Transposon-insertion Sequencing als een hulpmiddel om bacteriële kolonisatiefactoren in een Burkholderia gladiolen symbiont van Lagria villosa Kevers op te helderen

Dit protocol is nuttig voor het uitvoeren van genetische manipulatie op symbiotische bacteriën, in dit geval specifiek op Burkholderia, en het identificeren van de genen die essentieel zijn voor het koloniseren van een insectengastheer. Transposon insertion sequencing is een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van een groot aantal voorwaardelijk essentiële genen tegelijkertijd in een enkel experiment. Begin met het inenten van een verse donorcultuur van E.coli-donor in 10 milliliter LB-medium aangevuld met kanamycine en DAP onder een steriele kap.

Ent Burkholderia gladiolen stam A ontvangende cellen in vijf milliliter KB medium. Incubeer de culturen bij 30 graden Celsius 's nachts op een shaker bij 250 RPM. Na nachtelijke groei centrifugeer je vier milliliter van elk van de culturen op 9.600 keer G gedurende zes minuten om de cellen te pelleteren en het supernatant weg te gooien.

Was de gepelletiseerde celculturen onder een steriele kap in KB-medium dat DAP bevat. En ten slotte, resuspend de culturen afzonderlijk in vier milliliter KB plus DAP-medium. Meng in een verse buis van 15 milliliter 250 microliter van de gewassen E.coli-donorcellen met één milliliter van de gewassen Burkholderia gladiolen stam A-ontvangercellen.

Spot 10 microliter van dit conjugatiecelmengsel op KB-agarplaten die DAP bevatten. Laat de plaat een uur ongestoord in de steriele kap bij kamertemperatuur rusten. Incubeer de platen met de vervoegingsvlekken bij 30 graden Celsius gedurende 12 tot 18 uur.

Voeg na incubatie twee tot vier milliliter 1X PBS toe aan de platen onder een steriele kap en gebruik een celschraper om de gekweekte bacteriële conjugatieplekken van de agar vrij te maken. Pipetteer vervolgens het geconjugeerde celmengsel in twee milliliter microfugebuisjes. Pellet de cellen door twee minuten te centrifugeren op 9.600 maal G.

Gooi het supernatant weg en was de pellet twee keer in één milliliter 1X PBS door op en neer te pipetteren. Resuspend de uiteindelijke pellet in 1.200 microliter 1X PBS. Meng goed en verdeel 100 microliter van het celmengsel op grote KB-agarplaten aangevuld met kanamycine en incubeer 's nachts bij 30 graden Celsius.

Tel het totale aantal transconjugante kolonies op de drie platen en extrapoleer om het geschatte aantal mutanten te berekenen dat in alle platen is verkregen. Om de kans op het verkrijgen van een representatieve bibliotheek te vergroten, moet u ervoor zorgen dat het totale aantal kolonies meerdere malen hoger is dan het totale aantal genen in het genoom. Om het succes van de conjugatie te bevestigen, voert u een PCR uit gericht op de inbrengcassette met behulp van 10 tot 20 monsterkolonies zoals beschreven in het manuscript.

Schraap onder een steriele kap de kolonies van de platen door één tot twee milliliter 1X PBS op de agar toe te voegen. Pool het celmengsel dat van de platen is afgeschraapt in buizen van 50 milliliter. Vortex de bibliotheek om grondig te mengen en splits vervolgens een milliliter van de gepoolde mutantenbibliotheek in verschillende cryobuizen.

Voeg een milliliter 70% glycerol toe aan de buisjes en bewaar bij min 80 graden Celsius. Selecteer een L.villosa-eierkoppeling en tel het aantal eieren dat doorgaat als de koppeling meer dan 100 eieren bevat. Om de hele eikoppeling te steriliseren, voegt u 200 microliter 70% ethanol toe en wast u de eieren voorzichtig gedurende vijf minuten, verwijdert u vervolgens de ethanol en wast u de eieren tweemaal met geautoclaveerd water.

Voeg 200 microliter 12% bleekmiddel toe en was de eieren voorzichtig gedurende 30 seconden. Verwijder het bleekmiddel onmiddellijk en was de eieren drie keer opnieuw met 200 microliter geautoclaveerd water. Infecteer de eieren in het gesteriliseerde eikoppeling met behulp van twee keer 10 tot de zes cellen per microliter van de gewassen mutantenbibliotheek in PBS.

Twee dagen nadat de geïnfecteerde keverlarven uitkomen, verzamel je 100 seconden instarlarven per microfugebuis van 1,5 milliliter en bewaar je ze bij min 80 graden Celsius. Om de in vitro controlebibliotheek te genereren, ent u 250 microliter van twee keer 10 tot de zes cellen per microliter van de mutantenbibliotheek in 10 milliliter KB-medium dat Kanamycine bevat. Na het extraheren van DNA uit de in vivo en in vitro gekweekte mutantenbibliotheken, deelt u het DNA met een ultrasoonapparaat.

