Name: Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer hoe u G-eiwit gekoppelde receptoren zoals 5-HT 1A R in reuze unilamellaire lipide vesikels integreert met behulp van agarose zwelling. Deze methode biedt een reproduceerbare aanpak voor membraaneiwitonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Matthew Blosser voor de waardevolle discussie en het advies. Dit werk werd ondersteund door het Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) en de National Science Foundation (PHY-1915017).

1. Eiwitetikettering
<ol><li>Laat NHS-Rhodamine, 5-HT1A membraanfragmenten en één 7 K MWCO spin ontzoutingskolom bij kamertemperatuur in evenwicht brengen.</li>
	<li>Los 1 mg NHS-rhodamine op in 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO).</li>
	<li>Voeg 5 μL natriumbicarbonaatoplossing van 1 M toe om de pH van de 5-HT1AR-oplossing te verhogen tot pH 8.</li>
	<li>Voeg 3,66 μL van de NHS-rhodamine-oplossing toe aan 50 μL van de 5-HT1AR-oplossing en pipetteer voorzichtig op en neer in een microcentrifugebuis. OPMERKING: Zorg ervoor dat u ten minste 10x molaire overmaat nhs-rhodamine heeft.</li>
	<li>Houd het mengsel beschermd tegen licht en zet de rotator gedurende 1 uur op kamertemperatuur.</li>
	<li>Was een 7 k MWCO-centrifuge met 200 μL 1x fosfaatbufferzoutoplossing (1x PBS) driemaal gedurende 1,5 minuut bij 1,5 RCF voor elke wasbeurt.</li>
	<li>Voeg het gelabelde eiwit toe aan één kolom en balanceer de hoeveelheid in een andere microcentrifugebuis.</li>
	<li>Draai het gelabelde eiwit eenmaal gedurende 5 minuten bij 1,5 RCF.</li>
	<li>Neem een UV-vis spectrum met behulp van een nanodruppel spectrofotometer op 280 nm en 554 nm en bereken de etiketteringsefficiëntie volgens de handleiding van de fabrikant.</li>
	<li>Bewaar het gelabelde eiwit bedekt bij 5 °C tot verder gebruik. De oplossing is stabiel gedurende ongeveer een week na etikettering.</li>
</ol>2. GUVs met membraan-ingebouwde 5-HT 1A
<ol><li>Bereiding van materialen en reagentia
	<ol>
<li>Laat het eiwit, de lipiden en BSA (Bovine serum albumine) in evenwicht brengen tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Reinig gedurende deze tijd de coverslips door ze in methanol te plaatsen en gedurende 30 minuten bij 40 °C te soniceren. Zorg ervoor dat de methanol de dekvloeren volledig bedekt en dat het waterniveau in het waterbad boven het niveau van de methanol in de container ligt. OPMERKING: Methanol is giftig en moet worden gehanteerd in de juiste chemische kap.</li>
		<li>Droog de overtollige methanol op de deklips af met een zachte luchtstroom. Plaats het dekrek gedurende 15 minuten afgedekt in een oven van 40 °C om ervoor te zorgen dat de overtollige afdekplaten uitdrogen.</li>
		<li>Begin met het plasmareinigingsproces. Plaats eerst de afdekplaten in de plasmareiniger en sluit de luchtinlaatklep af om alle lucht in de kamer te evacueren.</li>
		<li>Zodra de kamer onder vacuüm is, reinigt u de afdekplaten gedurende 5 minuten met behulp van een hoge RF-vermogensinstelling en een bijna volledige stofzuiger, met slechts een lichte luchtinlaat in de vacuümkamer. Om het juiste plasmaniveau te garanderen, past u de opening van de vacuümkamer zodanig aan dat de resulterende kleur van het plasma een stabiel, helder roze is. OPMERKING: Het is cruciaal bij het gebruik van lucht dat het plasma een felroze kleur blijft voor de duur van de plasmabehandelingsstap, omdat een donkerdere paarse kleur aangeeft dat er een onjuiste hoeveelheid lucht in de kamer is en zal resulteren in een suboptimale plasmabehandeling.</li>
		<li>Zodra de 5 minuten zijn verstreken, schakelt u de RF-voeding uit en laat u het vacuüm los. OPMERKING: Zorg er bij verwijdering uit de plasmakamer voor dat de dekplaten bedekt blijven.</li>
	</ol></li>
	<li>Hydrogel voorbereiding
	<ol>
<li>Combineer 6 mg agarose bij ultralage smelttemperatuur met 300 μL ultrapuur water (d.w.z. 2% (w/v) agarose). OPMERKING: 2% agarose zal worden gebruikt om eiwitvrije GUVs te maken. Agarose-oplossing kan gedurende twee dagen bij 45 °C worden bewaard.</li>
		<li>Combineer 9 mg agarose bij ultralage temperatuur met 300 μL ultrapuur water voor 3 w/v% agarose zoals bereid in stap 3.1. 3% agarose zal worden gebruikt om eiwit opgenomen GUVs te maken.</li>
		<li>Vortex de oplossing kort voordat u ze gedurende 10 minuten op het warmteblok van 90 °C legt. Draai vervolgens de buis opnieuw voordat u deze overbrengt naar een warmteblok van 45 °C om deze in de gesmolten vorm te houden tot verder gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Agarose en eiwitmenging
	<ol>
<li>Meng 21 μL van 3% agarose met de 7 μL 5-HT1AR membraanfragmenten. Pipetteer vele malen langzaam op en neer om voldoende menging te garanderen. Incubeer vervolgens bij 45 °C gedurende 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Hydrogel en lipide depositie
	<ol>
<li>Voor eiwitvrije GUVs: Maak een dunne film op vers plasma gereinigde coverslips met 20 μL van 2% agarose. Laat snel nog een coverslip op de agarosedruppel vallen en schuif de coverslips voorzichtig uit elkaar om een dunne film op beide coverslips te maken. OPMERKING: Deze stap is lastig omdat het glijden van de druppel moet plaatsvinden terwijl de agarose nog in de gesmolten vorm is.</li>
