Tweelaagse membraansandwichmethode voor Laodelphax striatellus Speekselcollectie

Kunstmatige voeding en speekselverzameling bieden een directe methode voor het detecteren van effectoren in insectenspeeksel. Dit is echter nog niet eerder in detail beschreven. Dit protocol is effectief voor speekselverzameling van saprofytische insecten.

Bovendien is het een eenvoudige techniek, omdat we medium gebruiken dat alleen sucrose bevat als een kunstmatig dieet. Het speeksel van saprofytische insecten kan van invloed zijn op het immuunsysteem van de gastheer om het voedingsgedrag te bevorderen en ziekteverwekkers over te brengen. Dit geneesmiddel dat kan worden gebruikt voor insectengedrag en het onderzoek naar insectenbottenpaden.

Dit is een eenvoudige methode om uit te voeren. Dit suggereert echter de opbouw van een schone experimentele omgeving omdat speeksel wordt verzameld voor verder onderzoek. Begin met het bereiden van een 5% sucrose-oplossing voor het kunstmatige dieet en filter de oplossing door een filter van 0,22 micron om bacteriële besmetting en onzuiverheden te verwijderen.

Honger ongeveer 200 kleine bruine plantentrechterlarven drie tot vijf uur uit voordat ze in een voedingskamer worden geïntroduceerd. Om vervolgens de glazen cilinders als voedingskamers voor te bereiden, bedek u het ene open uiteinde van de kamer met een paraffinemembraan voordat u de experimentele insecten introduceert, breng vervolgens de insecten over in de glazen cilinder en bedek het andere uiteinde van de kamer met uitgerekt paraffinemembraan. Voeg 200 microliter kunstmatig dieet toe aan het membraan en bedek de vloeistof met een andere laag uitgerekt paraffinemembraan.

Bedek ten slotte de kamer met aluminiumfolie en laat het uiteinde met het kunstmatige dieetapparaat blootgesteld aan het licht. Verzamel na 24 uur het SBPH-speeksel door de cilinder op vier graden Celsius te koelen om de insecten te immobiliseren, ontdek vervolgens de buitenste film en verzamel het kunstmatige dieet in steriele buisjes van 1,5 milliliter met behulp van een steriele pipet. Houd het verzamelde speeksel op min 80 graden Celsius tot de analyse.

Spoel vervolgens het binnenmembraan drie keer met 50 microliter vers kunstmatig dieet door zacht te pipetteren en verzamel het kunstmatige wasdieet in steriele buisjes van 1,5 milliliter. Voeg na de drie spoelingen vers kunstmatig dieet toe aan het binnenmembraan en plaats er een vers uitgerekt paraffinemembraan op. Filter ten slotte de verzamelde monsters door een filtereenheid van 0,22 micron om microben en andere verontreinigingen te verwijderen.

Breng de collectieve speekselmonsters over in een centrifugaalfilter van 500 microliter en 10 kilodalton. Centrifugeer het monster. Verzamel het supernatant en breng het uiteindelijke volume op 100 microliter.

Om de concentratie van het verzamelde speeksel te meten, schakelt u de UV-zichtbare spectrofotometer in en wast u de sokkels drie keer met dubbel gedestilleerd water. Selecteer de opties op het scherm in de volgende volgorde, eiwitten, eiwit A280. Selecteer het type en één absorptie-eenheid gelijk aan één milligram per milliliter.

Vink vervolgens het vakje aan voor basislijncorrectie, 340 nanometer. Laad vervolgens twee microliter van 5% sucrose waterige oplossing als blanco en raak vervolgens Leeg aan de onderkant van het scherm aan. Ten slotte, na het instellen van de normen, laadt u twee microliter van het verzamelde speeksel en registreert u de eiwitconcentratie.

Bij het voeden met 5% sucrose overleefde meer dan 80% van SBPH de eerste vier dagen. Vanaf de vijfde dag nam de sterfte echter snel toe tot 40% en op de zevende dag overleefde minder dan de helft van de SBPH. Een sds-pagina-analyse toonde aan dat de geconcentreerde speekselmonsters van RSV-geïnfecteerd SBPH-speeksel veel meer eiwitten bevatten dan de 5% sucrose-negatieve controle.

In een Western blot analyse voor detectie van het RSV capsid eiwit, een niet-geïnfecteerde en virulifere insecten. Het RSV-capsid-eiwit werd met succes gedetecteerd in het virulifere monster, een antilichaam ontworpen tegen het LssgMP-genproduct detecteerde een eiwit van 78 kilodalton in niet-geïnfecteerde en virulifere monsters, wat aantoont dat LssgMP een speekseleiwit is. Een QRT PCR-analyse van LssgMP-transcriptniveaus in verschillende weefsels toonde aan dat de Lssg-transcriptniveaus in de speekselklier 20-voudig hoger waren dan in het hele lichaam en de darm, wat de specifieke expressie van LssgMP in de speekselklier bevestigde.

Het uithongeren van de experimentele insecten voordat ze in de kamer worden geïntroduceerd, is noodzakelijk om de efficiëntie van onze speekselverzameling te waarborgen. Bovendien moet elke 24 uur een kunstmatig medium worden verzameld en uitgewisseld om microbiële besmetting in het verzamelde monster te verminderen. Deze techniek biedt een directe methode om de functie van speeksel bij het overbrengen van pathogenen te bestuderen.

Bovendien kan het helpen bij het bestuderen van de interactie tussen insectenpathogenen.