Om te controleren of het DNA tot het gewenste groottebereik was gescheurd, laadt u vijf microliters van het ongehoorde en gescheurde DNA na vermenging met gel loading dye in een één-op-één verhouding op een 1,6% agarose gel run op 250 volt gedurende 40 minuten. Om de fragmentuiteinden voor te bereiden die nodig zijn voor adapterligatie, begint u met het toevoegen van drie microliter van het enzymmengsel en zeven microliter reactiebuffer aan 50 microliter van het gescheurde DNA en mengt u goed door pipetteren. Zet een thermocycler met een verwarmd deksel op groter dan of gelijk aan 75 graden Celsius en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 20 graden Celsius en 30 minuten bij 65 graden Celsius en houd de temperatuur vervolgens op vier graden Celsius.

Voeg voor adapterligatie 30 microliter ligatiemastermix, één microliter ligatieversterker en 2,5 microliter verdunde adapter toe aan de producten van de eindvoorbereidingsstap. Meng grondig door te pipetteren en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 20 graden Celsius in de thermocycler met het verwarmde deksel eraf. Voeg na 15 minuten drie microliter van het enzym toe.

Meng goed door te pipetteren en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius in een thermocycler met het deksel verwarmd op meer dan of gelijk aan 47 graden Celsius. Om de grootte van adapter geligeerd DNA te selecteren gericht op fragmenten van 250 basenparen, begint u met het vortexen van de magnetische kraaloplossing en plaatst u deze gedurende 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur. Voeg 0,3 keer kralen toe aan 96,5 microliter van het geligeerde DNA-mengsel en meng door grondig te pipetteren.

Incubeer het kralenmengsel gedurende vijf minuten. Plaats de buizen op een magnetische standaard om de kralen naar beneden te trekken en DNA-fragmenten van ongewenste grootte te verwijderen. Laat de kralen vijf minuten bezinken en breng dan het heldere supernatant over in een nieuwe microfugebuis.

Voeg 0,15 keer verse kralen toe aan het supernatant en meng door goed te pipetteren. Incubeer het kralenmengsel gedurende vijf minuten en plaats de buizen vervolgens op een magnetische standaard om de kralen die aan het doel-DNA zijn gebonden naar beneden te trekken. Wacht vijf minuten en gooi dan het supernatant weg, houd de kralen.

Voeg met de kralen op de magnetische standaard 200 microliter vers bereide 80% ethanol toe en wacht 30 seconden voordat u de ethanol weggooit zonder de kralen te verstoren. Verwijder de buizen uit de standaard en voeg 17 microliter van 0,1X TE of Low TE toe, meng vervolgens door 10 keer te pipetteren en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Plaats de buis op de magnetische standaard en neem 15 microliter van het door de grootte geselecteerde DNA voor PCR-1.

Vortex streptavidin kralen en plaats ze op kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten. Neem 32 microliter van de kralen en was ze met 500 microliter 1X bind- en wasbuffer. Voeg 32 microliter 2X bind- en wasbuffer toe en reuspend de kralen.

Voeg hieraan 32 microliter van de opgeschoonde PCR-1-producten toe. Meng grondig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Plaats het kralen-DNA-mengsel gedurende twee minuten op een magnetische standaard.

Pipetteer het supernatant als biotine-gelabeld DNA met de inbrengrand bindt aan streptavidin op de kralen. Was de kralen met 500 microliter 1X bind- en wasbuffer en was vervolgens de kralen met 200 microliter Low TE. Resuspend de DNA-gebonden kralen in 17 microliter Low TE. Het DNA van de in vivo en in vitro gekweekte mutantenbibliotheken geëxtraheerd en gefragmenteerd in een ultrasoonapparaat toonde de meerderheid van de fragmenten tussen 100 en 400 basenparen. De locatie van getransponeerde inserties over de vier replicons van Burkholderia gladiolen stam A genoom kan worden waargenomen in de peul.

Een samenvatting van de sequencing output en het aantal unieke inserties en genen geraakt in de drie replicaat in vivo en in vitro bibliotheken kan worden waargenomen in de tabel. Het belangrijkste om te onthouden is om de knelpuntgrootte van de populatie te berekenen tijdens de kolonisatie van de gastheer om een geschikte weergave van de bibliotheek te krijgen tijdens infectie. Corrigeer ook voor een compatibel aantal bacteriële generaties in vitro en in de gastheer.

Na het genereren van de transposon mutant bibliotheek, kan deze worden gescreend op selectieve media om mutanten te herstellen op basis van fenotypische verschillen. Zo kunnen specifieke genen worden geïdentificeerd die belangrijk zijn voor een aandoening.