Gelijktijdige Brightfield, Fluorescentie en Optische Coherentie Tomografische Beeldvorming van Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

Het algemene doel van deze procedure is om de integratie van drie beeldvormingssystemen in één apparaat aan te tonen, waardoor een gelijktijdige meting van de mechanische functie, ionische dynamiek en geometrische verandering van samentrekkend hartweefsel mogelijk is. In het bijzonder meten we de krachtproductie van het weefsel, calcium transients, lokale verplaatsingen en vormverandering. De combinatie van deze beeldvormende modaliteiten kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen bij hartaandoeningen, met grote gevolgen voor de ontwikkeling van effectieve behandelingsstrategieën.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de heterogeniteit van spieractiviteit te bestuderen. Het apparaat dat in dit protocol wordt gebruikt, bevat drie beeldvormingssystemen die hetzelfde monster kunnen weergeven, een brightfield-microscoop, fluorescentiemicroscoop en een optische coherentietomografie. Een reeks dichroïsche spiegels wordt gebruikt om de fluorescentie-emissie en het brightfield-transmissiebeeld te scheiden.

De fundamentele kenmerken van dit apparaat zijn twee onafhankelijk bediende montagehaken, een meetkamer met drie optisch heldere assen en een externe triggerlijn die de brightfield- en OCT-camera's synchroniseert met een stimulator. In deze video laten we zien hoe we harttrabeculae kunnen isoleren, voorbereiden en in beeld kunnen brengt en presenteren we enkele representatieve resultaten. Nadat je een hart hebt geëesdeerd van een verdoofde rat, breng je het over naar de dissectiekamer.

Trek met twee gebogen tangen de aorta over de perfusiekanule. Houd de aorta op zijn plaats met één tang. Open ondertussen de buisleiding om dissectieoplossing door de perfusiekanule te laten stromen.

Zodra de coronaire vasculatuur is ontdaan van bloed en het hart volledig is doordrenkt met dissectieoplossing, zet u de aorta vast met behulp van een hechting. Plaats het hart door de canule zo te draaien dat de linker kransslagader zichtbaar is op het superieure oppervlak. Speld de top van het hart op de bodem van de dissectiekamer.

Snij beide atria af. Snijd langs de rechterkant van het septum naar de top van het hart. Speld de geopende linkerventrikel vast aan de basis van de dissectiekamer.

Knip vervolgens langs de linkerkant van het septum, open de rechterventrikel en speld deze ook vast aan de basis van de dissectiekamer. Identificeer een vrijlopende trabecula in de rechterventrikel. Knip met behulp van de veerschaar en een tang het wandweefsel rond de trabecula.

Snijd vervolgens het wandweefsel doormidden, orthogonale naar de richting van de trabecula. Knip het wandweefsel af tot de afmeting geschikt is voor de gebruikte montageconfiguratie. Laat de accijnstrabecula in de dissectiekamer.

Spoel heet water, gedestilleerd water en vervolgens superfusaatoplossing door de meetkamer. Schakel de lichtbron van de brightfieldmicroscoop in en druk op F1 om opname mogelijk te maken. Pas de downstreamhaak handmatig aan totdat deze in het brightfield-beeld is gecentreerd.

Klik op nul stroomafwaartse as en schakel vervolgens stroomafwaarts uit om de motor in te schakelen. Verplaats de schuifregelaar downstream-instelpunt totdat het einde van de haak is uitgelijnd met de rand van het standaard interessegebied. Plaats de stroomafwaartse as opnieuw nul en verplaats de schuifregelaar voor het stroomafwaartse instelpunt naar 1.000.

Herhaal het proces met de upstream-haak, maar verplaats de schuifregelaar upstream-instelpunt niet nadat u de upstream-as opnieuw hebt nul. Klik op verplaatsen naar montage. Start het fluorescentieverlichtingssysteem door de lampschakelaar te draaien voordat u snel de subsystemen van de controller inschakelt door de hoofdschakelaar te draaien.

