Het meten van de samenstelling van cd95-doodsopwekkend signaleringscomplex en verwerking van procaspase-8 in dit complex

Apoptose-initiatie wordt gemedieerd door activering van caspasen op marker moleculaire platforms. We presenteren de detectie van het sleutelinitiatie celdoodcomplex DISC, dat dient als platform voor caspase-8 activering. Het voordeel van deze techniek is dat het de detectie van de assemblage en de samenstelling van het DISC-complex mogelijk maakt, samen met het verstrekken van informatie over caspase-8-verwerking in dit complex.

Begin het experiment met cellen die 80% tot 90% confluent zijn en zich hechten aan het gerecht. Gooi het medium weg en voeg vers medium toe aan de aanhangende cellen. Stimuleer vervolgens de cellen met de geselecteerde concentratie CD95L door de plaat onder een hoek te houden en het ligand in het medium te pipetteren zonder de aanhangende cellen aan te raken.

Om de cellen te oogsten, plaatst u de celschaal op ijs. Voeg 10 milliliter koude PBS toe aan de celsuspensie en schraap de aangehechte cellen van de plaat. Verzamel de celsuspensie in een buis van 50 milliliter.

Was de celschaal tweemaal met 10 milliliter koude PBS en voeg de wasoplossing toe aan dezelfde buis van 50 milliliter. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie op 500 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het weggooien van het supernatant, resuspend de celkorrel in een milliliter koude PBS.

Breng vervolgens de celsuspensie over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de celsuspensie en resuspend de celkorrel opnieuw in één milliliter koude PBS. Herhaal de centrifugering nogmaals, reuspend de celkorrel vervolgens in een milliliter lysisbuffer en incubeer deze gedurende 30 minuten op ijs.

Centrifugeer na incubatie het lysaat op maximale snelheid gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en breng het supernatant vervolgens over naar een schone buis. Gooi de pellet weg en verzamel een monster van 50 microliter van het lysaat in een andere buis om de eiwitconcentratie te bepalen. Voeg voor immunoprecipitatie twee microliter anti-APO1-antilichaam en 10 microliter bereide Protein A Sepharose-kralen toe aan het lysaat.

Voeg 10 microliter van de kralen alleen toe aan een aparte buis met het lysaat om te dienen als een kralencontrole. Incubeer het mengsel met het lysaat, de antilichamen en protein A Sepharose-kralen 's nachts bij vier graden Celsius met zachte menging. Centrifugeer het mengsel de volgende dag gedurende vier minuten bij vier graden Celsius op 500 keer G.

Na het weggooien van het supernatant, wast u de kralen door een milliliter koude PBS toe te voegen en het supernatant na centrifugeren weg te gooien. Herhaal deze stap minstens drie keer. Na het weggooien van de laatste PBS-was, zuigt u de kralen bij voorkeur op met een Hamilton-spuit van 50 microliter.

Om de Western blot uit te voeren, voegt u 20 microliter 4X laadbuffer toe aan de kralen en verwarmt u gedurende 10 minuten op 95 graden Celsius. Verwarm tegelijkertijd de lysaatregelaars gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius. Laad de lysaten, immunoprecipitanten en een eiwitstandaard op een 12,5% SDS-gel en voer uit met een constante spanning van 80 volt.

Nadat de gelrun is voltooid, brengt u de eiwitten van de SDS-gel over naar een nitrocellulosemembraan. Nadat de overdracht is voltooid, plaatst u het afgeveegde membraan in een doos en incubeert u het gedurende een uur in blokkerende oplossing onder voorzichtig roeren en wast u het membraan vervolgens drie keer gedurende vijf minuten met PBST. Om de eiwitten te detecteren, voegt u het eerste primaire antilichaam bij de aangegeven verdunning toe aan het membraan en incubeert u het 's nachts bij vier graden Celsius met zachte agitatie.

Was de volgende dag het membraan met drie PBST-wasbeurten van vijf minuten en incubeer vervolgens het membraan met 20 milliliter secundair antilichaam met zacht schudden gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was het membraan drie keer opnieuw met PBST. Voeg na het weggooien van de laatste PBST-was ongeveer één milliliter mierikswortelperoxidasesubstraat toe aan het membraan en detecteer het chemoluminescentiesignaal.

Stimulatie van baarmoederhalskanker HeLa-CD95-cellen met CD95L resulteerde in een hoog niveau van CD95 DISC-vorming gecontroleerd via CD95 immunoprecipitatie. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 en c-FLIPS werden waargenomen in deze CD95 immunoprecipitaties die wijzen op efficiënte DISC-vorming. De splitsingsproducten van p43-FLIP en p22-FLIP werden gedetecteerd in de immunoprecipitaties, wat wijst op caspase-8-activering.

HeLa-CD95-cellen die c-FLIP lang overexpressie gaven, werden gebruikt voor de analyse van CD95 DISC-vorming. Net als bij ouderlijke HeLa-CD95-cellen werd geen rekrutering van FADD, procaspase-9, procaspase-10, c-FLIP-eiwitten en PARP1 gedetecteerd in de immunoprecipitaties van deze cellen zonder CD95L-behandeling. Geactiveerde primaire T-cellen werden gekenmerkt door hoge niveaus van CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 en c-FLIPS in anti-CD95 immunoprecipitaties.

Deze techniek maakt de analyse van moleculaire DISC-vorming mogelijk, inclusief verwerking van caspase-8 op de DISC. Alle wasstappen zijn erg belangrijk. Bovendien moeten stimulatiepunten en incubatietijden serieus worden genomen.

Dit is de enige manier om de assemblage op het DISC-complex te meten. Om de activering van caspase-8 te meten, kan men echter ook caspase-8-activiteitstests implementeren. Deze aanpak stelde ons in staat om nieuwe inzichten te krijgen in apoptose-initiatie.