Formulering en akoestische modulatie van optisch verdampte perfluorkoolstof nanodruppels

Dit protocol maakt een eenvoudige en snelle synthese van optisch verdampte perfluorkoolstof nanodruppeltjes mogelijk en biedt een methode om de prestaties van deze deeltjes te verbeteren. Persoonsversie maakt verbetering van het contrast mogelijk door eerst de fase van de echografie te manipuleren. Het vereist geen extra apparatuur en kan worden uitgevoerd op elk programmeerbaar echografiesysteem.

Begin met het spoelen van een ronde bodemkolf van 10 milliliter met chloroform en spoel een gasdichte glazen spuit van 10 microliter en een milliliter met chloroform uit door herhaaldelijk het volledige spuitvolume aan te zuigen en in totaal drie keer te verdrijven. Voeg met behulp van de spuiten 200 microliter van 25 milligram per milliliter DSPE-mPEG-2000, acht microliter van 10 milligram per milliliter DSPC en één milliliter van één milligram per milliliter IR-1048 toe aan de ronde onderste kolf. Vergeet niet om de spuiten tussen lipiden of kleurstof schoon te maken om besmetting in de voorraad te voorkomen.

Verwijder het oplosmiddel met behulp van een roterende verdamper. Zorg ervoor dat het vacuüm langzaam wordt ingesteld op 332 millibar om stoten te voorkomen. Verlaag na vijf minuten de druk tot 42 millibar om eventueel water dat in de oplossing is gekomen te verwijderen.

Hang de lipidenkoek op in één milliliter PBS en soniceer of vortex bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten of totdat alle lipidenkoek is gesuspendeerd en opgelost in de oplossing. Breng de oplossing over in een glazen injectieflacon van zeven milliliter en plaats de injectieflacon in een glazen schaal gevuld met ijs om de oplossing gedurende vijf minuten te laten afkoelen. Spoel een gasdichte glazen spuit met perfluorohexaan uit.

Voeg vervolgens 50 microliter perfluorohexaan toe aan de injectieflacon met behulp van de spuit. Sonde soniceer het mengsel met de amplitude ingesteld op één, de procestijd ingesteld op 20 seconden, puls op ingesteld op één seconde en puls uitgeschakeld op vijf seconden. Wijzig vervolgens de instellingen zoals vermeld in het tekstmanuscript en soniceer het mengsel nogmaals.

Breng de nanoduppletoplossing over naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende drie minuten op 300 g om de grotere druppels die meer dan een micrometer zijn van de kleinere druppels te scheiden. Gooi de pellet weg en breng het supernatant over naar een andere centrifugebuis van 1,5 milliliter. Was het supernatant door gedurende vijf minuten op 3.000 g te centrifugeren om alle druppels in de oplossing te pelleteren.

Hang de PFCnD's opnieuw op in één milliliter PBS door de pellet op en neer te pipetteren en vervolgens gedurende één minuut in een badsonicater te soniceren. Verdun de voorraad PFCnD's 100 keer door 10 microliter PFCnD-voorraad toe te voegen aan 990 microliter PBS en bad soniceren om de PFCnD's te verspreiden voordat ze hun grootte meten. Meet de grootte van de druppels met behulp van dynamische lichtverstrooiing.

Ontgas water door een vacuümkolf van 500 milliliter te vullen met 400 milliliter gedeïoniseerd water, af te dichten met een rubberen kurk en de kolf aan te sluiten op de vacuümleiding. Open de vacuümleiding en dompel de bodem van de kolf onder in de badsonicater. Soniceer gedurende vijf minuten of totdat er geen gasbelvorming zichtbaar is.

Bereid 10% ammonium per sulfaatoplossing door 500 milligram op te lossen in vijf milliliter ontgast water. Draai de oplossing voorzichtig rond als het ammoniumpersulfaat niet volledig oplost. Voeg in een bekerglas van 400 milliliter met een roerstaaf op een roerplaat 150 milliliter ontgast water en 50 milliliter 40 acrylamide bisacrylamide-oplossing toe tot 200 milliliter acrylamide bisacrylamide-oplossing.

Roer het mengsel op 200 RPM om een goede menging mogelijk te maken zonder bubbels te introduceren. Weeg 400 milligram silica af en voeg het toe aan de 10% acrylamide bisacrylamide-oplossing om een 0,2% silica- en acrylamideoplossing te vormen. Bereid een vierkante mal voor met een cilindrische opname door de uiteinden van een plastic transferpipet af te snijden en deze in de mal te ondersteunen met laboratoriumtape.

Voeg twee milliliter ammoniumpersulfaatoplossing toe aan het bekerglas om een eindconcentratie van 0,1% te maken en voeg 250 microliter TEMED toe aan de fantoomoplossing. Laat de oplossing minder dan een minuut roeren. Giet de oplossing snel in de mal terwijl u voorzichtig bent om geen luchtbellen in de oplossing te brengen.

De oplossing moet binnen 10 minuten polymeriseren. Verwijder het fantoom door het platte uiteinde van een laboratoriumspatel rond de rand van de mal te laten lopen en de mal om te keren. Schakel het gepulseerde lasersysteem in en warm het op gedurende ongeveer 20 minuten volgens de instructies van de fabrikant.

Zorg ervoor dat de glasvezelbundel correct is aangesloten op de laseruitgang en dat de twee poten correct in de vezelbundelhouder zijn geplaatst. Nadat u het ultrasone beeldvormingssysteem hebt ingeschakeld, sluit u de array-beeldvormingstransducer aan op het systeem en bevestigt u de transducer in de houder om het beeldvlak uit te lijnen met de laserdoorsnede. Stel de pulsherhalingsfrequentie van het lasersysteem in op 10 hertz en plaats een vermogensmeter aan het einde van de vezelbundel om energie te meten.

Stem de Q-schakelaarvertraging af totdat de geschatte fluence 70 milijoule per vierkante centimeter is. Vul een van de kanalen in het polyacrylamamidefantoom met de ultrasone gel en het PFCnD-mengsel met behulp van een plastic sliptipspuit van één milliliter. Bedek de bovenkant van het kanaal royaal met ultrasone gel en verwijder eventuele bubbels met een plastic sliptipspuit van één milliliter.

Plaats ten slotte het polyacrylamamidefantoom onder de transducer en vezelbundel. Succesvolle formulering en centrifugale scheiding van de PFCnD's leveren druppels op met een diameter van ongeveer 200 tot 300 nanometer. De grootte van de druppels neemt in de loop van de tijd toe als gevolg van coalescentie en diffusie in een proces dat bekend staat als Ostwald-rijping.

Het contrast van de inclusie voor de eindpuls bleek ongeveer 3,2 keer groter te zijn, dat is een verbetering van 220% dan de P-puls. Het hyperechoïsche gebied werd berekend voor elk frame en genormaliseerd door het hyperechoïsche gebied van het eerste frame en vervolgens gemonteerd op een exponentieel vervalmodel. De karakteristieke vervaltijd van genormaliseerd hyperechoïsch gebied was tot 3,5 keer langer in N-pulsbeeldvorming in vergelijking met P-puls.

De B-mode differentiële beeldframes werden op tijd vastgelegd voor elke N-puls- en P-pulsbeeldvorming. Een van de belangrijkste dingen is om de lipiden op de bodem van de kolf te verdrijven om ervoor te zorgen dat ze op de juiste manier in de lipidenkoek worden opgenomen.