Schakel de bedrijfsmodus om naar turbo blanking door op de modusknop op het voorpaneel te drukken, gevolgd door twee en vervolgens één. Druk op de online knop om externe bediening in te schakelen. Pauzeer de superfusaatstroom door de meetkamer.

Vul de montagekamer met dissectieoplossing. Transporteer de trabecula met een spuit van één milliliter van de dissectiekamer naar de montagekamer. Laat de trabecula via de zwaartekracht in de montagekamer afdalen.

Verlaag het vloeistofniveau in de montagekamer zodat het waterpas staat met het midden van de haken. Pas de afstand tussen de haken aan om de slappe lengte van de trabecula weer te geven door de schuifregelaar stroomafwaarts in te stellen. Gebruik een microscoop om visualisatie te helpen, pak een van de stukjes eindweefsel licht vast met een tang en monteer deze op de upstreamhaak.

Monteer het andere stukje eindweefsel op de stroomafwaartse haak. Eenmaal stevig gemonteerd, verplaatst u de trabecula terug naar de meetkamer door op verplaatsen naar kamer te drukken en de superfusaatstroom te hervatten. Stel de stimulusfrequentie in op één, stimulusduur op 10 en stimulusspanning op 10.

Start de stimulatie door op stimulus te drukken. Schakel het brightfield-verlichtingssysteem in. Druk op F1 en selecteer een interessegebied dat een geried gebied van de gebruikersinterface omsluit.

Klik op sarcoomlengte berekenen om de gemiddelde sarcoomlengte in het gemarkeerde gebied te berekenen. Verhoog de spierlengte tot de gemiddelde sarcoomlengte ongeveer 2,32 micron is. Verplaats de spier door de schuifregelaar voor het middeninstelpunt op het tabblad midden- en scheidingsbesturingselement aan te passen, zodat de rand van de stroomafwaartse haak net zichtbaar is in de brightfield-afbeelding.

Verzamel de fluorescentie-informatie voor 10 twitches. Verhoog de centruminstelpuntwaarde met 200 en verzamel nog eens 10 twitches aan fluorescentie-informatie. Herhaal dit proces totdat de brightfield-afbeelding de upstream-haak bevat.

Verzamel de laatste ruiten aan fluorescentie-informatie. Breng de trabecula terug naar een centrale positie door de middelste instelpuntwaarde op nul in te stellen. Verminder de stimulusfrequentie tot 0,2 Hertz en schakel over van het K-H superfusaat naar de Fura-2 laadoplossing.

Meet het fluorescentiesignaal elke 10 minuten. Visualiseer het signaal op het PMT-signaaltabblad. Nadat het signaal van 360 nanometer met een factor 10 is toegenomen, geeft u de stimulusfrequentie terug aan één Hertz en schakelt u terug naar de K-H superfusaatoplossing.

Controleer de verhoudingsmeting elke 10 minuten totdat het signaal stabiliseert, waarna de gegevensverzameling kan beginnen. Breng de spier terug naar de positie waar de rand van de stroomafwaartse haak net aanwezig is in het brightfield-beeld. Leg fluorescentie-informatie vast door op fluorescentiebron inschakelen te klikken.

Begin met het streamen van hardwaregegevens. Stel op de gebruikersinterface van Brightfield Imaging de opnamemodus in op externe trigger, verhoog de framesnelheid tot 100 Hertz en stel het aantal beelden in op 100. Druk op control-shift-S, gevolgd door F1, om de brightfield imaging-gegevens voor dit venster op te nemen.

Verhoog de middelste instelpuntwaarde met 200 en herhaal het proces voor het vastleggen van brightfields. Ga door met het scanprotocol totdat de beeldvormingsgegevens zijn verzameld voor het laatste venster. Breng de trabecula terug naar een centrale positie door de middelste instelpuntwaarde op nul in te stellen.

