Name: Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Leer selectieve ribosoomprofilering voor wereldwijde identificatie van co-translatiele interactienetwerken in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode onthult essentiële processen voor eiwitvouwing en functioneel proteoomonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen alle lableden bedanken voor de vruchtbare discussies en Muhammad Makhzumy voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door ISF (Israeli Science Foundation) subsidie 2106/20.

<ol><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+reveals+the+cotranslational+chaperone+action+of+trigger+factor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo.</a> Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+as+a+tool+for+studying+the+interaction+of+chaperones+and+targeting+factors+with+nascent+polypeptide+chains+and+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).</li>
<li>Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+to+study+interactions+of+translating+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Knorr, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-NatA+architecture+reveals+that+rRNA+expansion+segments+coordinate+N-terminal+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).</li>
<li>Matsuo, Y., Inada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+collision+sensor+Hel2+functions+as+preventive+quality+control+in+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway.</a> Cell Reports. 34 (12), (2021).</li>
<li>Döring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Ssb-Nascent+chain+interactions+reveals+principles+of+Hsp70-assisted+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+signal-independent+SRP+preloading+during+membrane+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting.</a> Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolbox+for+PCR-based+tagging+of+yeast+genes%3A+New+fluorescent+proteins%2C+more+markers+and+promoter+substitution+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes.</a> Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).</li>
<li>Levi, O., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Gene+Engineering+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae.</a> Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
<li>Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf</a> (2019).</li>
<li>Kanagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+and+artifacts+in+multitemplate+polymerase+chain+reactions+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR).</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), (2021).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Joazeiro, C. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ribosome-associated+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).</li>
<li>Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+translation+in+budding+yeast+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Hier beschrijft het protocol de Selective Ribosome Profiling-benadering voor het vastleggen van co-translationele interacties in bijna codonresolutie. Naarmate het ribosoom stijgt als een hub voor het coördineren van de ontluikende ketenopkomst in het overvolle cytoplasma, is dit een cruciale methode om de verschillende co-translationele interacties te identificeren en te karakteriseren die nodig zijn om een functioneel proteoom te garanderen, evenals voor het bestuderen van verschillende ziekten. Tot op heden is SeRP de...

