Name: Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen om neuroanatomische structuren te bestuderen. Dit protocol verbetert de reproduceerbaarheid van histologisch onderzoek in verschillende laboratoria.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De onderzoekers werden ondersteund door subsidies van de NIH (K01DK119471 aan CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 en R01DK120858 tot YX), USDA/CRIS (51000-064-01S tot YX) en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) tot LT.

C57BL/6J muizen van beide geslachten (8-16 weken oud) werden gebruikt in de huidige studie. De verzorging van alle dieren en alle procedures werden goedgekeurd door de institutional animal care and use committees van Baylor College of Medicine.
1. Perfusie
OPMERKING: Stappen 1.1 - 1.6 worden uitgevoerd in een zuurkast.
<ol><li>Anesthesie<ol>
<li>Giet 5 ml isofluraan (zie de tabel met materialen) op een papieren handdoek die op de bodem van een exsiccator is geplaatst. Breng de muis op de holte barrière in de exsiccator en wacht tot tekenen van ademhaling zijn verdwenen. OPMERKING: Zonder ademhaling heeft de muis nog steeds een hartslag voor een korte periode en zal deze worden doordrenkt voordat de hartslag verdwijnt.</li>
		<li>Voordat u verder gaat, moet u bevestigen dat er geen reflex is voor een teenknijpen.</li>
		<li>Bevestig de muis aan een schuimplaat door een pin door elke voet te rijden. Zorg ervoor dat de schuimplaat in een bakje wordt geplaatst om overloop van vloeistof op te vangen.</li>
	</ol></li>
	<li>Het hart blootleggen<ol>
<li>Maak een longitudinale oppervlakkige incisie langs de middellijn over de thorax en de buik en beweeg vervolgens de huid opzij om de spierwand van de thorax en de buik bloot te leggen. Maak vervolgens een incisie in de spierlaag om de lever en de darm bloot te leggen. Knip ten slotte de ribbenkast met een schaar om de thorax te openen en het hart en de longen bloot te leggen. Gebruik een hemostatische tang om de ribbenkast opzij te trekken om het werkgebied te verbreden.</li>
	</ol></li>
	<li>Inzameling van terminaal bloed (optioneel)<ol>
<li>Steek een spuit van 1 ml (zie de materiaaltabel) voorzichtig in het rechteratrium van het hart totdat de punt volledig is ingebed. Houd de spuit stabiel en trek langzaam bloed totdat het gewenste volume is bereikt. OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet voorbij het rechter atrium dringt; Verzameling van 300-400 μL bloed is haalbaar per volwassen muis. Additieven zoals een stolselversneller of antistollingsmiddel kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het doel van de bloedafname.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaatsing van de perfusiecanule<ol>
<li>Voor beginners, knip een klein gaatje (<1 mm) in de linker ventrikel van het hart met een schaar en steek een stompe canule (18 G naald voor jonge muizen en 21 G naald voor oudere muizen) door de linker ventrikel in de oplopende aorta. Als alternatief, voor ervaren experimentatoren, penetreer de linker hartkamer met een stompe canule direct en breng deze voorzichtig in de opstijgende aorta in.</li>
		<li>Plaats pinnen rond de combinatie van de canule en de gekoppelde slang op de schuimplaat om beweging tijdens de perfusie te voorkomen. U kunt ook een hemostatische tang gebruiken om de canule op zijn plaats te bevestigen. Ga verder met het snijden van het rechteratrium om de uitstroom van bloed uit de bloedsomloop mogelijk te maken. OPMERKING: De perfusiecanule en gekoppelde slang zijn aangesloten op de perfusiepomp.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusie met zoutoplossing<ol>
<li>Schakel de zoutoplossingdrukschakelaar in en perfuseer de muis transcardiaal met 40-60 ml zoutoplossing (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Observeer de uitstroom uit het rechteratrium en de kleur van de lever nauwkeurig. OPMERKING: Een geautomatiseerde perfusiepomp (zie de tabel met materialen) wordt gebruikt om het bloed binnen 1-2 minuten te spoelen. Omdat het drukbereik van de pomp 1-300 mmHg is, kan het toerental dienovereenkomstig worden aangepast. Als zoutoplossing uit de neus lekt en/of de long wordt opgeblazen, verlaag dan de druk en pas de canule aan. Zodra de uitstroom geen bloed meer bevat, worden de hersenen voldoende gespoeld met zoutoplossing. Ondertussen is de lever verstoken van bloed en wordt bruingrijs van kleur.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusie met formaline<ol>
<li>Schakel de zoutoplossingdrukschakelaar uit en schakel de formalinedrukschakelaar in om de muis te laten doordringen met 40 ml 10% neutraal gebufferd formaline (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, zie de tabel met materialen). Observeer de ledematen van het dier op bewijs van tremoren. OPMERKING: Staartbeweging kan ook worden waargenomen na infusie van 10% NBF. LET OP: Aangezien NBF gevaarlijk is, wordt voorgesteld dat onderzoekers tijdens de procedure persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. Geschikt gasmasker, gezichtsscherm) dragen.</li>
	</ol></li>
	<li>Hersenisolatie9<ol>