		<li>Voor eiwit-opgenomen GUVs: Pipetteer het eiwit/agarose mengsel nog één keer op en neer en zet vervolgens 20 μL van de 2% agarose af op een plasma-gereinigde coverslip. Volg de aanwijzingen voor het uitglijden zoals hierboven beschreven.</li>
		<li>Laat de agarose 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.</li>
		<li>Zet de lipiden druppelsgewijs af op de agaroselaag. Gebruik in totaal 10 μL van 2 mg/ml 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC) met 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DPPE) gelabeld met ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (of lipidemengsel van belang) in chloroform bovenop de agarosefilm. Zet de druppels af met een gaschromatografienaald en verspreid één druppel per keer via een zachte luchtstroom. OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij deze stap om een relatief uniforme laag lipiden bovenop de hydrogel te maken. Chloroform is ook giftig en moet worden behandeld in de juiste chemische kap.</li>
		<li>Monteer de Sykes-Moore (S-M) kamers door een O-ring op de afdekplaat te plaatsen en vervolgens het bovenste onderdeel van de kamer bovenop de O-ring te plaatsen. Gebruik de sleutel van de fabrikant om de kamer te monteren door de kamercomponenten aan elkaar te schroeven om de kamer af te dichten en lekkage te voorkomen. OPMERKING: De bovenkant van de kamer moet op de O-ring worden aangedraaid, maar voorzichtigheid is geboden om ervoor te zorgen dat de afdekplaat intact blijft, omdat de afdekplaat kan barsten als de O-ring niet goed in de kamer zit. Zorg er ook voor dat de kamer goed genoeg is afgedicht, zodat de kamer niet lekt wanneer de zwellingsoplossing wordt toegevoegd. Als u de kamer niet voldoende aanspant, zal dit leiden tot lekken en verlies van monster.</li>
	</ol></li>
	<li>Zwelling en oogsten van blaasjes
	<ol>
<li>Hydrateer het hele systeem door voorzichtig 450 μL sucrose van 200 mM in 1x PBS te pipetteren en voorzichtig op de kamers te tikken om een adequate bufferdekking van de hydrogel-lipidelagen te garanderen. OPMERKING: De sucrose-oplossing kan worden vervangen door een rehydratatiebuffer met biologische sondes van belang.</li>
		<li>Plaats de kamers op 45 °C en bedek het bovenste deel van de kamer met een afdekplaat om verdamping te voorkomen. Laat het monster gedurende 1 uur opzwellen, beschermd tegen vuil en licht.</li>
		<li>Voeg 100 μL van 1 mg/ml BSA in ultrapuur water toe aan elke put van een 96-putplaat die bestemd is om te worden gebruikt. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
		<li>Drie keer wassen met ultrazuiver water en één keer met 200 mM sucrose in 1x PBS.</li>
		<li>Voeg ten slotte 200 mM glucose toe in 1x PBS tot de toevoeging van de GUV-monsteroplossing. OPMERKING: BSA werd gebruikt om GUV-adsorptie te blokkeren.</li>
		<li>Nadat u de hydrogel hebt laten opzwellen, schudt en tikt u voorzichtig op de kamer om eventuele GUVs los te maken die mogelijk aan het hydrogeloppervlak zijn bevestigd. Pipetteer vervolgens voorzichtig de GUV-sucrose-oplossing. OPMERKING: Als een optionele stap om ervoor te zorgen dat alle blaasjes van het oppervlak worden losgemaakt, pipetteer voorzichtig een deel van de sucrose-suspensie terug op het hydrogeloppervlak.</li>
		<li>Verplaats de suspensie in een eerder voorbereide microcentrifugebuis met 700 μL 200 mM glucose in 1x PBS. OPMERKING: De dichtheidsgradiënt zal leiden tot bezinking van de blaasjes naar de bodem van de centrifugebuis.</li>
		<li>Laat de blaasjes nog een uur bezinken om ervoor te zorgen dat de blaasjes naar de bodem van de microcentrifugebuis kunnen zinken, waardoor een optimale opvang mogelijk is.</li>
		<li>Na de bezinking van GUVs in glucose, breng 300 μL van de bodem van de centrifugebuis (de bezonken blaasjes) over in de eerder bereide en met BSA behandelde 96-well plaat om de blaasjes onder de confocale microscoop te onderzoeken. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de bodem van de microcentrifugebuis vermijdt om de hoeveelheid vuil die in het uiteindelijke monster wordt verzameld, te minimaliseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Controleer de monsters onder de microscoop.
	<ol>
<li>Laat een 488 nm laser op het monster schijnen (waarmee we het membraan kunnen visualiseren, omdat de dubbellaag is gelabeld met ATTO-488-DPPE).</li>
		<li>Schijn een 561 nm laser op het monster (waarmee we het eiwit kunnen visualiseren, omdat het is gelabeld met NHS-Rhodamine). OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het afbeelden van het monster, omdat fotooxidatie de blaasjes kan destabiliseren. Blaasjes werden op dezelfde dag waargenomen.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62830/62830fig01.jpg"> Figuur 1: Illustratie van de gedetailleerde protocolstappen. Gemaakt met BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62830/62830fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

