Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose

Het grote voordeel van dit protocol is dat het minder arbeidsintensief en tijdrovend is dan de traditionele methode om kolonievormende eenheden te tellen om de intracellulaire groei van Mycobacterium tuberculosis te schatten. Deze techniek maakt het voor onderzoekers gemakkelijker om snel door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen te screenen met als doel ze opnieuw te gebruiken als gastheergerichte therapieën om tuberculose te behandelen. De methode is heel eenvoudig en ongecompliceerd.

Basiskennis van mycobacteriële en EO-drager T-celkweektechnieken zou voldoende zijn om het protocol stap voor stap te volgen. Breng om te beginnen zes tot acht milliliter verzwakte mycobacteriële cultuur H37Ra over van de T25-kolf in een polypropyleenbuis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis in een benchtopcentrifuge.

Breng de buis na het zorgvuldig verwijderen van de buis over naar de biologische veiligheidskast en wacht een minuut totdat de bacteriën zijn neergedaald. Giet het supernatant in de desinfecterende weggooicontainer. Vat vervolgens de buis samen en hang de bacteriën in het resterende medium door zachtjes op de zijkant van de buis te tikken en de bacteriën een minuut te laten bezinken.

Voeg twee milliliter voorverwarmde complete RPMI toe en meng deze in een conische buis van 50 milliliter. Om de mycobacteriën te resuspenderen, trekt u de suspensie op in een spuit van vijf milliliter uitgerust met een naald van 25 gauge. Werp vervolgens heel voorzichtig de zijwand van de buis uit om de aerosolproductie te minimaliseren en herhaal het proces zes tot acht keer.

Gooi de naald en spuit weg in een naaldencontainer in de bioveiligheidskast. Breng de suspensie over naar een microcentrifugebuis van twee milliliter en centrifugeer om eventuele resterende klonten te pelleteren. Breng de buis terug naar de veiligheidskast en laat de bacteriën zich een minuut nestelen.

Breng de bovenste 1 tot 1,5 milliliter van het supernatant over in een nieuwe buis. Gooi de originele buis weg in de afvalemmer met het ontsmettingsmiddel. Meng goed en voeg verschillende hoeveelheden van de mycobacteriële suspensie toe aan de twee putglazen kamerglaasjes en incubeer de dia's gedurende drie uur bij 37 graden Celsius.

Nadat u drie keer op en neer hebt gepipetteerd om niet-fagocytose bacteriën te verjagen, verwijdert u het medium uit de glazen kamerschuif. Was eenmaal met twee milliliter PBS. Ontdooi de aliquots van 4% PFA in PBS opgeslagen bij min 20 graden Celsius.

Verdun de aliquot tot 2% PFA en voeg twee milliliter toe aan elk putje. Na 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur, verwijder de schuif uit de veiligheidskast voor vlekken. Gooi PFA weg in de PFA-container voor chemisch afval en was de glijbaan onder een zachte stroom kraanwater.

Gebruik een plastic transferpipet om voldoende auramine te doseren om de cellen op de dia te bedekken en incubeer de dia gedurende één minuut bij kamertemperatuur in het donker. Was overtollige kleurstof van de glijbaan met kraanwater en voeg de blusser een minuut toe in het donker. Na het afwassen van de overtollige quencher, incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur met Hoechst-vlek in het donker.

Was dan Hoechst vlek af. En voeg na het aftappen van overtollig water een druppel antifade en een afdekslip toe. Onderzoek de aan de lucht gedroogde dia onder de fluorescerende microscoop met behulp van het 100x olieobjectief.

Mycobacteriën fluoresceren groen onder Fitz filter en kernen fluoresceren blauw onder DAPI filter. Tel het aantal mycobacteriën fagocytosed per cel en het percentage geïnfecteerde cellen om MOI te bepalen. Bereken het volume mycobacteriële suspensie dat nodig is om de vereiste MOI te bereiken op basis van het oppervlak van een put in de plaat.

Voeg na het mengen van de mycobacteriënsuspensie het berekende volume toe aan de cellen op 12 putplaten om de gewenste MOI te bereiken. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende drie uur om mycobacteriën te laten fagocyteren. Verwijder vervolgens de extracellulaire bacteriën door de putjes meerdere keren met warme RPMI te wassen.

