Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

Dit protocol is belangrijk omdat het gebruikers in staat stelt om mitochondriënmonsters te bereiden van bevroren weefsels die uit eerdere studies zijn verzameld en gearchiveerd. Dit protocol vermindert ook het gebruik van levende dieren voor weefseloogst. Met deze techniek kunnen gebruikers eerder ingevroren archiefweefsels gebruiken om mitochondriën verrijkte monsters te bereiden door een zachte weefselvernietigingsmethode te gebruiken.

Deze bereidingswijze maximaliseert de opbrengst van mitochondriaal preparaat. Door het lezen van het protocol is het raadzaam om de beschikbaarheid van alle componenten en hulpmiddelen te garanderen, vooral de volledig opgeladen shredderaandrijving en oefen ook met enkele ongewenste weefsels om vertrouwd te raken met de stappen. Edina Kosa, een research associate van mijn laboratorium, demonstreert de procedure.

Noteer om te beginnen het gewicht van de buis met het hartweefsel. Weeg nu de lege buis en trek deze af van het eerder geregistreerde gewicht om een nettogewicht van het hartweefsel te verkrijgen. Doe het bevroren hartweefsel direct in het bekerglas van ijskoude oplossing.

Roer het vijf minuten door. Oefen tegelijkertijd met een pincet lichte druk uit op het weefsel om zoveel mogelijk bloed eruit te krijgen. Haal het zakdoekje eruit met een tang en knijp in het hart met een schone filterpapieren handdoek om bloed te verwijderen.

Plaats het weefsel vervolgens in een ander bekerglas met ijskoude oplossing. Na het roeren van het weefsel gedurende vijf minuten, droogt u het weefsel voorzichtig op een papieren handdoek en verwijdert u het vet, het geklonterde bloed, de oorschelpen en de fasciae. Pool het ventriculaire weefsel.

Om de weefselmonsters te versnipperen, plaatst u 50 tot 300 milligram hartweefsel in de weefselversnipperaarkamer vanaf de ramzijde en sluit u de ramzijde. Voeg vervolgens ongeveer 0,2 tot 0,8 milliliter wasbuffer toe aan de dopzijde van de buis. Gebruik het buisgereedschap om de shredderkamer met de shredderdop goed af te sluiten zonder deze te strak aan te spannen.

Plaats de shredderkamer in de shredderhouder met de ramzijde naar beneden voor ingeschakelde montage. Plaats en schakel het bit van de volledig opgeladen shredderdriver in met de shredderdop, zodat het bit goed op zijn plaats wordt vergrendeld en oefen vervolgens druk uit op de shredderdriver in de shredderkamer totdat de drukindicator op de shredderhouder een instelling van ongeveer twee bereikt. Druk op de trekker en laat de shredderdriver ongeveer 10 tot 12 seconden draaien terwijl de instelling op twee blijft staan.

Observeer de buis om ervoor te zorgen dat alle of het grootste deel van de weefselmassa door de lysisschijf in de bovenste shredderkamer wordt versnipperd en breng de buis indien nodig terug naar de shredderhouder om door te gaan met versnipperen. Na het versnipperen van het monster tilt u de shredderkamer uit de houdereenheid en gebruikt u het buisgereedschap om de shredderdop te verwijderen en op een schoon oppervlak te plaatsen voor later gebruik dat alleen binnen hetzelfde monster wordt aanbevolen om kruisbesmetting door andere weefselmonsters te voorkomen. Breng het versnipperde hartweefsel met een roerstaaf met 40 milliliter wasbuffer over in het derde bekerglas en roer het weefsel gedurende vijf minuten met een gemiddelde snelheid op de roerplaat.

Filter de suspensie door een voorbevochtigd nylon mesh monofilament. Na het weggooien van het filtraat was je het versnipperde weefsel drie keer op het filter met 10 milliliter wasbuffer. Breng het gewassen weefsel over in een bekerglas van 50 milliliter met 20 milliliter wasbuffer in het ijsbad op de magneetroer.

