Bacteriofaag effectiviteit voor biocontrole van door voedsel overgedragen pathogenen geëvalueerd via high-throughput instellingen

Dit eenvoudig uit te voeren protocol evalueert de antibacteriële werkzaamheid van diverse bacteriofaagcombinaties, ook bekend als faagcocktails, onder verschillende omstandigheden in een high-throughput setting. De belangrijkste voordelen van de techniek zijn het vermogen om verschillende biotica en abiotische factoren, zoals temperatuur, te streamen die de faageffectiviteit onder verschillende omgevingsomstandigheden kunnen beïnvloeden. Deze methode kan het ontwerp van geschikte faagcocktails vergemakkelijken om de biocontrole en therapeutische resultaten te verbeteren en de interactie tussen bacteriële gastheren en bacteriofagen te bepalen.

Stel om te beginnen de microplaattest in met gefilterde tips om kruisbesmetting te voorkomen. Voeg eerst 180 microliter mTSB toe in de putten van kolommen één tot 12 van de 96-well microplaat en bereid vervolgens seriële tienvoudige verdunningen van elke faag voor in kolommen één tot acht van de steriele 96-well microplaten om de test op te zetten. Voeg 20 microliter individuele fagen of faagcocktails toe aan putjes één tot acht van de bovenste rij A van de microplaat.

Voor faagvrije en blanco controle voegt u 20 microliter mTSB toe aan de bovenste put van de kolommen negen tot en met 12. Meng tijdens het pipetteren de inhoud van de put minstens vijf keer met zachte en herhaalde aspiratie en wissel de uiteinden tussen verdunningen. Verwijder 20 microliter uit de laatste rij H en stel vervolgens een reservoir in voor de geteste bacteriestam door twee tot drie milliliter van de verdunde cultuur in het reservoir over te brengen met behulp van een pipet van één milliliter.

Voeg met behulp van een meerkanaalspoptiet 20 microliter van de verdunde bacteriecultuur toe aan elke put in kolommen één tot 10 terwijl u de uiteinden tussen elke toevoeging verandert. Dek af en incubeer de microplaat bij 37 graden Celsius. Verwijder met tussenpozen van twee uur de microplaat uit de incubator en lees de plaat af met behulp van een microplaatlezer.

U kunt de plaat ook incuberen in een microplaatlezer en deze na verloop van tijd lezen. Om de optische dichtheid bij 600 nanometer te onderzoeken met behulp van een microplaatlezer, opent u het programma op een microplaatlezer. Selecteer de eenvoudige modus in het venster met opstartopties en selecteer vervolgens Een nieuw protocol maken in Taakbeheer.

Kies in het venster Type plaat selecteren de optie Plaat met 96 bronnen in de vervolgkeuzelijst. Selecteer als detectiemethode Absorptie voor het leestype, selecteer de optie Eindpunt/kinetisch voor het type optiek, selecteer Monochromators en klik vervolgens op OK. Voer bij Leesstap 600 nanometer in voor golflengten, selecteer Normaal voor leessnelheid en klik OK.To stel de temperatuur voor de test in, klik op het selectievakje Incuberen en selecteer Incubator aan.Voer de gewenste temperatuur in het temperatuurvak in en klik vervolgens op OK. Klik op het selectievakje Voorverwarmen voordat u doorgaat met de volgende stap voor de incubatietemperatuur van 37 graden Celsius, hoewel de optie niet vereist is voor de testomstandigheden bij 22 graden Celsius. Als u wilt voorkomen dat het deksel tijdens de incubatie condenseert, stelt u het temperatuurverloop in door een waarde in het verloopvak in te voeren en vervolgens op OK te klikken. Klik vervolgens op het selectievakje Kinetisch om de kinetische instelling te openen.

Stel de runtime in voor 10 uur voor 37 graden Celsius incubatie of 22 uur voor kamertemperatuur en voer twee uur in als het leesinterval en klik vervolgens op OK. Klik op het selectievakje Schudden in het procedurevenster om de schudconditie in te stellen, indien nodig voor elke kinetische lezing. Selecteer Lineair als schudmodus en wijzig de duur in 30 seconden. Stel de lineaire frequentiewaarde in op 731 cycli per minuut en klik vervolgens op OK.In het dialoogvenster Protocolsamenvatting, klik op Plaatindeling, selecteer Blanco's, Assay Controls en Samples en klik op Volgende.

Nadat u de instellingen voor elk puttype hebt gedefinieerd, klikt u op Voltooien. Selecteer een bron-ID in de interface aan de linkerkant, wijs deze toe aan de matrix die wordt weergegeven in het venster Plaatindeling en klik vervolgens op OK. Klik op de knop Leesplaat, sla het protocol op als prt-bestand en klik op Opslaan. Plaats de plaat en klik op OK. Zodra het experiment is voltooid, slaat u het experiment op als een xpt-bestand en klikt u op Opslaan.

Exporteer de gegevens naar Excel door op de knop Ja in het berichtvenster te klikken voor verdere analyse. Klik op de selectie Ja/Nee opslaan en het selectievakje Niet meer vragen om de voorkeur op te slaan. Volgens het protocol werd een vergelijking van faageffectiviteit uitgevoerd met verschillende faagcombinaties, temperaturen, tijden en veelheid aan infecties, of MOIs.

Op basis van deze analyse werd de anti-O157 faageffectiviteit gemaximaliseerd na 14, 16 of 18 uur incubatie bij 22 graden Celsius. Om de faagdodende kinetiek van bacteriën te begrijpen, werden OD-waarden op 600 nanometer uitgezet tegen bemonsteringstijd, MOI's en faagbehandeling. De representatieve bacteriegroeicurves bij 37 graden Celsius worden getoond.

T4 remde de bacteriegroei volledig op elk bemonsteringstijdstip, zelfs bij lage MOI. Om de faag geremde bacteriegroei te analyseren, werden de gemiddelde OD-waarden van alle MOI's uitgezet tegen elke bemonsteringstijd en faagbehandeling. De representatieve grafieken bij twee temperaturen onthulden dat de faagdodende werkzaamheid, bijvoorbeeld voor T1 plus T4, werd verbeterd bij 22 graden Celsius in vergelijking met 37 graden Celsius.

De vergelijking van de algehele faageffectiviteit wordt getoond, wat het identificeren van de beste fasebehandeling vergemakkelijkt. Voor Escherichia coli stam 3081 was behandeling met fagen T4 en T5 plus T4 bijvoorbeeld de meest effectieve behandeling bij 37 graden Celsius. Bij 22 graden Celsius waren echter, naast T4, faag T1 plus T4, T1 plus T4 plus rV5 en vier faagcocktails effectief.

Bij het uitvoeren van deze procedure zijn uiterst nauwkeurig pipetteren, met name bij gebruik van een meerkanaalspipet en uniformiteit van de aanpak essentieel om vergelijkbare en interpreteerbare resultaten te verkrijgen. Vervolgexperimenten zijn nodig om de verdere prestaties van de meest invloedrijke cocktail in de screening te beoordelen, waardoor de opkomst van antifaagmutanten in een uitgebreid bouillonkweeksysteem en andere biologische matrices wordt voorkomen.