<li>Gebruik een schaar om de kop te verwijderen. Maak een middellijnincisie langs het omhulsel om de schedel bloot te leggen. Knip de huid en spieraanhechting af met een schaar.</li>
		<li>Maak een snede bij de orbitale richel en plaats vervolgens het scherpe uiteinde van de irisschaar in het foramen magnum. Schuif de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel en behoud de opwaartse druk om schade aan de hersenen te voorkomen. Verwijder de pariëtale/frontale botten en hersenvliezen voorzichtig. Verwijder ten slotte de hersenen voorzichtig van de geopende schedel.</li>
	</ol></li>
	<li>Post-fixatie<ol>
<li>Plaats de hersenen in een buis van 15 ml gevuld met 10 ml 5% NBF en 15% sucrose voor nachtelijke fixatie bij 4 °C. OPMERKING: Om 10 ml 5% NBF en 15% sucrose te bereiden, combineert u 5 ml 10% NBF en 5 ml 30% sucrose (w / v, opgelost in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), zie de tabel met materialen). Zorg ervoor dat het volume van de fixatiebuffer ten minste 10x groter is dan het monster zelf. In eerste instantie zullen de hersenen in de buffer zweven en na nachtelijke fixatie naar de bodem zinken.</li>
	</ol></li>
	<li>Dehydratie<ol>
<li>Breng het hersenmonster over in een buis van 15 ml gevuld met 10 ml 30% sucrose voor uitdroging bij 4 °C totdat het zinkt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cryosectie (coronale secties)
<ol><li>Voorbereiding<ol>
<li>Plaats droogijs bovenop de hoogteverstelplaat van een glijdend microtoom en wacht tot witte vorst zichtbaar is. Verdeel voorzichtig 5 ml 30% sucrose over de plaat om een laag van een vaste basis te vormen nadat de sucrose-oplossing volledig is ingevroren. Plaats alle hersenmonsters (maximaal 5 hersenmonsters in één batch) horizontaal in een lijn bovenop de sucrose en voeg vervolgens 0,5 ml 30% sucrose toe aan de onderkant van elk brein. OPMERKING: De hersenen zullen onmiddellijk aan de bevroren sucrosebasis blijven plakken en geleidelijk van onder naar boven bevriezen. Plaats extra sucrose rond het gemonteerde deel van de hersenen om een stevigere basis te vormen voor het snijden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doorsnede<ol>
<li>Na 5-10 minuten bevriezen, wanneer de hersenen hard en wit zijn geworden, trimt u de hersenen totdat de gewenste laag / regio is bereikt. OPMERKING: Pas de hoeveelheid droogijs op de plaat aan om de temperatuur te regelen. De temperatuur is te laag wanneer ijskristallen op het oppervlak van de hersenen verschijnen. De temperatuur is te hoog als de hersenen zacht worden en niet meer wit zijn.</li>
		<li>Schakel over van de trimmodus naar de feedmodus en sectie hersenweefsel tot 25 μm dikte. Bereid een bord met 48 putten gevuld met 1x PBS en markeer vijf putjes voor één muizenbrein. Gebruik een penseel om elk gedeelte van één muis te verzamelen en in één put te plaatsen. Verzamel het volgende gedeelte van dezelfde muis en plaats het in de 2e put.</li>
		<li>Herhaal 2.2.2 totdat de 5e put is bereikt, plaats secties 6-10 in de 1e-5e put enzovoort. Herhaal dezelfde procedure voor de rest van de hersenen tegelijkertijd. Herhaal dit totdat alle secties van één muis in anatomische volgorde in de 5 putjes zijn verzameld. OPMERKING: Na deze procedure worden de hersensecties van elke muis gealiquoteerd in 5 series, die kunnen worden gebruikt voor maximaal 5 verschillende histologische studies.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opslag<ol>
<li>Gebruik een verfkwast om de secties van elke put over te brengen naar een microbuis van 1,5 ml gevuld met cryoprotectieve buffer (20% glycerol, 30% ethyleenglycol en 50% PBS) en bewaar de monsters bij -20 °C. OPMERKING: Deze secties die in kleine buisjes (1,5 ml) zijn opgeslagen, kunnen fysieke ruimte in de vriezer besparen en de integriteit van de secties kan enkele maanden worden bewaard.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vrij zwevende WFA-kleuring en anti-AVP-immunostaining
<ol><li>Plaats een celzeef in een put van een 6-well celkweekplaat gevuld met PBS en gebruik een penseel om een reeks hersensecties over te brengen naar de celzeef. Spoel de secties in PBS door de celzeef over te brengen naar een andere goed gevuld met PBS. Spoel gedurende 6 x 10 minuten op een shaker voor secties die zijn bewaard in cryoprotectieve buffer en 3 x 10 min voor vers gesneden secties. OPMERKING: Alle wasprocedures worden uitgevoerd in een 6-well celkweekplaat met een celzeef in elke put (zie de tabel met materialen). Elke zeef bevat de hersensecties van belang van elke muis. Om reagentia te besparen, worden alle hieronder beschreven incubatieprocedures uitgevoerd in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Gebruik tussen de was- en incubatieprocedures een verfkwast om de hersensecties tussen elke celzeef en elke buis over te brengen. Voor het wassen met PBS is 12 ml voldoende voor elke put.</li>
	<li>Bereid 1 ml biotine-gelabelde WFA (1:1.000) oplossing in PBT (2,5 ml Triton X-100 opgelost in 1.000 ml PBS) buffer in 1,5 ml buis. Breng hersensecties over van de celzeef naar de buis en incubeer bij kamertemperatuur op een schommelplatform ~ 50 rpm 's nachts.</li>
