Name: Bereiding van multifunctionele op zijde gebaseerde microcapsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor RNA-aptameren en riboswitches (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Leer hoe je DNA-gecodeerde sensoren functioneel houdt door plasmiden te immobiliseren in zijde-gebaseerde microcapsules. Deze biocompatibele methode maakt multiplexed biosensoren voor in vitro detectie van liganden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door LRIR 16RH3003J-subsidie van het Air Force Office of Scientific Research, evenals het Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S &T Priorities (ARAP) -programma van het Amerikaanse kantoor van de onderminister van Defensie voor Onderzoek en Engineering.
De plasmidevectorsequentie voor ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) werd genereus verstrekt door Dr. J. Gallivan. Zijderupsen cocons van Bombyx mori werden genereus gedoneerd door Dr. D.L. Kaplan van Tufts University, MA.

<ol><li>Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+devices+for+in+vitro+and+in+vivo+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).</li>
<li>Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitch-based+reversible+dual-color+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Riboswitch-based reversible dual-color sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).</li>
<li>König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genomics+and+synthetic+biology+applications+between+hopes+and+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns.</a> Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+An+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).</li>
<li>Chushak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synthetic+riboswitch+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems.</a> RNA Biology. , 1-12 (2021).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
<li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Grӓwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper-based%2C+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLoS One. 14 (3), 0210940(2019).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+environment-signal+detection+biosensors+with+cell-free+synthetic+biosystems%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems.</a> RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).</li>
<li>Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+compartmentalized+protein+synthesis+inside+double+emulsion+templated+liposomes+with+in+vitro+synthesized+and+assembled+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes.</a> Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
<li>Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+microcapsules%3A+Fresh+insights+and+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).</li>
<li>Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+and+structural+comparison+between+bright+and+dim+green+fluorescent+proteins+in+Amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus.</a> Scientific Reports. 4, 5469(2014).</li>
<li>Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrey%2C+B+%22Molecular+Diagnosis+of+Infectious+Diseases.+Methods+in+Molecular+Medicine%22">Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine</a>. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regeneration+and+reuse+of+silica+columns+from+PCR+purification+and+gel+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits.</a> Scientific Reports. 8, 12870(2018).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5%CE%B1-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), 0137466(2015).</li>
<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Drachuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+macromolecules+with+amino+acid-Poly%28Ethylene+Glycol%29+grafts+for+controlling+layer-by-layer+encapsulation+and+aggregation+of+recombinant+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells.</a> ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).</li>
<li>Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+multilayer+capsules+as+vehicles+with+tunable+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).</li>
<li>Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+activity+of+DNA-encoded+sensing+elements+through+confinement+in+silk+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).</li>
<li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+inhibition+of+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+layer-by-layer+assembly%3A+A+tribute+to+ACS+Nano+associate+editor+Helmuth+M%C3%B6hwald%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald.</a> ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).</li>
<li>Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-A+tool+for+structural+and+translational+DNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research.</a> APL Bioengineering. 5, 031504(2021).</li>
<li>Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+DNA+complexation+state+of+pBAE+polyplexes+in+cells+with+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy.</a> Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).</li>
<li>Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+of+nucleosome+core+particle+interactions+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans.</a> Scientific Reports. 8, 7046(2018).</li>
<li>Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+aspects+of+stabilization+of+compounds+in+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk.</a> Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).</li>
<li>Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+and+reducing+conditions+for+in+vitro+ribosome+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).</li>
<li>Ge, X., Luo, D., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+expression+under+macromolecular+crowding+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions.</a> PLoS One. 6 (12), 28707(2011).</li>
<li>Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+single+RNA+molecules+with+fluorogenic+mango+II+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays.</a> Nature Communications. 11, 1283(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li>
</ol>

De standpunten en meningen die hierin worden gepresenteerd, zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van DoD of zijn componenten

Selectief doorlatende hydrogel-microcapsules geladen met verschillende soorten DNA-gecodeerde sensorontwerpen kunnen volgens dit protocol worden bereid. Een van de onderscheidende kenmerken van de LbL-benadering is het vermogen om de complexiteit van microcapsules aan te passen tijdens de bottom-up assemblage, die meestal begint met de adsorptie van moleculaire soorten op offersjablonen. Door de concentraties van de initiële componenten, pH-omstandigheden en het aantal lagen zorgvuldig aan te passen, kunnen microcapsules...