Voeg 500 microliter lysisbuffer toe gedurende 10 minuten om de macrofagen in één putje van het drie uur durende monster te lyseren en verzamel het lysaat om de basisinfectiesnelheid te bepalen. Voeg vervolgens verse volledige RPMI en vereiste medicijndoses, of voertuigcontrole, toe aan de resterende putten. Incubeer de platen in de kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende één tot acht dagen, afhankelijk van het experimentontwerp.

Om het percentage tijd tot positiviteit, of TTP, van het initiële entmateriaal van het drie uur durende monster te bepalen, warmt u Middlebrook-bouillon en instrumentcultuurflessen op kamertemperatuur. Breng het medium over van de 12-wellsplaat naar de overeenkomstige gelabelde conische buizen en voeg 500 microliter steriele lysisbuffer toe aan elke put. Schraap na 10 minuten de cellen voorzichtig uit de put met een steriele schraper en combineer ze met het medium in de juiste conische buis.

Zodra de put is gewassen met 0,5 milliliter steriel PBS en gecombineerd met het medium en lysaat, breekt u de klonten door elk monster zes tot acht keer voorzichtig door een naaldspuit van 25 gauge te laten gaan. Verdun het monster in MB-bouillon door 900 microliter MB-bouillon toe te voegen aan 100 microliter monster en herhaal het oogstproces op de vereiste tijdstippen tijdens de incubatie. Bereid de flessen van het instrumentenpaneel voor door de rubberen dop te steriliseren met 70% alcohol.

Breng voldoende voedingssupplementen voor alle monsters over in een conische buis en gebruik een naald en spuit om 0,5 milliliter voedingssupplement in de instrumentcultuurfles te injecteren. Pipetteer vervolgens 500 microliter van het één-op-10 verdunde monster in een v-bodembuis van één milliliter. Gebruik een naald en spuit om de 500 microliter monster in de toegewezen instrumentkweekflessen te injecteren.

Nadat u de flessen zorgvuldig van de bioveiligheidskast naar het instrument hebt vervoerd om te worden geladen, drukt u op de laadknop op het geautomatiseerde microbiële detectiesysteem. Scan de barcodes op instrumentkweekflessen en plaats de flessen in de incubator van het detectiesysteem bij 37 graden Celsius gedurende maximaal 42 dagen. Lees en noteer de tijd die nodig is om positiviteit te bereiken vanaf het instrumentenscherm en bereken het percentage TTP.

Een positieve TTP duidt op mycobacteriële groei. Het geautomatiseerde vloeistofkweekinstrument bewaakte elke 10 minuten de koolstofdioxideniveaus en berekende TTP, wat het aantal dagen is vanaf de inenting totdat culturen als positief worden gemarkeerd. Een omgekeerde relatie tussen TTP- en log(10)-waarden van CFU in het initiële entmateriaal werd geïllustreerd.

Wanneer intracellulaire groei van Mycobacterium tuberculosis in macrofagen, bepaald door het opsommen van CFU, werd vergeleken met de beschreven geautomatiseerde kweekmethode, werd een significante correlatie tussen de resultaten verkregen. De groei van Mycobacterium tuberculosis werd grafisch weergegeven door de TTB-waarden tot acht dagen na infectie van macrofagen te vergelijken met de initiële TTP-waarde. Een vergelijkbare trend tussen CFU en vloeibare cultuur toonde significante remming van mycobacterium tuberculosis groei in macrofagen in de aanwezigheid van all-trans retinoïnezuur, of AtRA, in oplossing, of de equivalente dosis AtRA ingekapseld in PLGA microdeeltjes.

Een dosis-responsexperiment werd uitgevoerd in geïnfecteerde THP-1-cellen om de werkzaamheid van het antibioticum Linezolid alleen te bepalen, of de combinatie van linezolid en interferon gamma. Er werd geen significante interactie waargenomen tussen de geneesmiddelen. AFP-kleuring stelt ons in staat om een lage MOI te gebruiken om celdood te minimaliseren bij het infecteren van macrofagen en om ervoor te zorgen dat dezelfde MOI wordt gebruikt, ongeacht de gebruikte behandeling.

Volgens dit protocol kunnen lood-anti-tbc-geneesmiddelen worden geïdentificeerd en verder worden bestudeerd om hun in vivo werkzaamheid te onderzoeken.