	<li>Spoel de hersensecties met PBS gedurende 3 x 10 minuten zoals beschreven in 3.1.</li>
	<li>Bereid 1 ml streptavidin-Dylight 488 (1:500) oplossing in PBT in een buis van 1,5 ml. Breng hersensecties over in de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur op een schommelplatform bij ~ 50 tpm. OPMERKING: Bedek de plaat met folie om blootstelling aan licht door deze stap voorwaarts te voorkomen.</li>
	<li>Spoel de hersensecties met PBS gedurende 3 x 10 minuten. Incubeer de hersensecties in de blokkerende buffer (3% normaal ezelserum verdund in PBT) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: De keuze van het blokkerende serum wordt bepaald door de soort waaruit het secundaire antilichaam wordt gegenereerd. Als het secundaire antilichaam bijvoorbeeld van geiten is, moet normaal geitenserum worden gebruikt.</li>
	<li>Incubeer de hersensecties in primair antilichaam (konijn anti-AVP, 1:500) bij kamertemperatuur op een schommelplatform bij ~ 50 rpm 's nachts. OPMERKING: Bereid zowel primaire als secundaire antilichamen voor in de blokkerende buffer. De concentratie, de incubatieduur en de incubatietemperatuur moeten in pilotstudies worden geoptimaliseerd.</li>
	<li>Spoel de hersensecties met PBS gedurende 3 x 10 minuten. Incubeer de hersensecties in secundair antilichaam (Alexa Flour 594 ezel anti-konijn IgG (H + L), 1:500) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur op een schommelplatform bij ~ 50 tpm. Spoel de hersensecties met PBS gedurende 3 x 10 minuten.</li>
</ol>4. Montage
<ol><li>Vul twee petrischaaltjes (een diameter van 150 mm) met elk 100 ml 1x PBS. Breng alle hersensecties over van één zeef naar de eerste schotel en lijn de hersensecties in neuroanatomische volgorde uit van caudaal naar rostral. OPMERKING: Om te voorkomen dat secties van verschillende dieren worden gemengd, monteert u één reeks hersensecties van één dier tegelijk.</li>
	<li>Nadat alle hersensecties in de eerste schotel zijn uitgelijnd, dompelt u één schuif onder in de tweede schotel met één uiteinde enigszins gekanteld met een standaard (zie figuur 1 en figuur 2). Gebruik een fijne verfkwast om voorzichtig een hersengedeelte net onder de luchtbufferinterface op de gekantelde dia te plaatsen. Herhaal dezelfde procedure met een ander hersengedeelte en monteer het naast het eerste gedeelte.</li>
	<li>Gebruik een transferpipet om de buffer langzaam en voorzichtig te verwijderen om het niveau te verlagen totdat beide hersensecties zich volledig boven de luchtbufferinterface bevinden. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de verstoring van het bufferoppervlak minimaliseert, anders kunnen de hersensecties wegdrijven. Wanneer droog, zal deze rij hersensecties zich stevig aan de dia hechten. Pas indien nodig de secties op de dia voorzichtig aan om ervoor te zorgen dat er geen rimpels of plooien in het weefsel zijn wanneer de secties nog nat zijn.</li>
	<li>Herhaal dit proces totdat de onderkant van de dia is bereikt. Blijf herhalen totdat alle secties op de dia('s) zijn gemonteerd.</li>
</ol>5. Coverslipping
<ol><li>Nadat alle secties zijn gedroogd (1-24 uur bij kamertemperatuur), plaatst u 80-100 μL anti-fading montagemedium met DAPI (zie de tabel met materialen) op de dia en brengt u voorzichtig een glazen afdekplaat aan om de monsters te bedekken. OPMERKING: Breng de glazen afdekplaat voorzichtig en langzaam aan om bubbels te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de dia's in een microscoopglaasdoos (zie de materiaaltabel) en bewaar ze bij 4 °C. OPMERKING: Stel alle secties binnen 1-3 dagen voor om vervaging van fluorescentie en de ontwikkeling van autofluorescentie te voorkomen.</li>
</ol>6. Beeldvorming
<ol><li>Schakel de scanner en de computer in (zie Tabel met materialen). Plaats de dia's in de schuifhouder met de laadinrichting en plaats de houder in de scanner. OPMERKING: De scanner maakt het scannen van meerdere kanalen (bijv. 4′, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), groene en rode kanalen) tegelijkertijd mogelijk. De scanner scant dia's alleen met een vergroting van 20x en een traditionele fluorescerende microscoop (zie Tabel met materialen) kan worden gebruikt wanneer een hogere vergroting (bijv. 40x) nodig is.</li>
	<li>Open de software voor de scanner (zie de tabel met materialen). Kies de juiste opslaglocatie en het juiste scanprofiel.</li>
	<li>Start de voorbeeldscan door op de knop Voorbeeldscan starten te klikken. Na de voorbeeldscan opent u de weefseldetectiewizard en omcirkelt u de gebieden die van belang zijn voor beeldvorming.</li>
	<li>Klik op de knop Scan starten nadat u de regio's voor beeldvorming hebt gekozen. Wacht tot het apparaat klaar is met scannen. Controleer het resultaatbestand en exporteer de afbeeldingen. OPMERKING: Als het profiel niet geschikt is voor de dia, pas het dan aan door de belichtingstijd of lichtsterkte opnieuw scherp te stellen en te wijzigen om het profiel aan te passen aan de weefsels. Raadpleeg de instructies voor de scanner voor meer technische details (Tabel met materialen).</li>
</ol>

