Synthetische antigeencontroles voor immunohistochemie

BSA-antigeengels zijn goed gekarakteriseerde reproduceerbare IHC-normen die bestaande controles kunnen aanvullen. Dit protocol maakt gebruik van standaard histologie en IHC-reagentia en -methoden om reproduceerbare normen van bekende samenstelling te maken. Deze controles bieden de mogelijkheid voor verschillende laboratoria om IHC-assays te kalibreren en te standaardiseren voor veel diagnostisch relevante assays.

Het is belangrijk om een geschikt oplosmiddel te vinden om het peptide of eiwit op te lossen. Het kan lastig zijn om antigeen en formaldehyde-oplossingen snel te mengen zonder bubbels te introduceren. Bereid om te beginnen 20 milliliter van een BSA-oplossing van 25% volume door vijf gram BSA-poeder te mengen in 14 milliliter PBS, in een conische buis van 50 milliliter totdat deze gelijkmatig wordt verdeeld.

Vortex de oplossing om het BSA-poeder op te lossen. Houd de oplossing 's nachts op vier graden Celsius voor volledige oplossing. Pas de volgende dag het uiteindelijke volume aan op 20 milliliter met PBS.

Bereid op dezelfde manier 20 milliliter van een BSA-oplossing van 31,3 volumeprocent door 6,26 gram BSA-poeder in 13 milliliter PBS te mengen. Na een nacht incubatie voor volledige oplossing, past u het uiteindelijke volume aan op 20 milliliter met PBS. Om te testen of het BSA-formaldehydemengsel een gel vormt, verwarmt u een warmteblok voor op 85 graden Celsius.

Meng vervolgens 700 microliter van de 25% BSA-oplossing met 700 microliter 37% formaldehyde. Meng goed door binnen vijf tot 10 seconden vijf keer op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren. Plaats direct na het mengen de gesloten microcentrifugebuis in het warmteblok, voorverwarmd tot 85 graden Celsius.

Verwijder na 10 minuten de buis uit het warmteblok. Laat het afkoelen en bevestig dat de gel zich heeft gevormd zoals verwacht. Bereid acht microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter voor en label deze duidelijk.

Bereid vervolgens een 5x peptide stock oplossing, voeg een 12,5 millimolar concentratie toe door de volledige massa van het geliberaliseerde peptide te resuspenderen in 60 microliter van het juiste oplosmiddel. Observeer de oplossing om ervoor te zorgen dat het peptide volledig is opgelost. Voeg vervolgens een extra volume oplosmiddel toe als dat nodig is om een 12,5 millimolaire oplossing te maken volgens het molecuulgewicht, de massa en de zuiverheid van de peptiden.

In dit voorbeeld heeft de 5x peptidevoorraad een eindvolume van 626,9 microliter. Andere peptidemonsters hebben een ander eindvolume nodig. Bereid vervolgens 150 microliter van een 1x peptide stock-oplossing voeg een 2,5 millimolar-concentratie toe door 30 microliter van de 5x peptidevoorraad te verdunnen in 120 microliter van het oplosmiddel.

Vortex de oplossing gedurende vijf seconden en centrifugeer bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens 700 microliter van een 0,5 millimolaire peptide BSA-oplossing door 140 microliter van de 1x peptidevoorraad te verdunnen tot 560 microliter van de 31,3% BSA-oplossing. Na vortexing, centrifugeer de oplossing bij kamertemperatuur.

Bereid op dezelfde manier vier opeenvolgende 10x seriële verdunning van de peptide BSA-voorraad door 70 microliter van de peptide BSA-oplossing toe te voegen aan 630 microliter van de 25% BSA-oplossing. Om de BSA-peptidegels te bereiden, voegt u 37% formaldehyde toe aan de peptide BSA-verdunningen in een één-op-één-verhouding die één monster tegelijk werkt. Meng goed door binnen vijf tot 10 seconden vijf keer op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren.