Het gebied van synthetische biologie biedt unieke mogelijkheden om detectiemogelijkheden te ontwikkelen door gebruik te maken van natuurlijke mechanismen die door micro-organismen zijn ontwikkeld om hun omgeving en potentiële bedreigingen te monitoren. Belangrijk is dat deze detectiemechanismen meestal gekoppeld zijn aan een reactie die deze micro-organismen beschermt tegen schadelijke blootstelling, genexpressie reguleert om negatieve effecten te verminderen of inname van giftige materialen te voorkomen. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om deze micro-organismen te ontwikkelen om sensoren met hele cellen te maken die profiteren van deze natuurlijke reacties, maar ze opnieuw richten om nieuwe doelen te herkennen en / of een meetbaar signaal te produceren dat kan worden gemeten voor kwantificeringsdoeleinden (meestal fluorescentie)1,2. Momenteel wijzen zorgen over het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen (GGO's), met name bij introductie in het milieu of het menselijk lichaam, als gevolg van lekkage van hele cellen of een deel van hun genetisch materiaal, zelfs als het is ingekapseld in een polymeermatrix, erop dat alternatieve manieren nodig zijn om deze detectiebenaderingen te benutten3.
Een krachtige aanpak om de voordelen van op micro-organismen gebaseerde detectie te benutten zonder de zorg voor de inzet van GGO's is het gebruik van in vitro transcriptie/translatie (IVTT) systemen. Vanuit een praktisch perspectief bestaan IVTT-systemen uit een mengsel dat de meeste celcomponenten in een actieve toestand bevat en dat op verschillende manieren uit cellen is "geëxtraheerd", waaronder ultrasoonapparaat, kralenkloppen of andere4. Het eindproduct van dit proces is een biochemisch reactiemengsel dat al is geoptimaliseerd om transcriptie en translatie uit te voeren en dat kan worden gebruikt om verschillende sensoren in een "open vat" -formaat te testen, zonder de beperkingen die gepaard gaan met het gebruik van hele cellen (membraandiffusie, transformatie-efficiëntie, celtoxiciteit, enz.). Belangrijk is dat verschillende sensorcomponenten kwantitatief kunnen worden toegevoegd en hun effect kan worden bestudeerd door verschillende optische en spectrometrische technieken, zoals we hebben aangetoond5. Het is opgevallen dat de prestaties van IVTT-systemen inconsistent kunnen zijn; Recente studies hebben echter benaderingen aangetoond om hun voorbereiding en karakterisering te standaardiseren, wat van grote hulp is bij het bestuderen van hun prestaties in sensorontwerp6. Onlangs zijn veel voorbeelden van IVTT-systemen die worden gebruikt om op papier gebaseerde assays te maken door de lyofilisatie van hun componenten in papieren matrices gedemonstreerd, waaronder detectie van zware metaalionen, geneesmiddelen, quorumdetectie-elementen en andere 7,8,9. Een opwindende toepassingsruimte voor IVTT-gebaseerde sensoren is hun gebruik in detectietoepassingen in verschillende soorten omgevingen, waaronder bodem, water en het menselijk lichaam. Om deze IVTT-systemen in deze uitdagende omgevingen te implementeren, moet een inkapselingsbenadering worden geïmplementeerd om de IVTT-componenten te bevatten en te beschermen tegen degradatie.
De meest voorkomende inkapselingsbenaderingen voor IVTT-systemen omvatten het gebruik van lipidecapsules, micellen, polymersomen en andere nauw gesloten microcontainers10,11,12. Een nadeel van deze aanpak is de noodzaak om passieve of actieve mechanismen in te bouwen om materialen in en uit de containers te transporteren om communicatie met de externe omgeving mogelijk te maken en detectiemogelijkheden te bieden. Om enkele van deze problemen op te lossen, rapporteert de studie hier een methode die een eenvoudige maar effectieve aanpak biedt om de coderingsmaterialen voor verschillende sensorontwerpen in te kapselen die in IVTT-systemen moeten worden uitgedrukt. Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van Layer-by-Layer (LbL) depositie van een biopolymeer in de aanwezigheid van de plasmiden van belang om holle microcapsules met hoge porositeit te creëren, waardoor het beschermde genetische materiaal kan interageren met de verschillende componenten van de IVTT van keuze. De studie toonde aan dat ingekapselde plasmiden transcriptie en translatie konden sturen wanneer ze binnen deze polymere matrix werden geactiveerd, zoals blijkt uit de respons van een plasmide-gecodeerde aptamer en een riboswitch op hun overeenkomstige doelen. Bovendien beschermt deze LbL-coating de plasmiden maandenlang zonder speciale bewaarcondities.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T)</td><td>Lucerna</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5x T4 DNA Ligase Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6x Blue Gel Loading Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, black circular</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>BioReagent, voor moleculaire biologie, lage EEO</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>poeder of kristallen, BioReagent, geschikt voor celkweek</td></tr><tr><td>BlpI restrictie-enzymen</td><td>New England BioLabs</td><td>R0585S</td><td></td></tr><tr><td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td><td>FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>ACS reagent, &ge;99,9%</td></tr><tr><td>DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5,4 kb), BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #66788</td><td></td></tr><tr><td>DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>E. coli S30 extract systeem voor circulair DNA</td><td>Promega</td><td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1,5 mL</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofluoric acid, HF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695068</td><td>ACS reagent, 48%</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>mengsel van Kanamycin A (hoofdcomponent) en Kanamycin B en C</td></tr><tr><td>KpnI restrictie-enzymen</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>LB agar plate aangevuld met 100 &micro;g/mL ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>voorgegoten agar platen met 100 &micro;g/mL ampicilline</td></tr><tr><td>LB agar plate aangevuld met 50 &micro;g/mL kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0543</td><td>voorgegoten agar platen met 50 &micro;g/mL kanamycine</td></tr><tr><td>LB broth (Lennox grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Lithium bromide, LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td>ReagentPlus, &ge;99%</td></tr><tr><td>Max Efficiency DH5-&alpha; competent E. coli strain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>322415</td><td>watervrij, 99,8%</td></tr><tr><td>MilliQ-water</td><td>EMD MilliPore</td><td></td><td>Milli-Q Reference Water Purification System</td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfaat gebufferd zout)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, vertakking</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>gemiddelde Mw ~25.000</td></tr><tr><td>PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp;27104</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0,1-10,0 kb)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO? silica microspheres, 4,0 &micro;m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24331-15</td><td>10% waterige oplossing</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3,5K MWCO, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate, Na?CO?</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222321</td><td>ACS reagent, watervrij, &ge;99,5%, poeder</td></tr><tr><td>Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spectrum G235058</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro;L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Theophylline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633</td><td>watervrij, &ge;99%, poeder</td></tr><tr><td>Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td>Bevat 40 mM Tris-acetaat en 1 mM EDTA, pH 8,3.</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Gedestilleerde Water</td><td>FisherScientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit</td><td>ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding van multifunctionele op zijde gebaseerde microcapsules geladen met dna-plasmiden die coderen voor rna-aptameren en riboswitches