<ol><li>Must, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disease+burden+associated+with+overweight+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Disease burden associated with overweight and obesity.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).</li>
<li>Apovian, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+definition%2C+comorbidities%2C+causes%2C+and+burden%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Managed+Care%22%5BJournal%5D)">Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden.</a> The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).</li>
<li>Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+metabolic+syndrome%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Animal models of metabolic syndrome: a review.</a> Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of the metabolic syndrome.</a> Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of immunohistochemistry.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMepham%2C+BL+%22Lymphoproliferative+Diseases%22">Lymphoproliferative Diseases</a>. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPH2+in+the+dorsal+raphe+nuclei+regulates+energy+balance+in+a+sex-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner.</a> Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+vitamin+D+receptor+expression+in+the+brain+using+a+novel+VDR%28Cre%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).</li>
<li>Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+embedding%2C+and+sectioning+of+tissues%2C+embryos%2C+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).</li>
<li>Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological-based+stainings+using+free-floating+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Histological-based stainings using free-floating tissue sections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622(2020).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+potassium+current+in+AgRP%2FNPY+neurons+regulates+feeding+behavior+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism.</a> Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+serotonin+2C+receptors+in+dopamine+neurons+inhibits+binge-like+eating+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biololgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice.</a> Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dit protocol biedt een gevestigde methode voor neuroanatomische studies van de muizenhersenen, waaronder perfusie, weefselsectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming. Een paar belangrijke details die essentieel zijn voor consistente en betrouwbare resultaten moeten echter worden geoptimaliseerd.
De kwaliteit van de perfusie is van cruciaal belang voor een succesvolle kleuring. Kleuringsresultaten kunnen worden beïnvloed als er bloed in de hersenen achterblijft, aangezie...