Plaats na het mengen de gesloten microcentrifugebuis gedurende 10 minuten in een hitteblok op 85 graden Celsius. Nadat alle peptide BSA- en formaldehyde-oplossingen zijn bereid en verwarmd, laat u de gels vijf tot 10 minuten afkoelen op de benchtop. Verwijder vervolgens met behulp van een schone, flexibele wegwerplaboratoriumspatel het gelmonster uit de microcentrifugebuis in één stuk.

En plaats het in een verzegelde container met ten minste 15 milliliter neutraal gebufferd formaline, met behulp van een afzonderlijke container voor elk monster. Als alternatief, met behulp van een nieuw scheermesje met één rand, snijdt u de onderkant van de microcentrifugebuis af en duwt u de gel uit de bodem met lucht of een geschikte sonde. Trim met behulp van een schoon enkelzijdig scheermes de gelkegel in cilindrische schijven van ongeveer vijf millimeter dik.

Nadat u de schijven in een biopsiewikkel hebt gewikkeld, plaatst u een grotere gelschijf in één cassette en de resterende gelschijven samen in een tweede cassette voor gebruik in weefselmicroarrayconstructie. Plaats de cassettegels voor het verwerken in ten minste 15 milliliter 10% neutraal gebufferd formaline per gel, met behulp van een afzonderlijke container voor elk monster. Verwerk vervolgens de gels in een geautomatiseerde histologie weefselprocessor volgens een groot weefselschema met druk en vacuüm.

Wanneer de monsterverwerking is voltooid, verwijdert u de cassettes uit de weefselprocessor en verplaatst u ze naar het insluitcentrum van paraffine. Nadat u de gels uit de biopsiewikkel hebt uitgepakt, sluit u de gels in paraffine in of insluit elk monster één schijf gel in een kleine mal van 15 bij 15 millimeter. En de resterende gelschijven samen in een tweede grotere mal.

Maak voor elke peptideverdunningsreeks twee glazen dia's met in totaal zes afzonderlijke secties. Eén sectie van elk van de vijf verdunningsreeksmonsters en één sectie van het BSA-monster met alleen negatieve controle. Na het snijden en drogen van de dia's, kleur de twee dia's die voor elk peptide zijn voorbereid met het gewenste primaire antilichaam.

Volgens standaard Immunohistochemie protocollen verwachten een relatief uniform signaal binnen elke gel sectie. Waarbij de verschillende gelmonsters een bereik van signaalintensiteit vertonen dat overeenkomt met de peptideverdunningen. Snijd voor de BSA-gelweefselmicroarrayconstructie vier micrometer dikke delen van de weefselmicroarray en kleur met een konijnmononaal antilichaam volgens laboratoriumstandaardprotocollen.

Beoordeel de resulterende vlekintensiteit kwalitatief door inspectie of koop kwantitatief digitale beeldscanning en -analyse. Na te hebben gereageerd met de juiste antilichamen, vertoonden negatieve controle BSA alleen gelmonsters een minimaal signaal. De signaalintensiteit in een individueel gelmonster is relatief uniform en neemt toe met toenemende antigeenconcentraties.

Meer dan 10% van de MDA-MB-175 cellen vertonen zwakke en volledig omtrekkende vliezige kleuring. Daarentegen vertoont meer dan 10% van de SKBR-3-cellen intense volledig omtrekkende vliezige kleuring Werk snel zodra de formaldehyde is toegevoegd, omdat de oplossingen zelfs bij kamertemperatuur beginnen te gelen. We gebruiken deze methode om IHC-controles uit te voeren bij het testen van nieuwe antilichamen om ons het vertrouwen te geven dat de test presteerde zoals verwacht, zelfs wanneer de testantistoffen geen signaal vertonen.

Weefsel- of cellijncontroles zijn inherent variabel. Synthetische antigeencontroles stellen ons in staat om het effect van het veranderen van specifieke ISD-reactieomstandigheden nauwkeuriger te meten.