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

We introduceren een protocol voor de bereiding van met DNA beladen zijdefibroïnemicrocapsules via de Layer-by-Layer (LbL) assemblagemethode op offerende bolvormige kernen. Na adsorptie van een eerste laag en DNA-plasmiden werd de vorming van robuuste microcapsules vergemakkelijkt door β-vellen in de secundaire zijdestructuur te induceren tijdens acute uitdroging van een enkele zijdelaag. Vandaar dat de gelaagdheid plaatsvond via meerdere waterstofbindingen en hydrofobe interacties. Na adsorptie van meerlaagse schillen kunnen de kernschilstructuren verder worden gefunctionaliseerd met gouden nanodeeltjes (AuNP's) en/of antilichamen (IgG) om te worden gebruikt voor teledetectie en/of gerichte toediening. Het aanpassen van verschillende belangrijke parameters tijdens sequentiële depositie van belangrijke macromoleculen op silicakernen, zoals de aanwezigheid van een polymeerprimer, de concentratie van DNA en zijde-eiwit, evenals een aantal geadsorbeerde lagen, resulteerde in biocompatibele, DNA-beladen microcapsules met variabele permeabiliteit en DNA-belastingen. Bij het oplossen van silicakernen toonde het protocol de vorming aan van holle en robuuste microcapsules met DNA-plasmiden geïmmobiliseerd op het binnenoppervlak van het capsulemembraan. Het creëren van een selectief doorlaatbaar biocompatibel membraan tussen de DNA-plasmiden en de externe omgeving bewaarde het DNA tijdens langdurige opslag en speelde een belangrijke rol in de verbeterde outputrespons van ruimtelijk beperkte plasmiden. De activiteit van DNA-sjablonen en hun toegankelijkheid werden getest tijdens in vitro transcriptie- en translatiereacties (celvrije systemen). DNA-plasmiden die coderen voor RNA-oplichtende aptameren en riboswitches werden met succes geactiveerd met overeenkomstige analyten, zoals werd gevisualiseerd tijdens de lokalisatie van fluorescerend gelabelde RNA-transcripten of GFPa1-eiwit in de schaalmembranen.

