Aanpassing van gastro-intestinale organoïden voor pathogene infectie en single cell sequencing onder bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) omstandigheden

Dit protocol stelt ons in staat om te begrijpen hoe individuele celtypen aanwezig zijn in de menselijke darmepitheelrespons op virale infectie. We presenteren hier drie onafhankelijke manieren om menselijke darmorganoïden te zaaien om aan te pakken hoe de infectieroute van invloed kan zijn op hoe de cel reageert. We benadrukken hoe monsters kunnen worden voorbereid op single cell RNA-sequencing, rekening houdend met de bioveiligheidsvoorschriften die moeten worden nageleefd bij het werken met categorie 3-pathogenen.

Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere pathogenen en organoïde culturen. De belangrijkste overweging is om ervoor te zorgen dat uw organoïde modellen volledig gedifferentieerd zijn met de gekozen zaaimethode en virale infectie kunnen ondersteunen. Voordat u de geïnfecteerde organoïden oogst, verwijdert u de eencellige gelparels van min 80 graden Celsius en verwarmt u ze tot kamertemperatuur.

Breng bovendien het RT-reagens, het reductiemiddel B en rt-enzym C in evenwicht tot kamertemperatuur en resuspend de sjabloonschakelaar oligo zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Om vervolgens 3D-organoïden te verzamelen die zijn geïnfecteerd met de BSL-3-ziekteverwekker, verwijdert u de celkweekplaat uit de incubator en plaatst u deze in de celkweekkap. Gebruik vervolgens een P1000-pipet, verwijder de differentiatiemedia uit elke put van de 24-putplaat, voeg 500 microliter ijskoude PBS toe aan elke put en incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.

Om vervolgens de extracellulaire matrixoplossing volledig te verstoren, pipetteer je 10 keer op en neer om de PBS, extracellulaire matrix en organoïden opnieuw te schorsen, breng je de geresuspendeerde organoïden over in een conische buis van 15 milliliter en plaats je de buizen op ijs. Verzamel elke infectietoestand in afzonderlijke conische buisjes van 15 milliliter. Maak na het wisselen van handschoenen de buitenkant van de buis schoon en verwijder de buis uit de celkweekkap.

Draai de monsters gedurende vijf minuten. Verplaats de buis terug in de celkweekkap en verwijder de PBS, zodat resuspensie van de pellet van de organoïde vanaf de bodem van de buis wordt vermeden. Resuspend de pellet vervolgens in één milliliter dissociatie-enzym.

vervang vervolgens de handschoenen, maak de buis schoon en incubeer de monsters bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Beweeg tijdens de incubatie de buis elke 10 minuten terug in de celkweekkap en resuspend de organoïden door op en neer te pipetteren. Om te bepalen of de organoïden in afzonderlijke cellen zijn gedissocieerd, plaatst u 10 microliter van de organoïde-suspensie in een plastic wegwerpceltellerschuif met behulp van een P10-pipet en sluit u vervolgens de monsteringangspoort af met doorzichtige tape.

Nadat u handschoenen hebt verwisseld, reinigt u de buitenkant van de celteller en bevestigt u met een Brightfield-microscoop dat er een enkele celsuspensie is gemaakt. Na bevestiging van eencellige suspensie stopt u de vertering door één milliliter DMEM F12-media met 10% FBS toe te voegen en pipetteer 10 keer op en neer. Vervang vervolgens de handschoenen, maak de buis schoon en draai het monster.

Verwijder na het centrifugeren voorzichtig de media die het dissociatie-enzym bevatten en zorg ervoor dat de celkorrel aan de onderkant niet wordt verstoord. Resuspend vervolgens de afzonderlijke cellen in een minimaal volume PBS met 0,1% BSA. Nadat u de celsuspensie door een filter in een FACS-buis hebt gebracht om grote klonten te verwijderen, plaatst u de buis op ijs.

