Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Dit protocol ontleedt de individuele mechanische eigenschappen van de celkern die het een mechanische graadmeter maken voor celpolarisatie, differentiatie en migratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mechanische eigenschappen kan meten en krachten kan uitoefenen op subcellulaire compartimenten zonder externe verstoring van het membraan of corticale cytoskelet. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om kralen in andere cellen van andere organismen te manipuleren om nucleaire mechanica in verschillende cellijnen of diermodellen te bestuderen.

Uitlijning van de directe krachtsensor is van cruciaal belang om al het licht op te vangen dat de optische vallen creëert en verlaat. Dit zorgt voor nauwkeurige lichtmomentmetingen in visco-elastisch medium van een cel. Begin de eencellige bereiding door de embryo's van het bolstadium vier uur na de bevruchting in een glazen schaal met E3-media te plaatsen met behulp van een plastic Pasteur-pipet.

Selecteer vervolgens de embryo's die positief zijn voor de kralen en breng het fluorescerende eiwit tot expressie in geval van mRNA-injectie. Gebruik een tang om de embryo's handmatig te decurioneren en breng ongeveer 10 tot 15 gedenudeerde embryo's over naar een reactiecontainer van 1,5 milliliter met behulp van een glazen Pasteur-pipet. Verwijder de E3-media uit de buis en voeg 500 microliter voorverwarmd kooldioxide-onafhankelijk weefselkweekmedium toe.

Schud de buis voorzichtig om bubbelvorming te voorkomen en zorg ervoor dat de inhoud van de buis troebel wordt als de cellen dissociëren zonder grote brokken zichtbaar voor het oog. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende drie minuten op 200 maal G. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en verzamel de pellet om door te gaan met celkleuring.

Om de kern te labelen, resuspendeert u de cellen door 500 microliter van de vers bereide DNA Hoechst kleurstofkleuringsoplossing aan de buis toe te voegen. Incubeer de bevlekte cellen gedurende zeven minuten in het donker. Centrifugeer vervolgens de cellen zoals eerder beschreven en resuspend de pellet in 50 microliter DMEM voor monsters in suspensie of 20 microliter DMEM voor cellen in opsluiting.

Voor de voorbereiding van de optische attributen of OT-kamer voor de experimenten met de cellen in suspensie, snijd een stuk dubbelzijdige scotch tape met een ongeveer 10 millimeter bij 10 millimeter vierkant gat in het midden. Verwijder een van de beschermende lagen van de tape en plaats de onbedekte kant van de tape in het midden van een glazen bodemschaal van nummer 1,5 H. Druk de tape voorzichtig aan om het hele oppervlak van de tape aan het glas te laten hechten, terwijl luchtbellen worden vermeden en de resterende beschermende laag van de tape wordt afgepeld.

Incubeer het oppervlak met 100 microliter Concanavalin A bij 0,5 milligram per milliliter gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens de druppel Concanavalin A en spoel het oppervlak af met DMEM. Voeg 30 microliter van de oplossing die de cellen bevat toe aan het holteoppervlak.

Sluit vervolgens de kamer heel voorzichtig af met een afdekglas van 22 bij 22 millimeter. Gebruik indien nodig een scalpel of tang. Ga vervolgens verder met het opstarten van een optisch pincet door de laser gedurende ten minste 30 minuten vóór het experiment op een aanzienlijk hoog vermogen in te schakelen om de stabiliteit van het uitgangsvermogen te optimaliseren.

Als u klaar bent, schakelt u de elektronicamodule van de optische micromanipulatie- en krachtmeeteenheden in. Voordat u de optische krachtsensor uitlijnt, plaatst u een druppel water op het 60X 1.2 waterdompelingsobjectief en plaatst u de kamer met de cellen op het podium. Focus op het onderste oppervlak van de kamer waar de celmonsters worden geplaatst.

Na het toevoegen van een druppel dompelolie bovenop de afdekglasplaat die het monster bedekt, laat u de opvanglens van de krachtsensoreenheid zakken totdat deze in contact komt met de oliedruppel. Volg de standaardprocedure voor de uitlijning van de optische krachtsensor naar het voorbeeldvlakbeeld op de hulpcamera die moet worden gebruikt om de OT's te positioneren en laat vervolgens de optische krachtsensor zakken totdat de veldstop geconjugeerd op het monstervlak verschijnt. Om te controleren op luchtbellen met de Bertrand-lens, observeert u het beeldpad door de hulpcamera.