Hier richt de studie zich op de functionaliteit van DNA-sjablonen die coderen voor verschillende sensorontwerpen (twee soorten RNA-gereguleerde transcriptie / translatie-elementen) na inkapseling in zijden eiwitcapsules. Microcapsules werden bereid via templated Layer-by-Layer (LbL) assemblage van de belangrijkste componenten: een prime-laag, DNA-plasmiden die sensorontwerpen coderen en zijdefibroïnebiopolymeer (figuur 2). Depositie van macromoleculen op een gelaagde manier maakt het mogelij...

Het protocol beschrijft de vorming van robuuste en biocompatibele DNA-beladen microcapsules als gemultiplexte in vitro biosensoren die verschillende liganden kunnen volgen.

Bereiding van multifunctionele op zijde gebaseerde microcapsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor RNA-aptameren en riboswitches

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

De betekenis van dit protocol is dat het een manier biedt om DNA-gecodeerde sensoren functioneel te houden door DNA-plasmide-sjablonen te immobiliseren in semi-permeabele biocompatibele microcapsules. De voorgestelde DNA-immobilisatiestechniek is veelzijdig. Het maakt de fabricage van multifunctionele biosensoren mogelijk met verschillende in vitro activeringsmechanismen.We stellen ons deze microcapsules voor, gekoppeld aan de juiste sensorelementen, die kunnen worden gebruikt om verschillende biologische processen te bestuderen, inclusief de afgifte van signaalmoleculen in verschillende omgevingen zoals biofilms en organen. Deze techniek kan inzicht geven in de biologische systemen op microschaal, met name hoe de immobilisatie van DNA en moleculaire overbelasting de kinetiek en het mechanisme van genactivering kunnen beïnvloeden. Begin met het afzetten van de polyethyleneimine-primelaag op de opofferende silica-, of SiO2-, microdeeltjes door één milliliter polyethyleneimine-oplossing toe te voegen aan 300 microliter van de microdeeltjes in een twee-milliliter microcentrifugebuis.Roer het mengsel op een ThermoMixer bij 800 rotaties per minuut onder omgevingsomstandigheden. Verzamel de microdeeltjes door centrifugatie bij 0,2 g gedurende één minuut bij kamertemperatuur, en verwijder voorzichtig het supernatant. Na 15 minuten, was de microdeeltjes vier keer met één milliliter DNase- en RNase-vrij gedeïoniseerd water door centrifugatie bij 0,2 g gedurende één minuut bij kamertemperatuur, waarbij het supernatant na elke centrifugatie wordt weggegooid.Pas vervolgens de concentratie van DNA-plasmiden aan van 50 tot 200 nanogram per microliter met DNase- en RNase-vrij gedestilleerd water, en gebruik één milliliter van de bereide oplossingen om het DNA op de met polyethyleneimine geprimede microdeeltjes af te zetten. Roer het mengsel van microdeeltjes voorzichtig op een ThermoMixer bij vier graden Celsius en 800 rpm gedurende 15 minuten, en verzamel vervolgens de microdeeltjes door centrifugatie bij 0,2 g gedurende één minuut. Markeer de buisjes voor DNA-plasmiden die coderen voor theofylline riboswitch, gekoppeld aan GFPa1 als ThyRS-GFPa1, en DNA-plasmiden die coderen voor Broccoli-aptamer als BrocApt.Verwijder voorzichtig het supernatant en was de microdeeltjes vier keer met één milliliter DNase- en RNase-vrij gedestilleerd water zoals eerder gedemonstreerd, waarbij het supernatant na elke centrifugatie wordt weggegooid. Om de zijdefibroïne-laag af te zetten, voegt u één milliliter van de gereconstitueerde waterige zijdefibroïnoplossing toe aan de met DNA geabsorbeerde microdeeltjes en roer het mengsel voorzichtig op de ThermoMixer bij 750 rpm gedurende 15 minuten bij 10 graden Celsius. Verzamel de microdeeltjes door centrifugatie en was ze vervolgens eenmaal met één milliliter DNase- en RNase-vrij gedestilleerd water, zoals