Selective Ribosome Profiling (SeRP) is tot op heden de enige methode die co-translationele interacties, in vivo, op een directe maniervastlegt en karakteriseert 1,2,3,4,5,6. SeRP maakt globale profilering van interacties van elke factor mogelijk met het vertalen van ribosomen in bijna codonresolutie 2,7.
De methode is gebaseerd op het flashvriezen van groeiende cellen en het behoud van actieve translatie. Cellysaten worden vervolgens behandeld met RNase I om al het mRNA in de cel te verteren, behalve ribosoom-beschermde mRNA-fragmenten die "ribosoomvoetafdrukken" worden genoemd. Het monster wordt vervolgens in twee delen gesplitst; een deel wordt direct gebruikt voor de isolatie van alle cellulaire ribosomale voetafdrukken, die alle lopende vertaling in de cel vertegenwoordigen. Het tweede deel wordt gebruikt voor de affiniteitszuivering van de specifieke subset van ribosomen geassocieerd met een factor van belang, bijvoorbeeld: het modificeren van enzymen, translocatiefactoren, vouw chaperonnes en complex-assemblage interacties. De affiniteitsgezuiverde ribosomale voetafdrukken worden gezamenlijk het interactoom genoemd. Vervolgens worden de ribosoombeveiligde mRNA's geëxtraheerd en gebruikt voor het genereren van cDNA-bibliotheken, gevolgd door diepe sequencing.
Vergelijkende analyse van de totale translatoom- en interactoommonsters maakt het mogelijk om alle orfs te identificeren die verband houden met de factor van belang, evenals karakterisering van elk orf-interactieprofiel. Dit profiel rapporteert de precieze betrokkenheids- en beëindigingssequenties waaruit men de gedecodeerde codons en de respectieve residuen van de opkomende polypeptideketen kan afleiden, evenals op de ribosoomsnelheidsvariaties tijdens de interactie 7,8. Figuur 1 geeft het protocol weer als een schema.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2.jpg"> Figuur 1: Een overzicht van het SeRP-protocol. Dit protocol kan in zijn geheel binnen 7-10 dagen worden uitgevoerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide</td><td>IDT</td><td>custom order</td><td>RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>VWR</td><td>20821</td><td></td></tr><tr><td>Acid phenol&ndash;chloroform</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Antibody: mouse monclonal anti-HA</td><td>Merck</td><td>11583816001</td><td>12CA5</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>ATP*</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td><td>211820</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tryptone</td><td>BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>Bacto yeast extract</td><td>BD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin hydrochloride</td><td>Roth</td><td>2937.2</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase II ssDNA Ligase*</td><td>Epicentre</td><td>CL9025K</td><td>100 U/μL</td></tr><tr><td>Colloidal Coomassie staining solution</td><td>Roth</td><td>4829</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche Diagnostics</td><td>29384100</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Biological Industries</td><td>A0879</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated and sterile filtered water*</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose anhydrous</td><td>Merck</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate</td><td>Roth</td><td>K028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1313</td><td></td></tr><tr><td>DNA loading dye*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0631</td><td>6&times;</td></tr><tr><td>DNase I, recombinant</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>RNAse free</td></tr><tr><td>dNTP solution set*</td><td>NEB</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA*</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388.260.</td><td></td></tr><tr><td>Glycine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67419-1ML-F</td><td>1 M</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td>15 mg/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td></td></tr><tr><td>HF Phusion polymerase*</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>HK from S. cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6380-1.5KU</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>AppliChem</td><td>A1305</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Roth</td><td>CN08</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Roth</td><td>T832.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roth</td><td>CN33.4</td><td></td></tr><tr><td>Linker L(rt)</td><td>IDT</td><td>custom order</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;2H2O</td><td>Roth</td><td>T879.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl*</td><td>Invitrogen</td><td>AM97606</td><td>5 M</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;H2O</td><td>Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>17090601</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 substitute</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Roth</td><td>2936.2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride</td><td>Roth</td><td>6367</td><td></td></tr><tr><td>Precast gels</td><td>Bio-Rad</td><td>5671034</td><td>10% and 12%</td></tr><tr><td>RNase I</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SDS, 20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Sodium acetate*</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td>3 M, pH 5.5</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Merck</td><td>S8032-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Roth</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide*</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>1 N</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase Inhibitor</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transciptase*</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold*</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucleotide kinase*</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligase 2*</td><td>NEB</td><td>M0242L</td><td></td></tr><tr><td>TBE polyacrylamide gel*</td><td>Novex</td><td>EC6215BOX</td><td>8%</td></tr><tr><td>TBE&ndash;urea polyacrylamide gel*</td><td>Novex</td><td>EC68752BOX</td><td>10%</td></tr><tr><td>TBE&ndash;urea polyacrylamide gel*</td><td>Novex</td><td>EC6885BOX</td><td>15%</td></tr><tr><td>TBE&ndash;urea sample buffer*</td><td>Novex</td><td>LC6876</td><td>2&times;</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9851</td><td>1 M, pH 7.0</td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>1 M, pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure 10&times; TBE buffer*</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>* - voor bibliotheekvoorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gasket and spring clamp, 90 mm,</td><td>Millipore</td><td>&nbsp;XX1009020</td><td></td></tr><tr><td>ground joint flask 1 L,</td><td>Millipore</td><td>XX1504705</td><td></td></tr></tbody></table>

wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

In de afgelopen jaren is het duidelijk geworden dat ribosomen niet alleen ons mRNA decoderen, maar ook de opkomst van de polypeptideketen in de drukke cellulaire omgeving begeleiden. Ribosomen bieden het platform voor ruimtelijk en kinetisch gecontroleerde binding van membraan-targeting factoren, het modificeren van enzymen en het vouwen van chaperonnes. Zelfs de assemblage in oligomere complexen van hoge orde, evenals eiwit-eiwitnetwerkvormingsstappen, werden onlangs ontdekt om te worden gecoördineerd met synthese.
Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode die is ontwikkeld om co-translationele interacties in vivo vast te leggen. We zullen de verschillende affiniteitszuiveringsstappen beschrijven die nodig zijn voor het vastleggen van ribosoom-ontluikende ketencomplexen samen met co-translationele interactoren, evenals de mRNA-extractie, grootte-uitsluiting, reverse transcriptie, deep-sequencing en big-data-analysestappen, die nodig zijn om co-translationele interacties in bijna-codonresolutie te ontcijferen.

Zoals geïllustreerd in het stroomschema van dit protocol (figuur 1), werden cellen gekweekt tot logfase en vervolgens snel verzameld door filtratie en gelyseerd door cryogene slijping. Het lysaat werd vervolgens in tweeën gedeeld: een voor totale ribosoom-beschermde mRNA-voetafdrukken en de andere voor geselecteerde ribosoom-beschermde mRNA-voetafdrukken, waarop we affiniteitszuivering uitvoerden om de gelabelde eiwit-ribosoom-ontluikende ketencomplexen naar beneden te halen. We zorgden voor...

