Extracellulaire vesikelopnametest via confocale microscoopbeeldvormingsanalyse

Dit protocol biedt een robuuste methodologie voor het analyseren van EV's op cellulair niveau en een praktische aanpak voor efficiënte EV-opname en EV-trackinganalyse. Deze methode van EV-etikettering elimineert co-neerslag van EV's en kleurstof, waardoor de EV-signalen worden verbeterd. Ev-opname wordt gemeten door volumetrische analyse om de geïnternaliseerde EV's te onderscheiden van de oppervlakkige EV's.

EV's zijn actieve lading, dus hun opname maakt de overdracht van biochemische moleculen mogelijk. Voor onderzoek naar EV-gebaseerde medicijnafgifte en kankertherapie kan deze techniek een beoordelingsinstrument zijn. EV-opname speelt een rol in intercellulaire communicatie en wordt onderzocht in verschillende onderzoeksgebieden, zoals kankerbiologie, neurowetenschappen en medicijnafgifte.

Dit protocol vergemakkelijkt mogelijk een efficiënte EV-opnametest. Injecteer voor de isolatie van extracellulaire blaasjes of EV's één milliliter voorbewerkte celkweekmedia in de monsterkamer van het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat. Om het apparaat te bedienen, draait u het apparaat in de benchtop spinmachine met 3000 RPM gedurende 10 minuten.

Verwijder na het draaien de vloeistof uit de afvalkamer door te pipetteren of aan te zuigen en herhaal deze procedure vervolgens twee keer voor het verwerken van nog eens twee milliliter van de celkweekmedia. Om vervolgens de geïsoleerde EV's te wassen, injecteert u één milliliter PBS in de monsterkamer en draait u het apparaat in de benchtop-spinmachine. Injecteer voor immunofluorescentie-etikettering van de EV's één microgram per milliliter ev-specifiek antilichaam in het elutiegat van het apparaat dat 100 microliter geïsoleerde EV's bevat.

Incubeer vervolgens gedurende een uur in het donker op een platenschudder om de gelijkmatige verdeling van het antilichaam over het monster te garanderen. Bevestig vervolgens een plakband op het elutiegat. Injecteer één milliliter PBS in de monsterkamer om resterende antilichamen uit te spoelen en draai het apparaat vervolgens totdat de monsterkamer leeg is.

Herhaal de was door nog een milliliter PBS in de monsterkamer te injecteren en het apparaat te laten draaien zoals eerder is aangetoond. Nadat u de restvloeistof uit de kamer hebt verwijderd, pipettert u de fluorescerend gelabelde EV's uit de membraankamer in een amberkleurige buis of microbuis. Bescherm de buis tegen licht tot gebruik.

Zaai vier keer 10 tot de vierde PC3-cellen in een schaal van 35 milliliter met één milliliter media. Laat de cellen zich 's nachts hechten in optimale celkweekomstandigheden. Was de volgende dag de aangehechte cellen tweemaal met exosoom-uitgeputte media.

Na het verdunnen van de fluorescerend gelabelde EV's tot de juiste concentratie met behulp van exosoom-uitgeputte media, voegt u de verdunde EV's toe aan de gehechte doelcellen en incubeert u gedurende de gewenste experimentele tijd. Na het verwijderen van niet-geïnternaliseerde EV's door de cellen driemaal te wassen met exosoomvrije media, labelt u het cytoplasma van de aangehechte cellen met één microgram per milliliter CMTMR en incubeert u in optimale celkweekomstandigheden. Voor levende celbeeldvorming plaatst u de voorbereide cellen in de incubator op het podium.

Nadat u de beeldvormingsparameters hebt ingesteld op basis van controlemonsters, bepaalt u de diepte van de doelcellen en het bereik van de stapelgrootte in de Z-richting om 3D-confocale afbeeldingen te verkrijgen en stelt u vervolgens de beeldacquisitie in op meerdere Z-gestapelde afbeeldingen van zowel celspecifieke kleurstof als EV-specifieke kleurstof tegelijkertijd. Gebruik voor beeldverwerking automatische beeldverwerkingssoftware. Als u virtuele oppervlakken van de cellen wilt bouwen, klikt u op Nieuwe oppervlakken toevoegen.

