Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen gericht op vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we selectieve ribosoomprofilering, een methode voor in vivo directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccaromyces cerevisiae. Selectieve ribosoomprofilering is tot nu toe de enige methode die co-translationele interacties in vivo op een directe manier vastlegt en karakteriseert.

Selectieve ribosoomprofilering maakt globale profilering van alle factoren en interacties mogelijk met het vertalen van ribosomen in bijna-codonresolutie. Begin met het verzamelen van de geconstrueerde gistcellen die de gewenste gelabelde eiwitten bevatten. Voer cellyse uit met cryogene maling in een mengmolen tweemaal gedurende twee minuten op 30 Hertz.

Centrifugeer gedurende twee minuten op 30.000 keer G bij vier graden Celsius om het lysaat te verwijderen en verzamel het supernatant. Breng 200 microliter van het supernatant over in een microcentrifugebuis voor totale RNA-analyse en 700 microliter in een microcentrifugebuis voor immunozuivering. Verwerk het eerder gescheiden totale RNA-monster met behulp van 10 eenheden RNase I gedurende 25 minuten bij vier graden Celsius op een roterend mengrek met 30 rotaties per minuut.

Bereid de sucrosekussen master mix zoals beschreven in het tekstmanuscript. Laad het monster vervolgens op 400 microliter van het sucrosekussen en centrifugeer gedurende 90 minuten op 245.000 keer G en op vier graden Celsius. Verwijder het supernatant snel met een vacuümpomp en leg pellets met 150 microliter lysisbuffer.

Zet het monster vast met paraffinewikkel en resuspendeer de pellets door gedurende een uur te schudden bij vier graden Celsius met 300 rotaties per minuut. Was 100 tot 400 microliter van de affiniteitsbindingsmatrix per monster driemaal met één milliliter lysisbuffer door de affiniteitsmatrix in de lysisbuffer te resuspenderen. Draai vervolgens met 30 rotaties per minuut met een roterend mengrek op vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Neerslaan door centrifugatie. Gooi de bovenste vloeistof weg en herhaal dit proces drie keer. Voeg affiniteitsbindingsmatrix toe aan het eerder gescheiden immunozuiveringsmonster en verteer het met RNase I.Roteer gedurende 25 minuten met 30 rotaties per minuut en vier graden Celsius met een roterend mengrek om het eiwit aan de affiniteitsmatrix te binden.

Bereid de wasbuffermastermix voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Was de affiniteitsbindingsmatrix met één milliliter wasbuffer gedurende ongeveer één minuut, draaiend in het mengrek. Stort vervolgens neer door centrifugeren op 3000 maal G gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius en gooi de bovenste vloeistof weg.

Herhaal dit drie keer. Was nog twee keer in één milliliter wasbuffer, telkens gedurende vijf minuten, draaiend in het mengrek. Opnieuw neerslaan door centrifugeren.

Gebruik 50 microliter kralen voor eiwitelutie met dezelfde hoeveelheid 2X monsterbuffer. Centrifugeer om de kralen te pelleteren en gooi de bovenste vloeistof weg. Elute met 700 microliter 10-millimol Tris.

Vries vervolgens in vloeibare stikstof. Verwijder het monster uit vloeibare stikstof en bewaar bij min 80 graden Celsius om te worden gebruikt voor volgende RNA-extractie. Beoordeel het succes van de affiniteitszuiveringsstap door Western blot of Coomassie-kleuring met aliquots van elke stap met behulp van mock IP op een niet-gelabelde, wild-type stam als controle voor niet-specifieke binding aan de affiniteitsmatrix.

Western blot resultaten na affiniteitszuivering toonden het succes van de gelabelde eiwitexpressie aan. Isolatie van ribosoombeschermde voetafdrukken werd gevalideerd met behulp van de resultaten van de bioanalyzer. Terwijl het genereren van een cDNA-bibliotheek voor diepe sequencing en big data-analyse, leidt under-cycling tot een lage opbrengst.

Echter, met de dNTPs nog steeds aanwezig, de reactie gaat verder, het genereren van langere PCR artefacten met chimere sequenties als gevolg van PCR-producten die zichzelf primen. De gegenereerde bibliotheek werd verder gevalideerd door zeer gevoelige DNA-elektroforese voor exacte grootteverdeling en kwantificering. De sequentiebibliotheek werd bijgesneden voor adapters en barcodes en de resulterende reads werden verdeeld in verschillende groepen coderingssequenties, introns en intergene sequenties.

Ribosoomprofielen die co-translationele interacties van Vma2p analyseren met ribosoom-geassocieerde chaperonne Ssb1p, Pfk2p en Fas1p worden hier weergegeven met het experimentele schema van elke affiniteitszuivering. Er was ribosoombezetting langs het open leeskader van totale translatomen in vergelijking met Ssb1, Pfk2p en Fas1p interactomes. Gemiddelde verrijking van Ssb1p, Pfk2p en Fas1p op elke ribosoompositie langs het open leesframe wordt hier weergegeven.

Deze methode maakt identificatie en karakterisering van de verschillende co-translationele interacties mogelijk, waardoor een functioneel proteoom wordt gegarandeerd, evenals de studie van verschillende ziekten. Tot op heden is selectieve ribosoomprofilering de enige methode die deze interacties op een directe manier in vivo kan vastleggen en karakteriseren.