We hebben twee stappen geïdentificeerd die van cruciaal belang zijn voor het succes van het algemene protocol: plasmabehandeling en lipideafzetting. Plasmareiniging van de coverslips is essentieel om ervoor te zorgen dat er voldoende dekking en hechting van de agarose hydrogel op de glazen afdekplaat is. Plasmareiniging bereikt twee dingen: ten eerste verwijdert het sporen van organisch materiaal van het glasoppervlak; ten tweede activeert het het dekvloeroppervlak, waardoor de bevochtigbaarheid toeneemt naarmate de hydr...

Synthetische modelmembranen zijn krachtige hulpmiddelen bij het onderzoeken van de fundamentele eigenschappen en functies van biomembranen. Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) zijn een van de meest prominente platforms om een verscheidenheid aan plasmamembraaneigenschappen te bestuderen en kunnen worden ontworpen om verschillende fysiologische omstandigheden na te bootsen1,2,3,4,5,6,7,8. Het is algemeen bekend dat het plasmamembraan en zijn organisatie een sleutelrol spelen in een groot aantal cellulaire processen, zoals signaaltransductie, adhesie, endocytose en transport9,10,11,12,13,14,15.
GUV's zijn vervaardigd met behulp van verschillende methoden, waaronder zachte hydratatie16, hydrogel zwelling17, elektroformatie18, microfluïdische technieken19,20,21,22, jetting23 en oplosmiddeluitwisseling24,25,26. Vanwege uitdagingen bij het omgaan met integrale membraaneiwitten (GMP's), zijn in vitro platforms om ze te bestuderen beperkt. GUV's bieden een vereenvoudigd platform voor het bestuderen van GMP's in een omgeving die hun oorspronkelijke omgeving nabootst. Hoewel er verschillende benaderingen zijn geweest voor eiwitreconstitutie in GUV's, ontstaan er uitdagingen door het opnemen van eiwitten met de juiste oriëntatie en het behoud van eiwitfunctionaliteit27.
De meest succesvolle eiwitreconstitutie in GUV's vereist de detergentenuitwisselingsmethode; waarbij de eiwitten uit hun oorspronkelijke omgeving worden opgelost door detergentia, gevolgd door eiwitzuivering en vervolgens de wasmiddelmoleculen via verschillende methoden worden vervangen door lipiden28. Terwijl detergentia dienen om de tertiaire structuur van GMP's tijdens de zuivering te stabiliseren, zijn wasmiddelmicellen een relatief onnatuurlijke omgeving voor deze eiwitten, die beter gestabiliseerd zijn, met name voor functionele studies, in lipide bilayers28,29,30. Bovendien was het opnemen van functionele transmembraaneiwitten in de lipide bilayer met behulp van traditionele GUV-fabricagetechnieken moeilijk vanwege de grootte, de delicatesse van deze eiwitten en de extra reinigingsmiddeluitwisselingsstappen die nodig zouden zijn27,31,32,33. Het gebruik van organisch oplosmiddel om reinigingsmiddelen te verwijderen veroorzaakt eiwitaggregatie en denaturering34. Een verbeterde detergent-gemedieerde methode is veelbelovend, maar voorzichtigheid is geboden voor de reinigingsmiddelverwijderingsstap en optimalisatie kan nodig zijn voor specifieke eiwitten31,35. Bovendien kunnen methoden die elektroformatie gebruiken de keuze van eiwitten beperken en mogelijk niet geschikt zijn voor alle lipidesamenstellingen, met name geladen lipiden31,36,37. Een andere techniek die is gebruikt, is peptide-geïnduceerde fusie van grote unilamellaire blaasjes (LUVs) die het gewenste eiwit met GUVs bevatten, hoewel het bewerkelijk bleek te zijn en kan leiden tot het inbrengen van vreemde moleculen - de fusogene peptiden33,38,39. Gigantische plasmamembraanblaasjes (GPMV's), die zijn afgeleid van levende cellen, kunnen worden gebruikt om sommige van deze problemen te overwinnen, maar ze maken minimale controle mogelijk over de resulterende lipide- en eiwitsamenstelling14,40,41. Daarom biedt de integratie van GMP's in de bilipide laag van GUVs met behulp van onze gemodificeerde agarose-zwellingsmethode een betrouwbare methode om deze eiwitten in de membraanomgeving verder te onderzoeken42,43,44,45.