De prevalentie van obesitas en bijbehorende comorbiditeiten heeft epidemische niveaus bereikt, wat een enorme sociaaleconomische last veroorzaakt1,2. Er zijn verschillende muismodellen ontwikkeld om de biologische processen die verantwoordelijk zijn voor obesitas beter te begrijpen3,4. Omdat centrale mechanismen belangrijk zijn voor de regulatie van energiehomeostase in deze diermodellen, zijn neuroanatomische studies van muizenhersenen een noodzakelijke techniek op dit gebied geworden. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van histologietechnieken in de hersenen variëren echter aanzienlijk tussen laboratoria en zelfs onderzoekers binnen hetzelfde laboratorium om verschillende redenen (bijv. Antilichamen, weefsels, behandelingen, soorten, onderzoeksdoelstellingen). Daarom is het noodzakelijk om een algemeen protocol vast te stellen voor histologische studies van de hersenen van muizen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming. Ondertussen kunnen beginners dit protocol snel leren, beheersen en aanpassen om aan hun individuele behoeften te voldoen.
Immunohistochemische kleuring is een gevestigde methode die op grote schaal is gebruikt om specifieke celtypen, mRNA's en eiwitten in verschillende weefsels (bijv. Hersenen en perifere weefsels) te visualiseren5,6. Meer specifiek kan een interessant antigeen worden gelabeld door een specifiek primair antilichaam en een overeenkomstig secundair antilichaam gekoppeld aan een enzym (bijvoorbeeld chromogene immunohistochemie) of een fluorescerende kleurstof (fluoresceïne-isothiocyanaat)6. Als voorbeeld van het nut van deze technieken werden β-endorfine [één peptide gecodeerd door pro-opiomelanocortine (POMC)] en c-fos (een marker van neuronale activiteit) gekleurd in de boogvormige kern. Deletie van tryptofaanhydroxylase 2 (een enzym dat integraal deel uitmaakt van de serotoninesynthese) in de dorsale raphe-kern bleek de c-fos-expressie in POMC-neuronen in de boogvormige kern7 te verminderen. Daarnaast werd de verdeling van vitamine D-receptor mRNA in het muizenbrein in kaart gebracht via in situ hybridisatie (RNAscope)8. Dit artikel presenteert een betrouwbare en efficiënte methode met een stapsgewijze workflow voor vrij zwevende immunostaining, met als doel de kwaliteit en reproduceerbaarheid van histologische studies van het muizenbrein te verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Alexa Flour 594 ezel anti-konijn IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;30% Sucrose</td><td>VWR</td><td>470302</td><td>30 g Sucrose opgelost in 100 mL PBS</td></tr><tr><td>&nbsp;Neutraal gebufferd Formaldehyde</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td>10%, 25 &deg;C, pH 6,8-7,2</td></tr><tr><td>1 mL Sub-Q Syringe</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>48 Well Cell Cultuur Plate</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Cell Cultuur Plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Antifading montage media met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaveerbare plastic desiccator</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>AVP antilichaam</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>H-065-07</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Cryoprotector buffer</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>Niet van toepassing</td><td>20% glycerol, 30% ethyleenglycol en 50% PBS</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Covetrus</td><td>11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC310FX microscoop</td><td>Leica</td><td>Niet van toepassing</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop foliedozen (50-plaats)</td><td>VWR</td><td>Niet van toepassing</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>Niet van toepassing</td><td>2,5 mL van Triton X-100 opgelost in 1000 mL PBS</td></tr><tr><td>Perfusie twee geautomatiseerde Perfusie System</td><td>Leica</td><td>39471005</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline (PBS) 20x</td><td>VWR</td><td>VWRVE703-1L</td><td>25 &deg;C, pH 7,3-7,5, 1x samenstelling: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Fosfaat buffer</td></tr><tr><td>Slideing Microtome Microm HM450</td><td>ThermoFisher</td><td>Microm HM450</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>RICCA Chemical</td><td>7220-32</td><td>0,9%, 25 &deg;C, pH 7,4</td></tr><tr><td>Streptavidine Proteïne, DyLight 488</td><td>ThermoFisher</td><td>#21832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>089k01921</td><td></td></tr><tr><td>WFA antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1516</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Z1 Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Niet van toepassing</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.1 software</td><td></td><td></td><td>scanner software</td></tr></tbody></table>

vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemische kleuring van muizenhersenen is een routinetechniek die vaak wordt gebruikt in de neurowetenschappen om centrale mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de regulatie van het energiemetabolisme en andere neurobiologische processen. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de histologische resultaten van de hersenen kan echter variëren tussen laboratoria. Voor elk kleuringsexperiment is het noodzakelijk om de belangrijkste procedures te optimaliseren op basis van verschillen in soorten, weefsels, gerichte eiwitten en de werkomstandigheden van de reagentia. Dit artikel demonstreert een betrouwbare workflow in detail, inclusief intra-aortaperfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselmontage en beeldvorming, die gemakkelijk kan worden gevolgd door onderzoekers op dit gebied.
Ook wordt besproken hoe deze procedures kunnen worden aangepast om aan de individuele behoeften van onderzoekers te voldoen. Om de betrouwbaarheid en efficiëntie van dit protocol te illustreren, werden perineuronale netten gekleurd met biotine-gelabelde Wisteria florbunda agglutinin (WFA) en arginine vasopressine (AVP) met een anti-AVP-antilichaam in de muizenhersenen. Ten slotte zijn de kritieke details voor de hele procedure behandeld en de voordelen van dit protocol ten opzichte van die van andere protocollen. Alles bij elkaar presenteert dit artikel een geoptimaliseerd protocol voor vrij zwevende immunostaining van hersenweefsel van muizen. Het volgen van dit protocol maakt dit proces gemakkelijker voor zowel junior als senior wetenschappers om de kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van immunostainingstudies te verbeteren.