Als er vuil of luchtbellen zichtbaar zijn, reinigt u de lens en kamer met stofvrij lensweefsel voordat u de procedure herhaalt zoals beschreven, en voeg meer dompelolie toe. Met behulp van de laterale schroeven die op de houder van de optische krachtsensor zijn geplaatst, centreert u de veldstop in het gezichtsveld. Voor de nauwkeurigheid opent u de veldstop bijna om het gezichtsveld te bezetten dat zichtbaar is op de hulpcamera.

Nadat u het monster in de microscoop hebt geplaatst en de optische krachtsensor hebt uitgelijnd, gebruikt u de roterende halvegolfplaat om het initiële valvermogen in te stellen op 200 milliwatt als de stijfheid van de kern of de onderzochte intercellulaire structuur niet bekend is. Als u klaar bent, gebruikt u de microscoopfase-softwarecontroller om te zoeken naar een cel met een of twee kralen via verzonden Brightfield-microscopie. Schrijf in het numerieke blad de verplaatsing en de tijd van elke volgende trajectstap.

U kunt ook tabel S1 uit het aanvullende materiaal laden. Voor een stress/ontspanningsexperiment programmeer je de trapeziumbelastingen die moeten worden toegepast. Activeer in de OT-software de optische vallen.

Voor het vangen van een microsfeer plaatst u de beeldvlakken iets boven de kraal met een microscooptrapsoftwarecontroller. Klik op de polystyreen microbead in het gekalibreerde beeldvenster van de hulpcamera. Succesvolle opsluiting van de kraal door de optische val zal de beweging van de kraal sterk verminderen.

Klik en sleep de kraal over het cytoplasma en plaats deze op een afstand van ongeveer twee micron van de nucleaire envelop. Zorg ervoor dat het traject zo is ingesteld dat de inkeping van de kraal loodrecht op het kernmembraan staat. Wanneer de installatie klaar is, gaat u naar de beeldvormingssoftware en klikt u op de acquisitieknop om de beeldacquisitie te starten.

Open het real-time force reading-venster, klik op gegevens en sla op in het real-time force reading-venster om op te slaan. Start trappositie en kracht meetgegevens. Start het eerder geladen traject door met de rechtermuisknop op de kraal te klikken en starttraject te selecteren.

Wacht tot het traject is voltooid en het systeem stabiliseert voordat u de registratie van de meetgegevens van de valkracht voltooit. Stop de beeldacquisitie en plot de resultaten in de nabewerkingssoftware. In de representatieve analyse wordt een geïsoleerde zebravisvoorloperstamcel weergegeven met een enkele microsfeer dicht bij de kern.

De verdeling van de polystyreenmicrosfeer vijf uur na injectie in een embryo werd gecontroleerd. Brightfield- en fluorescentiebeeld toont de kralen zijn verspreid over het embryoweefsel. Maximale projectie van de confocale fluorescerende Z-stack en een maximale projectie van een sub-stack in hetzelfde gebied bevestigt dat een groot deel van de diepe cellen één tot twee kralen bevatte.

24 uur na de bevruchting werden de kralen verdeeld over het hele lichaam van het embryo. De Brightfield-microfoto's van de suspensiecellen op de opgesloten cellen met een of twee geïnjecteerde kralen werden verkregen. Bovendien vergemakkelijkten meerdere fluorescerende labels het onderzoek van verschillende aspecten van de cellen, zoals internucleair membraan, plasmamembraan, DNA en transgene lijn.

Representatieve snapshots beschreven Hoechst-gelabelde kernen vijf seconden voor/tijdens en vijf seconden na inspringing met een optisch gevangen microsfeer. Intensiteitsprofielen langs het inkepingssegment voor drie verschillende frames en trajecten van de distale en proximale grenzen van de kern tijdens een inspringingsexperiment van gesuspendeerde en opgesloten cellen werden bestudeerd. Gevangen traject en kracht ervaren door de optisch gevangen microsfeer tijdens een herhaald nucleair inkepingsexperiment werden gemeten.

Kernmechanica in de cellen in suspensie en onder opsluiting bevestigde dat de opsluiting resulteerde in een uitbreiding van het geprojecteerde gebied en een onbeduidende verandering in nucleaire stijfheid. Als kralen worden geïnjecteerd in het embryo van het eencellige stadium, zullen ze zich hoogstwaarschijnlijk gelijkmatig verdelen in de latere stadia. Vergeet niet dat de kraal stabiel moet worden gevangen.

Als de kraal aan de optische val ontsnapt, herdefinieert u het traject of verhoogt u het laservermogen. Deze experimenten kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd op meerdere microbeads in één cel en worden uitgebreid tot actieve microrheology-metingen.