Om vervolgens het aantal cellen per microliter te bepalen, voegt u 10 microliter van de celsuspensie toe aan een plastic wegwerpceltelkamer. Sluit vervolgens de monsterinvoerpoort af met doorzichtige tape voordat u het monster uit de celkweekkap verwijdert. Verander handschoenen, maak de celtelkamer schoon en tel vervolgens het aantal cellen met een Brightfield-microscoop.

Bereid vervolgens in de celkweekkap een hoofdmix van RT-reagens, sjabloonschakelaar oligo, reductiemiddel B en RT-enzym C in een buis van 1,5 milliliter volgens de instructies van de fabrikant, afhankelijk van het aantal monsters in het experiment. Voor elk monster wordt 33,4 microliter mastermengsel in een PCR-buis geplaatst en voegt u vervolgens de cellen en het water toe aan het mastermengsel op basis van het doelcelnummer. Nadat u de handschoenen hebt verwisseld, plaatst u de eencellige controller in de celkweekkap en bereidt u de chip voor.

Voeg vervolgens de eencellige chip toe aan de chiphouder en vul de ongebruikte rijstroken met 50% glycerol. Voeg de hoofdmix, kralen en partitioneringsolie toe aan de rijstroken met monsters volgens de instructies van de fabrikant en bedek de chip met een pakking. Nadat u de chip in de controller hebt geladen, start u het programma.

Na voltooiing van het programma, verwijder de chip en de pakking, vervolgens met behulp van een meerkanaals pipet, breng 100 microliter van de emulsies over om PCR-buizen schoon te maken. Zorg ervoor dat elke emulsie een uniforme witte kleur heeft die aangeeft dat er een volledige emulsie heeft plaatsgevonden. Na het wisselen van handschoenen en het reinigen van de buizen, brengt u de PCR-buizen over naar een PCR-machine en start u het programma.

Aan het einde van de PCR-run worden de meeste omhulde virussen geïnactiveerd. De representatieve Brightfield-beelden op dag één, drie, vijf en zeven postsplitsende organoïden worden hier getoond. Gemiddeld worden de organoïden één keer per week gesplitst wanneer de centra donker worden.

Door de mediaomstandigheden te veranderen, Wnt-3a te verwijderen en R-spondin en noggin te verminderen, kan de cellulaire complexiteit in de menselijke darm worden nagebootst. Normaal gesproken vereist cellulaire differentiatie naar Paneth-cellen, bekercellen en enterocyten vier dagen differentiatiemedia. Analyse van single cell sequencing data van SARS-CoV-2 geïnfecteerde menselijke dikke darm en ileum-afgeleide organoïden toonde aan dat alleen een subpopulatie van menselijke darmepitheelcellen de infectie van SARS-CoV-2 na 12 en 24 uur ondersteunde.

Analyse van aangeboren immuunresponsen in SARS-CoV-2 geïnfecteerde colon-afgeleide organoïden toonde aan dat SARS-CoV-2 een pro-inflammatoire signaalcascade in geïnfecteerde cellen veroorzaakte, terwijl niet-geïnfecteerde omstandercellen een interferongemedieerde immuunrespons vertoonden. Bovendien toonde single cell RNA-sequencing aan dat geïnfecteerde cellen niet in staat waren om interferonen te detecteren als gevolg van virusgemedieerde blokkering van de route. De organoïden moeten goed gedifferentieerd en gezond zijn.

Dit kan worden gecontroleerd door het niveau van celdifferentiatiemarkers te bepalen door qPCR voorafgaand aan infectie. Als de cellen niet goed gedifferentieerd zijn, zullen ze geen virale infectie ondersteunen en leiden tot niet-informatieve resultaten. Met deze techniek kunnen we slijmvlies infecteren van zowel de luminale als de weefselzijde.

Dit is erg belangrijk omdat het ons in staat stelt om mechanismen te ontrafelen die door mucosale oppervlakken worden gebruikt om een vuile omgeving aan de ene kant en een steriele aan de andere kant te tolereren.