Als u de virtuele celoppervlakken wilt configureren, klikt u op de knop Toevoegen en selecteert u Kwaliteit als filtertype. Drempelwaarde voor de juiste waarde voor de lage limiet door visuele inspectie, stel de maximumwaarde voor de bovengrens in en klik op de knop Voltooien Volgende, om de virtuele stippen van de EV's te bouwen, klikt u op de knop Nieuwe spots toevoegen. Selecteer onder Algoritme-instellingen de optie Verschillende spotgroottes en Berekening van de kortste afstand, klik vervolgens op Volgende en selecteer Kanaal 1 Alexa Fluor 488 als bronkanaal.

Voer de juiste waarde in voor de geschatte XY-diameter onder Spotdetectie en klik op Volgende. Als u de virtuele EV-stippen wilt configureren, klikt u op de knop Toevoegen en selecteert u Kwaliteit als filtertype. Stel de onderste drempel in door een visuele inspectie en klik op Volgende Voor het type spotgebieden selecteert u Absolute intensiteit en klikt u op Volgende.

Als u het gebied van EV-stippen wilt drempelwaarden, voert u de juiste waarde in voor Regiodrempel bij visuele inspectie. Selecteer Diameter van onder Regiovolume en klik op Voltooien. Als u de gegroepeerde plekken in het gebouwde oppervlak wilt splitsen, klikt u op De bouwvlekken en gaat u naar Filters.

Klik vervolgens op de knop Toevoegen en selecteer Kortste afstand tot oppervlakken, Surfaces Surface 1 als filtertype. Nadat u de laagste drempel voor de lage limiet en de juiste waarde voor de bovengrens hebt ingesteld, klikt u op de knop Sectie dupliceren naar de nieuwe spots. Voor het automatisch tellen van EV's in de cellen klikt u op de selectie Gebouwde spots 1, gaat u naar Statistieken en exporteert u de waarde uit het totale aantal spots.

Als u het aantal cellen wilt ophalen, klikt u op De gebouwde oppervlakken 1, gaat u naar Statistieken en exporteert u de waarde van Totaal aantal oppervlakken uit Totaal. Ga ten slotte naar het tabblad Gedetailleerd onder Statistieken om het volume te exporteren. EV's geïsoleerd uit PC3-celkweekmedia met behulp van een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat werden gelabeld met een fluor-4-geconjugeerd EV-specifiek antilichaam en gevisualiseerd met behulp van 3D confocale microscopie.

De geïnternaliseerde EV's werden gevisualiseerd als puncta en een individuele EV.Post verwerking van deze beelden maakt de visualisatie en kwantificering van EV-internalisatie in de cellen mogelijk. De resultaten van de EV-opnametest geven aan dat het niveau van EV-opname afhankelijk is van de lengte van de incubatietijd. Het aantal geïnternaliseerde EV's kan worden genormaliseerd naar het ontvangende celvolume om de werkelijke snelheid van EV-opname voor de opgegeven cel te bepalen.

Deze procedure maakt het mogelijk om niet-geïnternaliseerde EV's systematisch uit te sluiten om het aantal geïnternaliseerde EV's nauwkeurig te meten. De grootteverdeling van geïnternaliseerde EV-stippen wordt hier weergegeven. Dus de belangrijkste stappen zijn het gebruik van het microfluïdische apparaat voor EV-etikettering, het minimaliseren van achtergrondfluorescentie bij het visualiseren van fluorescerende EV's en vervolgens de post-imaging analyse om geïnternaliseerde versus oppervlakkige EV's te bepalen.

Dus intracellulaire EV-tracking kan in realtime op een 3D-vlak worden uitgevoerd, en bovendien kan EV-trafficking-analyse op ruimtelijke / temporele resoluties en de co-lokalisatie van EV's met subcellulaire organellen worden bereikt. We geloven dus dat deze techniek een eenvoudigere, efficiëntere manier biedt om EV's te onderzoeken binnen de intra- en extracellulaire matrices voor onderzoekers binnen het cellulaire communicatieveld voor EV's.