Cellulaire signalering en communicatie omvat een familie van eiwitten die bekend staat als G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's); GPCR's behoren tot de grootste familie van eiwitten en worden geassocieerd met het moduleren van stemming, eetlust, bloeddruk, cardiovasculaire functie, ademhaling en slaap onder vele andere fysiologische functies46. In deze studie gebruikten we de menselijke serotonine 1A-receptor (5-HT1AR), een prototypisch lid van de GPCR-familie. 5-HT1AR kan worden gevonden in het centrale zenuwstelsel (CZS) en bloedvaten; het beïnvloedt tal van functies zoals cardiovasculaire, gastro-intestinale, endocriene functies, evenals deelname aan de regulatie van mood47. Een grote barrière voor GPCR-onderzoek komt voort uit hun complexe amfifiele structuur en GUVs bieden een veelbelovend platform voor het onderzoek naar verschillende interessante eigenschappen, variërend van eiwitfunctionaliteit, lipide-eiwitinteracties en eiwit-eiwitinteracties. Verschillende benaderingen zijn gebruikt om lipide-eiwitinteracties te bestuderen, zoals oppervlakteplasmonresonantie (SPR)48,49, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR)50,51, eiwitlipidenoverlay (PLO) assay51,52,53,54, inheemse massaspectrometrie55, isotherme titratiecalorimetrie (ITC)56,57 en liposoom sedimentatietest58,59. Ons laboratorium heeft de vereenvoudigde GUV-benadering gebruikt om het effect van lipide-eiwitinteracties op de eiwitfunctionaliteit te onderzoeken door BODIPY-GTPγS in te kapselen, dat bindt met de Giα-subeenheid in de actieve toestand van de receptor. Hun binding maakt de fluorofoor los en produceert een fluorescentiesignaal dat in de loop van de tijd kan worden gedetecteerd45. Bovendien onderzochten verschillende studies lipide-eiwitinteracties en de rol van eiwitten bij het detecteren of stabiliseren van membraankromming60,61, en het gebruik van een haalbare GUV-aanpak zou een belangrijk voordeel kunnen zijn.
Dit protocol demonstreert een eenvoudige methode om GPCR's op te nemen in het membraan van GUVs met behulp van een gemodificeerd agarose hydrogel-systeem17,42. Bovendien zou onze methode, op basis van ons eerdere werk, geschikt kunnen zijn voor GMP's die kortdurende blootstelling aan 30-40 °C kunnen verdragen. Kortom, we verspreiden een dunne film van agarose in combinatie met membraanfragmenten die de GPCR van belang bevatten. Na het doseren van deze laag zetten we een lipideoplossing af bovenop de agarose en laten we het oplosmiddel verdampen. Rehydratatie van het systeem werd vervolgens uitgevoerd met een waterige buffer, wat resulteerde in de vorming van GUVs met eiwit opgenomen in de lipide bilayer.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850375C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;TI-Eclipse omgekeerd microscoop</td><td>Nikon, Melville, NY</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850355C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>13/16&Prime; ID, 1&Prime; OD silicon O-ringen</td><td>Sterling Seal &amp; Supply, Neptune, IN</td><td>5-003-8770</td><td></td></tr><tr><td>16-bits Cascade II 512 electron-vermenigvuldigde charge coupled device camera</td><td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td><td>&nbsp;Cascade II 512</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>50 mW solid-state lasers op 488 nm en emissiefilter gecentreerd op 525 nm, en 561 nm met emissiefilter gecentreerd op 595 nm</td><td>Coherent, Santa Clara, CA</td><td>488/561-50-LS</td><td></td></tr><tr><td>5-HT1AR membraanfragmenten</td><td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td><td>RBHS1AM400UA</td><td></td></tr><tr><td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DPPE)</td><td>ATTO-TEC, Siegen, Duitsland</td><td>AD 488-155</td><td></td></tr><tr><td>Bench top plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>chloroform (CHCl3)</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td><td>CX1055</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (Chol)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C8667-5G</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-wels vlakke heldere bodem</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasoon</td><td>Elma, Singen, Duitsland</td><td>[niet langer verkocht op hoofdwebsite]</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>methanol (MeOH)</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td><td>MX0485</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (10x PBS)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>spinning-disc CSUX confocale kop</td><td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>standaard 25 mm nr. 1 glazen dekglasjes</td><td>ChemGlass, Vineland, NJ</td><td>CLS-1760</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sykes-Moore kamers</td><td>Bellco, Vineland, NJ</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-lage smelttemperatuur agarose</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5030</td><td></td></tr><tr><td>VWR Analog Heatblock</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>[niet langer verkocht op hoofdwebsite]</td><td></td></tr><tr><td>VWR Tube Rotator</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

