Bereiding van multifunctionele op zijde gebaseerde microcapsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor RNA-aptameren en riboswitches

De betekenis van dit protocol is dat het een manier biedt om DNA-gecodeerde sensoren functioneel te houden door DNA-plasmide-sjablonen te immobiliseren in semi-permeabele biocompatibele microcapsules. De voorgestelde DNA-immobilisatiestechniek is veelzijdig. Het maakt de fabricage van multifunctionele biosensoren mogelijk met verschillende in vitro activeringsmechanismen.

We stellen ons deze microcapsules voor, gekoppeld aan de juiste sensorelementen, die kunnen worden gebruikt om verschillende biologische processen te bestuderen, inclusief de afgifte van signaalmoleculen in verschillende omgevingen zoals biofilms en organen. Deze techniek kan inzicht geven in de biologische systemen op microschaal, met name hoe de immobilisatie van DNA en moleculaire overbelasting de kinetiek en het mechanisme van genactivering kunnen beïnvloeden. Begin met het afzetten van de polyethyleneimine-primelaag op de opofferende silica-, of SiO2-, microdeeltjes door één milliliter polyethyleneimine-oplossing toe te voegen aan 300 microliter van de microdeeltjes in een twee-milliliter microcentrifugebuis.

Roer het mengsel op een ThermoMixer bij 800 rotaties per minuut onder omgevingsomstandigheden. Verzamel de microdeeltjes door centrifugatie bij 0,2 g gedurende één minuut bij kamertemperatuur, en verwijder voorzichtig het supernatant. Na 15 minuten, was de microdeeltjes vier keer met één milliliter DNase- en RNase-vrij gedeïoniseerd water door centrifugatie bij 0,2 g gedurende één minuut bij kamertemperatuur, waarbij het supernatant na elke centrifugatie wordt weggegooid.

Pas vervolgens de concentratie van DNA-plasmiden aan van 50 tot 200 nanogram per microliter met DNase- en RNase-vrij gedestilleerd water, en gebruik één milliliter van de bereide oplossingen om het DNA op de met polyethyleneimine geprimede microdeeltjes af te zetten. Roer het mengsel van microdeeltjes voorzichtig op een ThermoMixer bij vier graden Celsius en 800 rpm gedurende 15 minuten, en verzamel vervolgens de microdeeltjes door centrifugatie bij 0,2 g gedurende één minuut. Markeer de buisjes voor DNA-plasmiden die coderen voor theofylline riboswitch, gekoppeld aan GFPa1 als ThyRS-GFPa1, en DNA-plasmiden die coderen voor Broccoli-aptamer als BrocApt.

Verwijder voorzichtig het supernatant en was de microdeeltjes vier keer met één milliliter DNase- en RNase-vrij gedestilleerd water zoals eerder gedemonstreerd, waarbij het supernatant na elke centrifugatie wordt weggegooid. Om de zijdefibroïne-laag af te zetten, voegt u één milliliter van de gereconstitueerde waterige zijdefibroïnoplossing toe aan de met DNA geabsorbeerde microdeeltjes en roer het mengsel voorzichtig op de ThermoMixer bij 750 rpm gedurende 15 minuten bij 10 graden Celsius. Verzamel de microdeeltjes door centrifugatie en was ze vervolgens eenmaal met één milliliter DNase- en RNase-vrij gedestilleerd water, zoals eerder uitgelegd.

Herhaal de centrifugatie en gooi het supernatant weg. Voeg 0,5 milliliter DNase en RNase gedestilleerd water toe en meng de microdeeltjes door te voortreden. Behandel vervolgens de microdeeltjes met 0,5 milliliter 100% methanol bij 10 graden Celsius gedurende vijf minuten op een ThermoMixer.

Na het verzamelen van de microdeeltjes door centrifugatie, behandel de deeltjes met 100% methanol op de ThermoMixer bij 750 rotaties per minuut gedurende 10 minuten bij 10 graden Celsius voor bèta-sheet-vorming. Centrifugeer het mengsel bij 0,2 g gedurende één minuut bij vier graden Celsius om microdeeltjes te verzamelen voordat de deeltjes twee keer worden gewassen met één milliliter DNase- en RNase-vrij gedestilleerd water zoals eerder gedemonstreerd. Los de SiO2-kernen van microdeeltjes op door 8% fluorwaterstofzuur toe te voegen aan gepelletiseerde kernschaal-microdeeltjes.

Breng de opgeloste deeltjesoplossingen over naar dialyse-apparaten en dialyseer ze tegen gedeïoniseerd water in een beker. Gebruik vervolgens een één-milliliter pipette om de zijde-microcapsules-suspensie uit dialyse-apparaten in nieuwe twee-milliliter microcentrifugebuisjes te verzamelen. Breng 100 microliters van de microcapsule-monster over in een enkele put van een glazen plaat met acht putjes en laat de capsules 20 tot 30 minuten sedimenteren voorafgaand aan beeldvorming met behulp van een confocale laserscanningmicroscoop of CLSM.

Pipetteer 100 microliters van de suspensie van capsules in elke put van een glazen plaat. Voeg aan elke put sequentieel 300 microliters van de fluorfooroplossing met verschillende moleculaire gewichten toe, van het laagste tot het hoogste. Roer het mengsel door te piëtten op en neer en laat het mengsel gedurende één uur bij kamertemperatuur incuberen totdat de diffusie van de fluorfooroplossingen in evenwicht is.

Breng later de plaat over naar een CLSM om elke put te beeldvormen met een 100x olië-immersielentikel bij een excitatiegolflengte van 488 nanometer. Identificeer het gebied van belang door het focale vlak aan te passen en concentreer u op de capsules die verschijnen in de vorm van cirkels met de grootste diameter. Voer de in vitro transcriptie/translatiereactie uit door sequentieel de celvrije componenten toe te voegen aan een monster microcapsules en het buisje gedurende vier uur bij 30 graden Celsius te incuberen.

Controleer de fluorescentie op een platereader met een excitatiegolflengte van 488 nanometer en emissie voor GFP/FITC-filter bij ongeveer 510 nanometer. Beeld tenslotte de zijde-microcapsules af op het CLSM-systeem met behulp van lasers bij 488 en 561 nanometer. In de studie werden robuuste zijdefibroïne-microcaps geproduceerd met een homogene grootte van ongeveer 4,5 micrometer en een schildikte van ongeveer 500 nanometer.

De permeabiliteit van de holle zijdefibroïne-capsuleschil werd geanalyseerd door de molecuulgewichtsafsnijdingsmethode te volgen. Een toename in de concentratie van een polyethyleneimine-primelaag leidt tot verhoogde colloïdale stabiliteit van microcapsules met meer doorlaatbare schalen, terwijl het elimineren van de primelaag leidt tot aggregatie van capsules met minder doorlaatbare schilmembraan.

De GFPa1-expressiekinetica tijdens ThyRS-activering onthulde hogere GFPa1-