PBS T in schuddende toestand bij 50 RPM bij kamertemperatuur gedurende zeven dagen. Was het monster na de incubatie van zeven dagen in 50 milliliter van één X PBS T bij kamertemperatuur tijdens het schudden gedurende 24 uur. Incubeer het monster in 4% PFA gedurende 15 minuten en was het vervolgens drie keer in 0,01 molaire PBS gedurende elk vijf minuten.Incubeer het hart achtereenvolgens in 20 en 47% TDE in 0,01 molaire PBS gedurende elk acht uur. En dan uiteindelijk bij 68%TDE in 0,01 molaire PBS om de vereiste brekingsindex van 1,46 te leveren. Vul voorzichtig ongeveer 80% van de externe kwarts quvet met het brekingsindexmedium.Vul de interne kwarts quvet met hetzelfde brekingsindexmedium. Dompel het monster onder in de interne quvet. Verplaats het monster voorzichtig naar de bodem van de quvet met behulp van een dun pincet en rangschik het hart met zijn lengteas parallel aan de hoofdas van de quvet om het excitatielichtpad door het weefsel tijdens het scannen te minimaliseren.Bevestig de op maat gemaakte plug voorzichtig boven de interne quvet met twee schroeven. Monteer het monster met magneten op de microscooptrap. Vertaal de verticale monstertrap handmatig om de interne quvet onder te dompelen in de externe.Schakel de excitatielichtbron met een golflengte van 638 nanometer in en zet deze op laag vermogen in de orde van drie milliwatt. Verplaats het monster met behulp van de gemotoriseerde vertaler om een binnenste plaat van het weefsel te verlichten. Schakel de HC image live camera-software in en stel de cameratrigger in op de externe rand trigger light sheet-modus om de acquisitietrigger van de camera aan te sturen door de aangepaste software die de hele installatie bestuurt.Schakel automatisch opslaan in de camerasoftware in en stel de uitvoermap in waarin de afbeeldingen moeten worden opgeslagen. Pas de monsterpositie in het X Y-vlak handmatig aan met de lineaire vertalers om het monster naar het midden van het gezichtsveld van de camerasensor te verplaatsen. Verplaats het monster langs de Z-as met behulp van de lineaire gemotoriseerde vertaler om hartgrenzen te identificeren voor tomografische reconstructie.Verhoog het laservermogen tot ongeveer 20 milliwatt voordat u begint aan de beeldvormingssessie. Start de tomografische acquisitie door op de startknop in het opnamepaneel van de beeldvormingssoftware te klikken en begin tegelijkertijd met het verplaatsen van het monster langs de Z-as met de constante snelheid van zes micrometer per seconde met behulp van de gemotoriseerde vertaler. De combinatie van de helderheidsmethode met TDE als brekingsindexmedium verandert het uiteindelijke volume van het monster niet significant en leidt evenmin tot een isotrope vervorming van het monster.De excitatie-optica produceerde een lichtplaat met een minimale verspilling van ongeveer zes micrometer die tot 175 micrometer divergeerde aan de rand van het gezichtsveld. De synchronisatie van de rolluik van de camera met de axiale scan van het afval van de lichtplaat zorgde ervoor dat het emissiesignaal alleen in het monstergedeelte werd verzameld dat werd geëxciteerd met het afval van de lichtplaat, wat resulteerde in een gemiddelde F B H M van ongeveer 6,7 micrometer over het hele gezichtsveld. De Z-puntspreidingsfunctie van de microscoop werd ook geschat door een tomografische reconstructie van de fluorescerende nanosfeer en een F W H M van 6,4 micrometer werd geschat door de fit.De mogelijkheid van het systeem om enkelvoudige celmembranen in drie dimensies op te lossen met een voldoende signaal-ruisverhouding in het hele orgaan werd ook bevestigd. De ontgassingsprocedure is de meest kritieke stap van het protocol. Als het niet goed wordt uitgevoerd, kan het weefsel tijdens de incubatie schade oplopen die aangeeft in een reinigingsoplossing.Het gepresenteerde protocol kan worden gecombineerd met een multi-kleuringsprotocol om een hele orgaanreconstructie te bereiken waarbij verschillende biologische structuren worden geïntegreerd en kan worden toegepast om pathologische modellen te bestuderen.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hoge frequentie Doppler-echografie is een nieuwe technologie voor de beoordeling van regionale myocardiale functie. Dit werk presenteert eerste bewijs waaruit de toepasselijkheid van deze veelzijdige imaging platform voor de herhaalde meting van het myocard stam, dp / dt, en mitralisinsufficiëntie in de ischemie-reperfusie (IR) muizen hart.

Hoogfrequente hoge resolutie Echocardiografie: eerste bewijs op niet-invasieve Herhaalde Maatregel van myocard Strain, contractiliteit, en mitralisinsufficiëntie in de Ischemie-reperfusie Murine Hart

Deze video demonstreert het gebruik van een rail gemonteerd hoogfrequente ultrasone sonde naar echocardiografie te voeren op een verdoofde muis. De methoden beschrijven zowel conventionele twee-dimensionale en M-mode metingen van de hartfunctie in aanvulling op nieuwere, krachtige tools zoals kleur Doppler, rek-analyse, maar ook algemene en gerichte contrast beeldvorming.

Muriene Echocardiografie en Ultrasound Imaging

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

In dit artikel beschrijven we de volledige experimentele procedure te reconstrueren, met een hoge resolutie, de fijne hersenen anatomie van fluorescent gelabelde muis hersenen. De beschreven protocol bevat monstervoorbereiding en clearing, specimen montage voor imaging, data post-processing en multi-schaal visualisatie.

Micronschaal Resolutie Optische Tomografie van Gehele Mouse Brains met confocale Light Sheet Microscopie

Deze studie toont de succesvolle implementatie van magnetische resonantiemicroscopiebeeldvorming aan als een niet-invasieve tool om de hartafwijkingen te beoordelen bij muizen die zijn getroffen door auto-immuun myocarditis. De gegevens geven aan dat de techniek kan worden gebruikt om de ziekteprogressie bij levende dieren te volgen.

Niet-invasieve evaluatie van cardiale afwijkingen in experimentele autoimmuun Myocarditis door Magnetic Resonance Imaging Microscopy in de muis

Hier presenteren we een protocol voor optische kaart brengen van de elektrische activiteit van de muis rechteratrium en vooral de sinusknoop, bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.

Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

Het protocol maakt gebruik van geavanceerde light-sheet microscopie samen met aangepaste methoden voor het opruimen van weefsel om ingewikkelde hartstructuren in knaagdierharten te onderzoeken, met een groot potentieel voor het begrijpen van cardiale morfogenese en remodellering.

Light-sheet beeldvorming om de hartstructuur in knaagdierharten te onthullen

Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van in vivo vierdimensionale echografie en ex vivo massaspectrometriebeeldvorming om biomechanische en biomoleculaire veranderingen in het cardiovasculaire systeem van muizen te beoordelen. Deze techniek wordt toegepast om cardiale remodellering te analyseren bij chirurgisch geïnduceerd myocardinfarct en vasculaire veranderingen bij ouder wordende dieren.

Multimodale studie van cardiovasculaire remodellering bij muizen: vierdimensionale echografie en massaspectrometriebeeldvorming

Leer mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart met tissue clearing en light-sheet microscopie. Deze methode behoudt de driedimensionale structuur en biedt micrometrische resolutie voor cardiovasculair onderzoek.

Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

Meer video's verkennen