Het stroomschema van dit protocol wordt kort geïllustreerd in figuur 1. De cryosectieprocedure van dit laboratorium is aangetoond in figuur 2A, waarbij 5 hersenmonsters tegelijkertijd werden gesneden. De montage van hersensecties is weergegeven in figuur 2B en een volledig gemonteerde dia met hersensecties is geïllustreerd in figuur 2C. In figuur 3, representatieve fluoresc...

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Immuno-histochemische kleuring van muizenhersenen is een veelgebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de histologische resultaten van de hersenen kunnen echter variëren tussen verschillende onderzoekers en laboratoria. We presenteren een gevestigde methodologie voor histologische studies van muizenhersenen waarvan is bewezen dat ze reproduceerbaar, betrouwbaar en efficiënt zijn.Helpen om de procedure aan te tonen zal Dr. Chunmei Wang zijn, een assistent-professor uit mijn laboratorium Na het bevestigen van succesvolle anesthesie bij een acht tot 16 weken oude C57 zwarte / 6J-muis, bevestig de muis op een schuimplaat en maak een longitudinale oppervlakkige incisie langs de middellijn over de thorax en buik, en beweeg vervolgens de huid opzij om de spierwand van de thorax en buik bloot te leggen. Maak vervolgens een incisie in de spierlaag om de lever en de darm bloot te leggen. Knip vervolgens met een schaar de ribbenkast om de thorax te openen en het hart en de longen bloot te leggen.Trek met behulp van een hemostatische tang de ribbenkast opzij om het werkgebied te verbreden. Volgend. om een perfusiecanule te plaatsen, direct de linker hartkamer binnendringen met een stompe canule en deze voorzichtig in de opgaande aorta inbrengen. Plaats pinnen rond de combinatie van de canule en de gekoppelde slang op de schuimplaat om de canule tijdens de perfusie op zijn plaats te bevestigen en snijd het rechteratrium door om de uitstroom van bloed uit de bloedsomloop mogelijk te maken.Voor perfusie met zoutoplossing schakelt u de zoutoplossingdrukschakelaar in en perfundeert u de muis transcardiaal met 40 tot 60 milliliter zoutoplossing. Observeer de uitstroom uit het rechteratrium en de kleur van de lever nauwkeurig. Schakel vervolgens, om te perfuseren met formaline, de zoutoplossingdrukschakelaar uit en schakel de formalinedrukschakelaar in om de muis te laten doordringen met 40 milliliter 10% neutraal gebufferde formaline.Observeer de ledematen van het dier op bewijs van tremoren. Gebruik voor hersenisolatie een schaar om het hoofd te verwijderen en maak een middellijnincisie langs het omhulsel om de schedel bloot te leggen en snijd vervolgens de huid en spieraanhechting af. Maak vervolgens een snede op de orbitale richel en plaats het scherpe uiteinde van de irisschaar in het foramen magnum.Schuif de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel en behoud de opwaartse druk om schade aan de hersenen te voorkomen. Verwijder vervolgens voorzichtig de pariëtale en frontale botten en hersenvliezen voordat u de hersenen uit de open schedel verwijdert. Leg droogijs op de hoogteverstelplaat van een glijdende microtoom en wacht tot witte vorst zichtbaar is en verdeel vervolgens voorzichtig vijf milliliter 30% sucrose over de plaat om een solide basislaag te vormen nadat de sucrose is bevroren.Plaats vervolgens alle hersenmonsters horizontaal in een lijn bovenop de sucrosebasis met 500 microliter 30% sucrose. Na vijf tot 10 minuten bevriezen, wanneer de hersenen hard en wit zijn geworden, trimt u de hersenen totdat de gewenste laag of regio is bereikt, schakelt u vervolgens over van de trimmodus naar de voedingsmodus en sectie hersenweefsel om 25-micrometer dikke secties te genereren. Bereid vervolgens een plaat met 48 putten gevuld met PBS en markeer vijf putten voor één muizenbrein.Gebruik een penseel, verzamel een sectie en plaats deze in één put, verzamel vervolgens het volgende gedeelte van dezelfde muis en plaats het in de tweede put. Herhaal de procedure totdat de vijfde put is bereikt door secties zes tot 10 in de eerste tot vijfde put te plaatsen, enzovoort. Plaats een celzeef in een put van een celkweekplaat met zes putten gevuld met PBS en breng met behulp van een penseel een reeks hersensecties over in de celzeef.Spoel deze secties in PBS door de celzeef over te brengen naar een andere goed gevulde met PBS op de shaker. Breng vervolgens de hersensecties van de celzeef over in een buis van 1,5 milliliter met één milliliter WFA met biotinelabel en incubeer 's nachts op een schommelplatform bij 50 RPM. Spoel de volgende dag de hersensecties met PBS zoals eerder aangetoond, breng de secties vervolgens over in een buis met één milliliter streptavidin-daglicht 488-oplossing en incubeer gedurende twee uur op een schommelplatform.Nadat de hersensecties opnieuw met PBS zijn gespoeld, incubeer je ze gedurende twee uur in de blokkerende buffer, gevolgd door incubatie in primaire antilichamen 's nachts op een schommelplatform. De volgende dag, na PBS-spoelingen, incubeer de secties in secundair antilichaam gedurende twee uur. Vul twee petrischalen met 100 milliliter PBS en breng alle hersensecties van één zeef over in de eerste schaal.Lijn de hersensecties uit in neuroanatomische volgorde van caudaal naar rostral. Dompel vervolgens een schuif onder in de tweede schotel met één uiteinde iets gekanteld met een standaard en plaats met een fijne verfkwast voorzichtig een hersengedeelte net onder de luchtbufferinterface op de gekantelde schuif. Verwijder vervolgens met behulp van een transferpipet langzaam en voorzichtig de buffer om het niveau te verlagen totdat het hersengedeelte zich volledig boven de luchtbufferinterface bevindt.Blijf dit proces herhalen totdat de onderkant van de dia is bereikt en alle secties op de dia zijn gemonteerd. Voor het maken van een beeld, schakelt u de scanner en de computer in, plaatst u de dia's in de diahouder met het laadapparaat en plaatst u de houder in de scanner. Open de software voor de scanner en kies de juiste opslaglocatie en het juiste scanprofiel.Start de voorbeeldscan door op de knop Voorbeeldscan starten te klikken. Open na de scan de weefseldetectiewizard en omcirkel de gebieden die van belang zijn voor beeldvorming. Nadat u de regio's voor beeldvorming hebt gekozen, klikt u op de knop Scan starten en wacht u tot het apparaat klaar is met scannen.Controleer het resultaatbestand en exporteer de afbeeldingen. Hier zijn representatieve fluorescentie immuno-histochemische beelden van coronale muis hersensecties op Bregma-negatieve 0,82 millimeter, met de verdeling van blauweregen floribunda agglutinine, arginine vasopressine en DAPI. Wisteria floribunda agglutinine signalen worden waargenomen in het perifornische gebied van de voorste hypothalamus en reticulaire kern, terwijl arginine vasopressine signalen worden waargenomen in de paraventriculaire kern.Wanneer u dit protocol voor de eerste keer probeert, raden we u aan het uit te voeren onder toezicht van een ervaren onderzoeker. Het protocol zal helpen bij het genereren van optimale en consistente histologische resultaten tussen verschillende onderzoekers en laboratoria, en zal dienen als een referentie voor beginners die deze techniek leren.