constructie van modellipidenmembranen met g-eiwit gekoppelde receptoren (gpcr's)

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Robuust in vitro onderzoek naar de structuur en functie van integrale membraaneiwitten is een uitdaging geweest vanwege de complexiteit van het plasmamembraan en de vele factoren die het eiwitgedrag in levende cellen beïnvloeden. Giant unilamellar blaasjes (GUVs) zijn een biomimetisch en zeer afstembaar in vitro modelsysteem voor het onderzoeken van eiwit-membraaninteracties en het onderzoeken van eiwitgedrag op een precieze, stimulusafhankelijke manier. In dit protocol presenteren we een goedkope en effectieve methode voor het fabriceren van GUVs met de menselijke serotonine 1A-receptor (5-HT1AR) stabiel geïntegreerd in het membraan. We fabriceren GUVs met behulp van een gemodificeerde hydrogel-zwellingsmethode; door een lipidefilm af te zetten bovenop een mengsel van agarose en 5-HT1AR en vervolgens het hele systeem te hydrateren, kunnen blaasjes worden gevormd met goed georiënteerde en functionele 5-HT1AR opgenomen in het membraan. Deze GUVs kunnen vervolgens worden gebruikt om eiwit-membraaninteracties en lokalisatiegedrag via microscopie te onderzoeken. Uiteindelijk kan dit protocol ons begrip van de functionaliteit van integrale membraaneiwitten bevorderen, wat diepgaande fysiologische inzichten oplevert.