eerder uitgelegd.Herhaal de centrifugatie en gooi het supernatant weg. Voeg 0,5 milliliter DNase en RNase gedestilleerd water toe en meng de microdeeltjes door te voortreden. Behandel vervolgens de microdeeltjes met 0,5 milliliter 100% methanol bij 10 graden Celsius gedurende vijf minuten op een ThermoMixer.Na het verzamelen van de microdeeltjes door centrifugatie, behandel de deeltjes met 100% methanol op de ThermoMixer bij 750 rotaties per minuut gedurende 10 minuten bij 10 graden Celsius voor bèta-sheet-vorming. Centrifugeer het mengsel bij 0,2 g gedurende één minuut bij vier graden Celsius om microdeeltjes te verzamelen voordat de deeltjes twee keer worden gewassen met één milliliter DNase- en RNase-vrij gedestilleerd water zoals eerder gedemonstreerd. Los de SiO2-kernen van microdeeltjes op door 8% fluorwaterstofzuur toe te voegen aan gepelletiseerde kernschaal-microdeeltjes.Breng de opgeloste deeltjesoplossingen over naar dialyse-apparaten en dialyseer ze tegen gedeïoniseerd water in een beker. Gebruik vervolgens een één-milliliter pipette om de zijde-microcapsules-suspensie uit dialyse-apparaten in nieuwe twee-milliliter microcentrifugebuisjes te verzamelen. Breng 100 microliters van de microcapsule-monster over in een enkele put van een glazen plaat met acht putjes en laat de capsules 20 tot 30 minuten sedimenteren voorafgaand aan beeldvorming met behulp van een confocale laserscanningmicroscoop of CLSM.Pipetteer 100 microliters van de suspensie van capsules in elke put van een glazen plaat. Voeg aan elke put sequentieel 300 microliters van de fluorfooroplossing met verschillende moleculaire gewichten toe, van het laagste tot het hoogste. Roer het mengsel door te piëtten op en neer en laat het mengsel gedurende één uur bij kamertemperatuur incuberen totdat de diffusie van de fluorfooroplossingen in evenwicht is.Breng later de plaat over naar een CLSM om elke put te beeldvormen met een 100x olië-immersielentikel bij een excitatiegolflengte van 488 nanometer. Identificeer het gebied van belang door het focale vlak aan te passen en concentreer u op de capsules die verschijnen in de vorm van cirkels met de grootste diameter. Voer de in vitro transcriptie/translatiereactie uit door sequentieel de celvrije componenten toe te voegen aan een monster microcapsules en het buisje gedurende vier uur bij 30 graden Celsius te incuberen.Controleer de fluorescentie op een platereader met een excitatiegolflengte van 488 nanometer en emissie voor GFP/FITC-filter bij ongeveer 510 nanometer. Beeld tenslotte de zijde-microcapsules af op het CLSM-systeem met behulp van lasers bij 488 en 561 nanometer. In de studie werden robuuste zijdefibroïne-microcaps geproduceerd met een homogene grootte van ongeveer 4,5 micrometer en een schildikte van ongeveer 500 nanometer.De permeabiliteit van de holle zijdefibroïne-capsuleschil werd geanalyseerd door de molecuulgewichtsafsnijdingsmethode te volgen. Een toename in de concentratie van een polyethyleneimine-primelaag leidt tot verhoogde colloïdale stabiliteit van microcapsules met meer doorlaatbare schalen, terwijl het elimineren van de primelaag leidt tot aggregatie van capsules met minder doorlaatbare schilmembraan.De GFPa1-expressiekinetica tijdens ThyRS-activering onthulde hogere GFPa1-

preparation-multifunctional-silk-based-microcapsules-loaded-with-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.

Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Levering blijft de belangrijkste uitdaging voor de therapeutische toepassing van kleine interfererende RNA (siRNA). Dit protocol omvat het gebruik van een multifunctionele en biocompatibele siRNA afleverplateau, bestaande uit arginine en polyethyleenimine geënte poreuze silicium microdeeltjes.