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen gericht op vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we selectieve ribosoomprofilering, een methode voor in vivo directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccaromyces cerevisiae. Selectieve ribosoomprofilering is tot nu toe de enige methode die co-translationele interacties in vivo op een directe manier vastlegt en karakteriseert.Selectieve ribosoomprofilering maakt globale profilering van alle factoren en interacties mogelijk met het vertalen van ribosomen in bijna-codonresolutie. Begin met het verzamelen van de geconstrueerde gistcellen die de gewenste gelabelde eiwitten bevatten. Voer cellyse uit met cryogene maling in een mengmolen tweemaal gedurende twee minuten op 30 Hertz.Centrifugeer gedurende twee minuten op 30.000 keer G bij vier graden Celsius om het lysaat te verwijderen en verzamel het supernatant. Breng 200 microliter van het supernatant over in een microcentrifugebuis voor totale RNA-analyse en 700 microliter in een microcentrifugebuis voor immunozuivering. Verwerk het eerder gescheiden totale RNA-monster met behulp van 10 eenheden RNase I gedurende 25 minuten bij vier graden Celsius op een roterend mengrek met 30 rotaties per minuut.Bereid de sucrosekussen master mix zoals beschreven in het tekstmanuscript. Laad het monster vervolgens op 400 microliter van het sucrosekussen en centrifugeer gedurende 90 minuten op 245.000 keer G en op vier graden Celsius. Verwijder het supernatant snel met een vacuümpomp en leg pellets met 150 microliter lysisbuffer.Zet het monster vast met paraffinewikkel en resuspendeer de pellets door gedurende een uur te schudden bij vier graden Celsius met 300 rotaties per minuut. Was 100 tot 400 microliter van de affiniteitsbindingsmatrix per monster driemaal met één milliliter lysisbuffer door de affiniteitsmatrix in de lysisbuffer te resuspenderen. Draai vervolgens met 30 rotaties per minuut met een roterend mengrek op vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Neerslaan door centrifugatie. Gooi de bovenste vloeistof weg en herhaal dit proces drie keer. Voeg affiniteitsbindingsmatrix toe aan het eerder gescheiden immunozuiveringsmonster en verteer het met RNase I.Roteer gedurende 25 minuten met 30 rotaties per minuut en vier graden Celsius met een roterend mengrek om het eiwit aan de affiniteitsmatrix te binden.Bereid de wasbuffermastermix voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Was de affiniteitsbindingsmatrix met één milliliter wasbuffer gedurende ongeveer één minuut, draaiend in het mengrek. Stort vervolgens neer door centrifugeren op 3000 maal G gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius en gooi de bovenste vloeistof weg.Herhaal dit drie keer. Was nog twee keer in één milliliter wasbuffer, telkens gedurende vijf minuten, draaiend in het mengrek. Opnieuw neerslaan door centrifugeren.Gebruik 50 microliter kralen voor eiwitelutie met dezelfde hoeveelheid 2X monsterbuffer. Centrifugeer om de kralen te pelleteren en gooi de bovenste vloeistof weg. Elute met 700 microliter 10-millimol Tris.Vries vervolgens in vloeibare stikstof. Verwijder het monster uit vloeibare stikstof en bewaar bij min 80 graden Celsius om te worden gebruikt voor volgende RNA-extractie. Beoordeel het succes van de affiniteitszuiveringsstap door Western blot of Coomassie-kleuring met aliquots van elke stap met behulp van mock IP op een niet-gelabelde, wild-type stam als controle voor niet-specifieke binding aan de affiniteitsmatrix.Western blot resultaten na affiniteitszuivering toonden het succes van de gelabelde eiwitexpressie aan. Isolatie van ribosoombeschermde voetafdrukken werd gevalideerd met behulp van de resultaten van de bioanalyzer. Terwijl het genereren van een cDNA-bibliotheek voor diepe sequencing en big data-analyse, leidt under-cycling tot een lage opbrengst.Echter, met de dNTPs nog steeds aanwezig, de reactie gaat verder, het genereren van langere PCR artefacten met chimere sequenties als gevolg van PCR-producten die zichzelf primen. De gegenereerde bibliotheek werd verder gevalideerd door zeer gevoelige DNA-elektroforese voor exacte grootteverdeling en kwantificering. De sequentiebibliotheek werd bijgesneden voor adapters en barcodes en de resulterende reads werden verdeeld in verschillende groepen coderingssequenties, introns en intergene sequenties.Ribosoomprofielen die co-translationele interacties van Vma2p analyseren met ribosoom-geassocieerde chaperonne Ssb1p, Pfk2p en Fas1p worden hier weergegeven met het experimentele schema van elke affiniteitszuivering. Er was ribosoombezetting langs het open leeskader van totale translatomen in vergelijking met Ssb1, Pfk2p en Fas1p interactomes. Gemiddelde verrijking van Ssb1p, Pfk2p en Fas1p op elke ribosoompositie langs het open leesframe wordt hier weergegeven.Deze methode maakt identificatie en karakterisering van de verschillende co-translationele interacties mogelijk, waardoor een functioneel proteoom wordt gegarandeerd, evenals de studie van verschillende ziekten. Tot op heden is selectieve ribosoomprofilering de enige methode die deze interacties op een directe manier in vivo kan vastleggen en karakteriseren.

global-identification-co-translational-interaction-networks-selective

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

Dit protocol illustreert wezenlijke modificaties van polyribosome fractionering om de translatome in vivo CZS monsters te bestuderen. Het maakt het mogelijk globale beoordeling van vertaling en transcriptie regulatie door de isolatie en vergelijking van de totale RNA gebonden RNA fracties ribosoom.

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Het vertalen van ribosomen decodeert drie nucleotiden per codon in peptiden. Hun beweging langs mRNA, vastgelegd door ribosoomprofilering, produceert de voetafdrukken die karakteristieke triplet periodiciteit vertonen. Dit protocol beschrijft hoe RiboCode te gebruiken om deze prominente functie te ontcijferen uit ribosoomprofileringsgegevens om actief vertaalde open leesframes op het niveau van het hele transcriptoom te identificeren.

De novo Identificatie van actief vertaalde open leesframes met ribosoomprofileringsgegevens

Leer selectieve ribosoomprofilering voor wereldwijde identificatie van co-translatiele interactienetwerken in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode onthult essentiële processen voor eiwitvouwing en functioneel proteoomonderzoek.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Meer video's verkennen