De concentratie van eiwit werd gemeten en de mate van etikettering werd berekend als de molaire verhouding tussen de kleurstof en het eiwit op 1:1. Door de GUVs te onderzoeken met behulp van confocale microscopie, konden we een succesvolle vorming en eiwitintegratie van de blaasjes bevestigen. De lipiden werden gelabeld met 0,4 mol% ATTO 488-DPPE en het eiwit werd covalent gelabeld via rhodamine NHS-estermodificatie van primaire amines. Figuur 2a en figuur 2b to...

Dit protocol maakt gebruik van agarose zwelling als een krachtige en generaliseerbare techniek voor het opnemen van integrale membraaneiwitten (GMP's) in gigantische unilamellaire lipide blaasjes (GUVs), zoals hier beschreven voor de reconstructie van het menselijke 1A serotoninereceptoreiwit (5-HT1AR), een van de klassen van farmacologisch belangrijke G-eiwit-gekoppelde receptoren.

Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Het bestuderen van integrale membraaneiwitten in hun oorspronkelijke omgeving was een uitdaging vanwege de complexiteit van het plasmamembraan. Gigantische unilamellaire lipide blaasjes, of GUVs, zijn een van de meest prominente platforms om biomembraaneigenschappen te bestuderen en ze kunnen worden ontworpen om verschillende fysiologische omstandigheden na te bootsen. Dit protocol beschrijft een methode om eiwit-geïncorporeerde GUVs te fabriceren op basis van spontane integratie, na hydrogelzwelling. Traditionele methoden om GUVs te fabriceren zijn niet generaliseerbaar voor integrale membraaneiwitincorporatie. Deze methoden zijn vaak laag rendement, methodologisch complex en ad hoc, niet van toepassing op brede klassen van eiwitten. Aan de andere kant vertegenwoordigt dit protocol een flexibele, robuuste en eenvoudige methode om functionele integrale membraaneiwitten op te nemen in GUVs.We hebben dit bereikt door een hydrogelsteiger te bereiden, die het eiwit bevat en er een dunne laag lipide bovenop afzet. In het hier gepresenteerde voorbeeld hebben we G-eiwitgekoppelde receptor, of GPCR, opgenomen in de GUVs.Bij rehydratatie van het hele systeem, GUVs knop van het oppervlak van de hydrogel met het membraan dat goed georiënteerde GPCR's bevat.Laat alle reagentia op kamertemperatuur komen. Reinig gedurende deze tijd de afdeksels door ze in methanol te plaatsen en gedurende 30 minuten bij 40

construction-model-lipid-membranes-incorporating-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Dit rapport beschrijft de screening van verschillende detergenten voor de voorbereiding van de visuele GPCR, rododenine, en het complex met mini-Go. Biochemische methoden die de kwaliteit van het complex in verschillende stadia tijdens de zuivering karakteriseren, worden gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar andere membraan eiwitcomplexen voor hun toekomstige structurele studies.

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

De diversiteit van membraanlipiden in structuur en samenstelling levert een belangrijke bijdrage aan cellulaire processen en kan een marker van ziekte zijn. Moleculaire dynamica-simulaties stellen ons in staat om membranen en hun interacties met biomoleculen met atomistische resolutie te bestuderen. Hier bieden we een protocol voor het bouwen, uitvoeren en analyseren van complexe membraansystemen.

Realistische membraanmodellering met behulp van complexe lipidenmengsels in simulatiestudies

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Optische biosensor technieken kunnen detecteren veranderingen in de massa in de buurt van het plasmamembraan van levende cellen en laten ons toe om cellulaire reacties in zowel individuele cellen en populaties van cellen te volgen. Dit protocol detectie van de modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren in intacte cellen die deze benadering beschreven.

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Leer hoe u G-eiwit gekoppelde receptoren zoals 5-HT 1A R in reuze unilamellaire lipide vesikels integreert met behulp van agarose zwelling. Deze methode biedt een reproduceerbare aanpak voor membraaneiwitonderzoek.

Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

Meer video's verkennen