Poreuze Silicon Micropartikels voor Levering van siRNA Therapeutics

We presenteren een nieuwe methode die foto-responsieve blokcopolymeren gebruikt voor efficiëntere spatiotemporale controle van gen-stilzetting zonder detecteerbare off-target effecten. Bovendien kunnen veranderingen in genuitdrukking voorspeld worden door middel van straightforward siRNA release analyses en eenvoudige kinetische modellering.

Voorspellen van genstyling door middel van de spatiotemporale controle van siRNA-vrijgave van foto-responsieve polymere nanocarriers

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van kationische nanoliposomes, die is gebaseerd op de methode van de droge-film en kan worden gebruikt voor de veilige en efficiënte levering van in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA.

Generatie van kationische Nanoliposomes voor de efficiënte levering van In Vitro getranscribeerd Messenger RNA

Dit werk presenteert de voorbereiding van methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren (mBG) via de omkeerbare addition-fragmentatie Chain Transfer (RAFT) methode. De plasmide DNA-complexering van het verkregen mBG en hun transfectie efficiëntie werden ook onderzocht. De RAFT methode is zeer gunstig voor polymerisatie monomeren met speciale functionele groepen.

Methionine Gefunctionaliseerde biocompatibele blok copolymeren voor gerichte plasmide DNA-levering

Hier, wordt een protocol inzake de bescherming van DNA origami nanostructuren in Mg-uitgeput en nuclease-rijke media met behulp van natuurlijke kationische polysaccharide chitosan en synthetische lineaire polyethyleneimine (LPEI) coatings gepresenteerd.

Gentherapie geïnspireerd Polycation Coating voor bescherming van DNA Origami nanostructuren

We laten zien dat de synthese van fusogenic poreuze silicon nanodeeltjes voor effectieve in vitro en in vivo oligonucleotide levering. Poreuze silicon nanodeeltjes worden geladen met siRNA vormen de kern, die is bedekt door fusogenic lipiden door middel van extrusie te vormen van de shell. Targeting deel functionalization en karakterisering van het deeltje worden opgenomen.

Synthese, Functionalization en karakterisatie van Fusogenic poreuze Silicon nanodeeltjes voor Oligonucleotide levering

We beschrijven de engineering van een nieuw DNA-gebonden T7-RNA-polymerase om in vitro transcriptiereacties te reguleren. We bespreken de stappen voor eiwitsynthese en karakterisering, valideren proof-of-concept transcriptionele regulatie en bespreken de toepassingen ervan in moleculaire computing, diagnostiek en moleculaire informatieverwerking.

DNA-gebonden RNA-polymerase voor programmeerbare in vitro transcriptie en moleculaire berekening

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het produceren van mRNA-nanodeeltjes op basis van poly (bèta-aminoester) polymeren, eenvoudig op maat te maken door het ingekapselde mRNA te veranderen. De workflow voor het synthetiseren van de polymeren, de nanodeeltjes en hun in vitro essentiële karakterisering worden ook beschreven. Een proof-of-concept met betrekking tot immunisatie wordt ook toegevoegd.

Synthese en karakterisering van mRNA-geladen poly (bèta-aminoesters) nanodeeltjes voor vaccinatiedoeleinden

We presenteren een protocol voor het bereiden van synthetische biomoleculaire condensaten bestaande uit amfifiele DNA-nanosterren uitgaande van hun samenstellende DNA-oligonucleotiden. Condensaten worden geproduceerd uit een enkele nanostercomponent of twee componenten en worden gemodificeerd om in vitro transcriptie van RNA van een ingebedde DNA-sjabloon te ondersteunen.

Synthetische condensaten en celachtige architecturen van amfifiele DNA-nanostructuren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de afgifte van chitosan/dsRNA-nanodeeltjes in larven van zijderups Bombyx mori om genuitschakeling te induceren door inslikken.

Larvale RNA-interferentie in zijderups Bombyx mori door Chitosan/dsRNA-afgifte van nanodeeltjes

Leer hoe je DNA-gecodeerde sensoren functioneel houdt door plasmiden te immobiliseren in zijde-gebaseerde microcapsules. Deze biocompatibele methode maakt multiplexed biosensoren voor in vitro detectie van liganden.

Bereiding van multifunctionele op zijde gebaseerde microcapsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor RNA-aptameren en riboswitches (Video) | JoVE Journal

Bereiding van multifunctionele op zijde gebaseerde microcapsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor RNA-aptameren en riboswitches

Meer video's verkennen