free-floating-immunostaining-of-mouse-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Grootschalige immunodetectie van target eiwitten in het hele primaat hersenen is mogelijk door het gebruik van nieuwe weefsel inbedden en snijden methoden gecombineerd met het gebruik van creatieve apparatuur voor batch kleuring van meerdere vrij zwevende delen op een gegeven moment.

Batch Immunokleuring Grootschalige eiwitdetectie in de Whole Brain Monkey

This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Source: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the detection of mRNA within cholinergic axons in fixed mouse hippocampal slices using fluorescent in situ hybridization and antibody staining. Fluorescence microscopy reveals the spatial localization of probe-tagged mRNAs and choline acetyltransferase in cholinergic neurons.

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

Dit protocol op inleidend niveau beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn om immunohistochemische kleuring van knaagdierhersenen te voltooien, gebruikmakend van markeringen voor microglia en neuronale elementen als voorbeeld.

Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Convectie-verbeterde levering (CED) is een methode die een effectieve levering van Therapeutics in de hersenen mogelijk maakt door directe perfusie van grote weefsel volumes. De procedure vereist het gebruik van katheters en een geoptimaliseerde injectieprocedure. Dit protocol beschrijft een methodologie voor CED van een antilichaam in een muis hersenen.

Levering van antilichamen in de Muriene hersenen via convectie-verbeterde levering

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.

Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Leer een betrouwbare methode voor vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen om neuroanatomische structuren te bestuderen. Dit protocol verbetert de reproduceerbaarheid van histologisch onderzoek in verschillende laboratoria.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Meer video's verkennen