Voeg 0,5 milliliter trypsine-oplossing toe terwijl u gedurende 15 minuten constant roert. Ongeveer halverwege het roeren wordt de weefselsuspensie overgebracht in een losjes gemonteerde handheld glas-op-glas homogenisator die 15 milliliter volume kan bevatten. Homogeniseer de suspensie met vier tot vijf zachte slagen zonder schuim te produceren.

Plaats vervolgens het homogenaat in een bekerglas van 50 milliliter en meng op een roerplaat. Voeg vervolgens 10 milliliter van de isolatiebuffer met trypsineremmer toe aan het homogenaat en incubeer onder voorzichtig roeren. Na het opnieuw filteren van de suspensie door een nylon filter, slaat u het filter op in een conische buis van 50 milliliter en brengt u de deeltjesfractie die achterblijft op het filter over naar de glas-op-glas homogenisator.

Op 15 tot 20 milliliter van de wasbuffer en homogeniseer voorzichtig met de hand gedurende 25 tot 30 seconden. Na het combineren van het homogenaat met het filtraat en het balanceren van de buizen, centrifuge en vervolgens met behulp van een plastic pipet verwijdert u het supernatant waardoor 0,2 milliliter overblijft van de bovenkant van de donzige pellet. Filtreer het resulterende supernatant in een nieuwe conische buis met behulp van een nylon filter om verontreiniging te voorkomen en centrifugeer nog een keer.

Na het weggooien van het supernatant wast u de pellet twee tot drie keer door de isolatiebuffer aan de zijkant van de buis toe te voegen om te voorkomen dat de pellet breekt of verontreinigt. Gooi de donzige witte buitenste randlaag elke keer weg. Voeg vijf milliliter van de isolatiebuffer toe aan elke buis en breek de pellet met een pipet met een tip van één milliliter of een nieuwe transferpipet Verdun vervolgens de suspensie met 20 milliliter extra isolatiebuffer en centrifugeer de suspensie bij 8.500 X g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Na het weggooien van het supernatant resuspendeert u de pellet eerst in vijf milliliter en vervolgens in nog eens 15 milliliter van de resuspendatiebuffer en centrifugeer deze gedurende 15 minuten bij 8.500 X g bij vier graden Celsius. Gooi nu het supernatant weg en bewaar de bruine pellet met gewassen intacte mitochondriën. Resuspend de mitochondriën verrijkte pellet in 250 microliter van de resuspenderende buffer inclusief proteaseremmers.

Aliquot de suspensie in 25 microliter volume, snel invriezen in vloeibare stikstof en bewaren in een 80 graden Celsius diepvriezer voor meerdere jaren. Volgens het protocol werd het met mitochondriën verrijkte eiwit bereid uit het hart van nakomelingen geboren uit twee groepen zeugen. De ene werd tijdens de zwangerschap geoefend en de andere was sedentair.

Uit de analyse van het ETC-eiwitprofiel bleek dat de nakomelingen van geoefende zeugen relatief lagere niveaus vertoonden in sommige van de ETC-complexen. Mitochondriale eiwitten werden opgelost in een 3 tot 8% gradiënt BN-PAGE en immunoprobed met antilichaamcocktails. Zowel geoefende als sedentaire groepen vertonen meerdere supercomplexen.

De prominente supercomplexe toename die werd waargenomen was na negen maanden in de geoefende groep in vergelijking met de sedentaire groep. Mitochondria-verrijkte eiwitten verkregen uit verschillende leeftijdsgroepen van 48 uur drie maanden, zes maanden en negen maanden werden geanalyseerd voor de Complex I-II-activiteit met behulp van een kinetische test. De geoefende groep vertoonde een Complex I-II-activiteit in vergelijking met die van de sedentaire groep.

Haalbaarheid van functionele studies op mitochondriën verkregen uit bevroren weefsels en cellen wordt aangetoond door andere onderzoekers. De bereiding van mitochondriën verkregen uit bevroren weefsel kan worden toegepast voor een breed scala aan weefsels met minimale schade.