Schakel de OCT-verlichtingsbron in door aan de hoofdtoets te draaien, op de aan / uit-knop te drukken, gevolgd door de SLDs-knop. Bedek de galvanometerkop en klik op achtergrond kregen om het achtergrondinterferentiepatroon te meten en af te trekken van de meting. Stel de beeldopnamemodus in op livebeeld.

Centreer de trabecula in de X- en Y-assen door de X- en Y-offsetwaarden aan te passen. Scan met de trabecula gecentreerd langs de y-as door de Y-positie aan te passen om de posities te vinden die overeenkomen met de upstream- en downstreamhaken. Noteer deze posities naar beneden.

Stel bereik Y in op het absolute verschil tussen deze waarden gedeeld door 10. Stel de beeldopnamemodus in op stimulus geactiveerd, bereik X tot 100 en klik op de knop actieve parameters instellen. Klik op gegevens streamen en verken deze vervolgens.

Om de regionale calcium- en brightfield-informatie over de gehele lengte van de hier gepresenteerde trabecula vast te leggen, waren zeven spierposities vereist. Dit cijfer van de gemiddelde kracht van elk van de posities bedekt suggereert dat twitch kracht ongestoord was door deze beweging, waaruit blijkt dat er geen positie afhankelijkheid van de daad van kracht productie. Deze scans verzameld met behulp van optische coherentie tomografie met een snelheid van 100 Hertz werd gesegmenteerd met behulp van de ImageJ plugin, Weka.

Elke doorsnede lijkt vervormd door het verschil tussen de laterale en diepteresoluties. Dit werd gecorrigeerd door elke as onafhankelijk te schalen met de bijbehorende resolutie. Na het schalen van de ruwe C-scan van de trabecula is de spier ongeveer cilindrisch.

De reflectie van de wand van de meetkamer kan soms overlappen met de spiergegevens, maar de segmentatiesoftware kan worden getraind om dit te verantwoorden. Eenmaal gesegmenteerd, kan het dwarsdoorsnedegebied langs de lengte van de spier gedurende de twitch worden berekend. Merk op dat deze specifieke trabecula een kleine tak heeft.

De beweging van de tak is ongeveer halverwege de trabecula duidelijk. Ten slotte kunnen de gesegmenteerde afbeeldingen worden omgezet in mazen om de constructie van geometrische modellen te helpen. Beeldvormingsgegevens die op elk van de zeven posities met een snelheid van 100 frames per seconde werden vastgelegd, werden aan elkaar gestikt om een enkel volledig beeld van de trabecula te creëren.

De verhouding van de weggelaten fluorescentie geassocieerd met het excitatielicht van 340 en 380 nanometer correleert met het intracellulaire calcium nadat de trabecula is geladen met Fura-2. Het gemiddelde van 10 intracellulaire calcium transients uit elk venster is afgestemd op het gebied waarin ze werden afgebeeld. Hoewel de piek van de transiënten voor deze trabecula redelijk consistent lijkt, verminderde het diastolische calcium langs de lengte.

Evenzo wijzen de resultaten van de berekeningen van verplaatsingstracking en sarcomerelengte ook op de aanwezigheid van regionale variabiliteit. De gebruikte markerloze trackingtechniek kan de verplaatsing van elke pixel berekenen. De geschiktheid van de schattingen van de sarcoomlengte werd getest op basis van de breedte en amplitude van de Gaussiaanse pasvorm voor het FFT-signaal.

Aan deze voorwaarden werd niet voldaan in het spiergebied tussen nul en 500 micron, zodat daar geen informatie over de lengte van sarcomen kon worden berekend. Gezien de bijbehorende verplaatsingen is het waarschijnlijk dat de sarcomen in dit gebied langwerpig zijn tijdens de contractiele fase van de twitch. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u harttrabeculae kunt isoleren en ze op betrouwbare wijze kunt voorbereiden op multimodale beeldvorming.

Dit proces legt een pad vast voor het verzamelen van een dataset die nodig is voor de constructie van fysiologisch geïnformeerde eindige-elementenmodellen van hartweefselcontractie.